陸青, 梁婷, , 王偉偉, 汪德州, 吳嫻, , 王小燕*, 唐益苗*

（1.長江大學農(nóng)學院, 湖北荊州 434025；2.北京市農(nóng)林科學院雜交小麥研究所, 北京 100097）

熱激蛋白（heat shock protein, HSPs）是具有高度保守序列的應激蛋白, 廣泛存在于各種生物體內(nèi)[1]。該蛋白有助于維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài), 在信號轉(zhuǎn)導、蛋白質(zhì)運輸和降解及生長發(fā)育過程中發(fā)揮關鍵作用[2]。熱激蛋白又稱為熱休克蛋白, 其表達由熱激轉(zhuǎn)錄因子[3]（heat shock factor,HSF）控制。熱激轉(zhuǎn)錄因子通過結合熱激蛋白啟動子區(qū)域的熱休克因子（heat shock elements,HSEs）調(diào)控熱激蛋白的表達[4]。根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小 可 將HSP分 為5大 類：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和sHSP[5]。據(jù)報道, HSP90是植物正常生長發(fā)育的必需蛋白, 它不僅受非生物和生物脅迫誘導表達, 還參與植物的免疫應答過程[6]。在ATP供能的驅(qū)動下, HSPs可促進新合成蛋白質(zhì)的折疊、功能成熟和穩(wěn)定, 以及應激后變性蛋白質(zhì)的復性, 故也稱之為分子伴侶。HSP90家族蛋白是熱激蛋白家族的重要成員, 包含2個典型的結構域：N端的ATP酶結構域和C端 的HSP90結 構 域[7]。

非生物脅迫通常會導致蛋白質(zhì)功能障礙。維持蛋白質(zhì)的功能構象和防止非天然蛋白質(zhì)的聚集對細胞在壓力下的生存尤為重要[1]。HSPs在許多正常細胞代謝過程中負責蛋白質(zhì)折疊、組裝、易位和降解, 穩(wěn)定蛋白質(zhì)和膜, 并在應激條件下協(xié)助蛋白質(zhì)折疊。HSPs通過重建正常的蛋白質(zhì)構象來維系細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定, 在保護植物免受脅迫損傷方面發(fā)揮關鍵作用。擬南芥HSP90家族有7個成員, 對過表達AtHSP90.2、AtHSP90.5和AtHSP90.7的擬南芥植株進行干旱和鹽脅迫, 其苗期鮮重明顯低于野生型, 表明過表達AtHSP90.5和AtHSP90.7基因在干旱和鹽脅迫下抑制了擬南芥的生長, 且AtHSP90.5和AtHSP90.7較AtHSP90.2更加敏感；在高水平Ca2+處理下, 過表達植株的鮮重高于野生型, 表明轉(zhuǎn)基因幼苗對高濃度Ca2+的耐受性高于野生型[8]。擬南芥的Athsp90.1和Athsp90.3敲除突變體與RNAi株系中HSP90的缺失會導致YODA通路中MPK3和MPK6磷酸化減少, 無法正常激活調(diào)節(jié)下游靶點, 氣孔數(shù)目減少,從而降低植株對高溫的耐受性[9]。水稻HSP90家族有9個成員, 在高溫和滲透脅迫下HSP90基因（OsHSP50.2）在各個組織中均被誘導表達, 過表達HSP90水稻的水分損失減少, 轉(zhuǎn)基因植株對干旱和滲透脅迫的耐受性增強；與干旱脅迫下的野生型植株相比, 過表達植株的電解質(zhì)滲漏和丙二醛（malonaldehyde, MDA）含量顯著降低, 葉綠素下降[10]。過表達OsHSP90-4基因的轉(zhuǎn)基因植株在苗期受高溫脅迫時的失水率明顯低于野生型, 同時ABA會對轉(zhuǎn)基因植株造成明顯的抑制[11]。玉米ZmHSP90-1在高溫和高鹽脅迫下被顯著誘導[12]。由此表明, HSP90基因在非生物脅迫響應中具有重要作用。

在氣候溫暖的小麥主產(chǎn)區(qū), 小麥等溫帶谷類作物在生殖生長階段經(jīng)常會遭遇干旱與高溫脅迫, 從而嚴重影響碳同化和淀粉合成, 導致谷物產(chǎn)量和品質(zhì)降低。擬南芥、水稻和玉米中HSP90-1基因在植株受到非生物脅迫后表達量發(fā)生顯著變化, 且轉(zhuǎn)基因植株對非生物脅迫的耐受性明顯提升。小麥中HSP90基因成員在不同程度上響應高溫脅迫, 大多數(shù)基因在轉(zhuǎn)錄水平和剪接水平均受到熱調(diào)控, 且剪接調(diào)控早于轉(zhuǎn)錄調(diào)控[13], 但TaHSP90-1功能尚未見報道。本研究篩選并克隆獲得小麥HSP90基因成員中響應干旱和熱脅迫的關鍵基因TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B和TaHSP90-1-D, 分析其在小麥不同耐受性品種的表達變化, 為探討TaHSP90-1在小麥非生物脅迫響應過程中的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理方法

供試材料包括旱熱敏感小麥品種小白麥, 旱敏感小麥豫麥13和豫麥47, 耐旱小麥品種皖麥33、寧冬10和川麥44, 耐熱小麥品種矮抗58和魯麥15, 普通小麥京冬18、京411、BS366和BS1453, 均由北京市農(nóng)林科學院雜交小麥研究所分子育種實驗室提供。挑選飽滿的小麥種子, 使用5%的NaClO消毒15 min, 無菌水沖洗3遍確保無NaClO殘留；在發(fā)苗盤上鋪1層濾紙, 倒入適量無菌水浸濕濾紙, 將消毒處理后的種子置于濾紙上, 無菌水浸泡48 h；待種子發(fā)芽后, 將種子移種至水培盒中, 每3 d更換1次水培液。將水培盒放入恒溫培養(yǎng)箱中, 設置培養(yǎng)溫度25℃/18℃（光照16 h/黑暗8 h）。待所有品種的小麥幼苗長至2葉1心時, 將其分為兩組：一組進行模擬干旱脅迫處理, 將小白麥和皖麥33幼苗的水培液替換為40%的PEG 6 000溶液, 其余條件不變；另一組進行高溫脅迫處理, 將小白麥和矮抗58幼苗置于40℃條件下, 其余條件不變, 3次重復。2組處理分別在處理0、2、4、6、8、12 h后取整株苗液氮冷凍, 置于-80℃冰箱用于RNA的提取。

1.2 RNA的提取以及cDNA的合成

用Trizol法提取小麥不同組織及幼苗總RNA[14], 測定OD260/280值；然后使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量, 檢測合格后保存于-80℃冰箱備用。用Vazyme的HIScriptⅢ1stStrand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, -20℃保存。

1.3 小麥TaHSP90-1基因的克隆

用Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)網(wǎng) 站 的BLAST（basic local alignment search tool）根據(jù)擬南芥熱激蛋白基因AtHSP90-1（At5g52640）編碼序列為探針搜索小麥同源基因, 得到TraesCS2A02G033700.1、TraesCS2D02G0332 00.1和TraesCS2B02G047400.1共3條 序 列, 用Primer Premier 5（www.bioprocessonline.com）設計引物, 引物序列詳見表1。

以小白麥、皖麥33、矮抗58、寧冬10、川麥44、豫麥13、豫麥47、魯麥15、京冬18、京411、BS366和BS1453[15]的DNA提取為模板進行擴增。PCR反應體系為20μL, 包括2×Taq Plus Master MixⅡ（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）10μL, ddH2O 7.4μL, F/R引 物 各0.8μL, 模 板DNA 1μL（100 ng·L-1）。PCR程序：95℃3 min；95℃15 s, 62℃20 s, 72℃130 s, 30次循環(huán)；72℃5 min, 4℃保存。使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測, 切膠后使用FastPure GelDNA Extraction Mini Kit試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）回收純化分子量為2 000 bp左右的PCR產(chǎn)物。室溫條件下使用TA/Blunt-Zero Cloning Kit試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）連接到測序載體上, 反應時間5 min；然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α。將100μL菌液均勻涂抹到具有氨芐青霉素（100 ng·L-1）抗性的LB固體平板上, 倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)12 h, 然后挑取單克隆進行菌液PCR驗證, 酶切鑒定后送北京擎科生物科技有限公司進行測序。

1.4 TaHSP90-1系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建

以TaHSP90-1蛋白序列為誘餌序列, 在Ensembl Plants（http://plants.ensembl.org/index.html）網(wǎng)站進行BioMart搜索, 獲得烏拉爾圖小麥（Triticum urartu）、大麥（Hordeum vulgare）、二粒小麥（Triticum dicoccoide）、擬 南 芥（Arabidopsis thaliana）、水 稻（Oryza sativa）、番 茄（Solanum lycopersicum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）的同源序列, 然后利用Pfam（http://pfam.xfam.org/）驗證同源蛋白序列的保守結構域。運用ClustalW（http://www.ebi.ac.uk./clustalw/）以默認參數(shù)進行多序列比對分析, 使用DNAMAN輸出比對結果, 采用MEGA X（www.mega.com）軟 件 基 于neighborjoining法構建系統(tǒng)進化樹, 用泊松校正模型, bootstrap值設置為1 000。

1.5 TaHSP90-1基因的表達分析

根據(jù)TaHSP90-1基因cDNA序列使用軟件Primer Premier 5設計用于表達分析的引物（表1）, 由北京擎科生物科技有限公司合成。熒光實時定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)體系為20μL, 包 括2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10μL、上下游引物（10μmol·L-1）各0.4μL、cDNA模板1μL（100 ng·μL-1）、ddH2O補齊。反應程序為：95℃30 s；95℃10 s, 60℃30 s, 40次循環(huán)；之后增加熔解曲線環(huán)節(jié)（95℃15 s, 60℃60 s, 95℃15 s）。每次反應3次生物學重復, 使用2-△△CT法[16]計算數(shù)據(jù)。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primer name and sequence

2 結果與分析

2.1 TaHSP90-1基因的克隆及其編碼蛋白的結構

經(jīng)Blast比對分析,TaHSP90-1基因與OsHSP1（LOC_Os04g01740.1）同源性較高,因此分別命名為TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B和TaHSP90-1-D。進一步分析3個基因編碼的氨基酸序列（圖1）顯示, 3個基因均含有2個在ATP水解中起作用的HATPase_C結 構 域 和1個HSP90結 構 域, 證 明TaHSP90-1基因?qū)儆贖SP90家族。

圖1 TaHSP90-1同源蛋白多序列比對Fig.1 Multi sequence alignment of TaHSP90-1 homologous protein

以小白麥、皖麥33、矮抗58、寧冬10、川麥44、豫麥13、豫麥47、魯麥15、京冬18、京411、BS366和BS1453的DNA為模板進行PCR擴增, 結果（圖2A和B）表明, 12個小麥品種的擴增產(chǎn)物大小完全一致, 均為2 000 bp左右。將目的片段切膠回收送測序, 得到長度分別為2 318、2 236和2 230 bp的3個序列, 其開放閱讀框分別為2 121、2 136和2 130 bp, 編碼707、712和710個氨基酸。對不同小麥品種的TaHSP90-1以及啟動子序列比對, 發(fā)現(xiàn)皖麥33在TaHSP90-1-B基因第2個內(nèi)含子546 bp處的堿基為G（圖2C）, 矮抗58在TaHSP90-1-D啟動子區(qū)域5’到3’方向第1 447 bp處堿基為T（圖2D）。

圖2 小麥TaHSP90-1基因全長及啟動子序列擴增結果與分析Fig.2 Amplification results and analysis of the full-length sequence and promoter of wheat TaHSP90-1 gene

2.2 TaHSP90-1同源蛋白序列的比對及進化分析

將TaHSP90-1蛋白序列提交至Gramene（http://www.gramene.org/）進 行blast比 對, 發(fā) 現(xiàn)TaHSP90-1與二粒小麥（Triticum dicoccoide）、烏拉爾 圖 小 麥（Triticum urartu）、大 麥（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）的同源蛋白序列相似性分別為95%、93%、91%、90%、89%、78%和67%?；卩徑臃嫿ǖ南到y(tǒng)進化樹（圖3）表明, TaHSP90-1與二粒小麥的親緣關系最近, 而單子葉植物和雙子葉植物間具有較大差異。

圖3 小麥TaHSP90-1蛋白與其他植物的同源蛋白序列的系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of wheat TaHSP90-1 protein and other plant homologous protein sequences

2.3 TaHSP90-1基因的順式作用元件分析

通過小麥數(shù)據(jù)庫參考數(shù)據(jù)克隆獲得TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B、TaHSP90-1-D起始密碼子上 游2 000 bp序列, 提交Plant Care（http://bioinformatics.psb.ugent.be/）分析啟動子區(qū)順式作用元件, 結果（表2）發(fā)現(xiàn),3個基因均具有熱響應元件與干旱響應元件。在TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B、TaHSP90-1-D啟動子序列中分別含有1、0、2個干旱響應元件(MBS element), 其中,TaHSP90-1-A啟動子區(qū)域的MBS位于5’端210~215 bp處,序列為CAACTG；TaHSP90-1-D啟 動 子 區(qū) 域 的5’端215~220和578~583 bp各存在1個MBS, 序列均為CAACTG。TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B、TaHSP90-1-D啟動子區(qū)域分別含有5、3、6個熱響應元件（HSE element）, 序列為nGAAn/nTCCn, 但TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B、TaHSP90-1-D啟動子區(qū)域HSE的位置和序列各不相同, 其中TaHSP90-1-A啟動子區(qū)域的HSE位于5’端的273~283、619~629、650~660、1 074~1 083和1 929~1 942 bp處, 序 列 分 別 為ACATCCTCCG、AGATCCTCTAG、GAATCCTTGTG、TTTTTCCTTT、GGCATCCTGGG；TaHSP90-1-B啟動子區(qū)域的HSE位于5’端的404~417、1 610~1 622和1 829~1 841 bp處, 序 列分別為AGATTGGAACTCCC、CTCACGAATCGCA、CTCACGAATCGCA；TaHSP90-1-D啟動子區(qū)域的HSE位于5’端的156~168、206~218、853~866、1 046~1 057、1 446~1 458、1 948~1 962 bp處；序列分 別 為ACGAGAAAATGCA、ACAACTCCCCAGT、ACAAATCCATGAAC、TTTTGAACCGGT、ATGGTC CGTATGT、CAAGTAGAAGCTTCG。

表2 TaHSP90-1順式作用元件統(tǒng)計Table 2 Cis-acting element statistics of TaHSP90-1

2.4 TaHSP90-1基因的組織表達特異性分析

利用中國春小麥不同組織cDNA, 通過RTPCR技術分析苗期以及成熟期小麥不同組織中TaHSP90-1的表達量, 結果（圖4）表明,TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-D在各個組織中均有表達；TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B和TaHSP90-1-D均在葉中的表達量最高, 其次為莖和穎殼, 根、穗和種子中的表達量較低；TaHSP90-1-B在根和穎殼中不表達。

圖4 小麥TaHSP90-1在不同組織中的相對表達量Fig.4 Relative expression of TaHSP90-1 in different tissues of wheat

2.5 干旱脅迫下TaHSP90-1基因的表達分析

對12個小麥品種的TaHSP90-1序列比較發(fā)現(xiàn), 皖麥33TaHSP90-1-B第2個內(nèi)含子區(qū)域含有SNP位點（圖2C）。皖麥33為耐旱品種, 為進一步驗證皖麥33的耐旱性, 以皖麥33和小白麥為試驗材料, 培養(yǎng)至1葉1心時將水培液更換為40%PEG 6000進行模擬干旱脅迫。處理12 h后發(fā)現(xiàn), 小白麥的萎蔫程度較皖麥33嚴重, 而皖麥33雖有一定程度萎蔫但大部分植株莖稈直立, 說明苗期皖麥33較小白麥具有更強的耐旱性。

RT-PCR結果（圖5）顯示, 皖麥33受干旱脅迫后TaHSP90-1的表達量上調(diào),TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B和TaHSP90-1-D基因的表達量均在脅迫后4 h時達到最高, 隨后表達量迅速下降；小白麥TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B和TaHSP90-1-D基因的表達量基本無變化。由此表明, 不同小麥品種苗期TaHSP90-1基因的表達量與其耐旱性關系密切。

圖5 干旱脅迫下小麥TaHSP90-1在不同品種中的表達分析Fig.5 Expression analysis of wheat TaHSP90-1 in different varieties under drought stress

2.6 高溫脅迫下TaHSP90-1基因的表達分析

對小麥品種的TaHSP90-1序列比較, 發(fā)現(xiàn)矮抗58TaHSP90-1-D啟動子區(qū)域含有SNP位點（圖2D）。矮抗58為耐熱品種, 為進一步驗證矮抗58的耐熱性, 以矮抗58和小白麥為試驗材料, 培養(yǎng)至1葉1心后置于40℃環(huán)境進行高溫脅迫處理。處理12 h后, 發(fā)現(xiàn)部分小白麥地上部出現(xiàn)萎蔫、失水和莖稈倒伏, 而矮抗58雖出現(xiàn)萎蔫但較小白麥萎蔫程度更輕, 由此表明, 矮抗58具有比小白麥更強的耐熱性。

RT-PCR結 果（圖6）顯 示, 矮 抗58中TaHSP90-1-A和TaHSP90-1-D基因的表達量上調(diào), 且分別在脅迫2~4 h達到最高值, 隨后表達量迅速下降, 但TaHSP90-1-B基因的表達量變化較?。恍?白 麥 中TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B和TaHSP90-1-D基因的表達量也有所上調(diào), 但增幅遠 低 于 矮 抗58。由 此 表 明,TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B、TaHSP90-1-D基因受熱脅迫誘導表達, 小麥苗期TaHSP90-1基因的表達變化可能與熱脅迫相關。

圖6 熱脅迫下小麥TaHSP90-1在不同品種中的表達分析Fig.6 Expression analysis of wheat TaHSP90-1 in different varieties under heat stress

3 討論

HSP90蛋白廣泛存在于生物體內(nèi), 目前, 在擬南芥[17]、水稻[18]、小麥[19]、番茄[20]和谷子[21]等植物中均有報道。水稻中過表達HSP90植株不僅表現(xiàn)出對高溫脅迫的耐受性, 且其耐旱性也有一定程度的提升[22]。本研究從小麥中克隆得到TaHSP90-1的全長DNA序列, 生物信息學分析表明,TaHSP90-1基因編碼的氨基酸序列與水稻、擬南芥等植物HSP90氨基酸序列存在高度同源性, 且都含有2個保守結構域HATPase_C和HSP90, N端的ATPase結構域能夠結合并催化ATP, 此部位同時也是HSP90抑制劑的結合位點, ATPase結構域是保證HSP90蛋白發(fā)揮生物學活性的必須基團[23], 推測TaHSP90-1具有與擬南芥和水稻HSP90蛋白相似的功能。

HSP90可調(diào)節(jié)自身的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平, 研究表明, HSF和HSE的結合受HSP90的調(diào)節(jié), 當細胞內(nèi)HSP90濃度增高時, 以阻遏蛋白形式結合到HSF上, 阻止HSF與HSE的結合, 從而限制HSP90基因的轉(zhuǎn)錄；當HSP90濃度較低時, HSF與HSE正常結合, HSP90基因開始轉(zhuǎn)錄[24]。水稻OsHSP90同樣具有分子伴侶功能, 過表達植株在受到高溫脅迫時, OsHSP90蛋白量增加, 它們會向膜組分靠近, 并與膜蛋白互相作用, 延緩膜蛋白的變性及促進變性蛋白的復性或降解, 使植株表現(xiàn)出更強的抗逆性[22]。TaHSP90-1系統(tǒng)進化樹分析顯示, 單子葉植物和雙子葉植物被劃分為2大類, 推測該基因可能出現(xiàn)在單雙子葉植物分化之前[25]。

HSP90在植物氣孔的生長發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要作用。據(jù)報道, HSP90調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子基因SPCH和MUTE的表達, HSP90基因 缺 失將導致氣孔分化率降低, 因此, 在正常和熱應激條件下, HSP90通過調(diào)控這2種轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)氣孔[26]。TaHSP90-1高表達可以提高小麥苗期的耐旱性及耐熱性, 且TaHSP90-1主要在葉片中表達, 推測TaHSP90-1的表達會影響YODA通路上相關基因的表達, 調(diào)節(jié)氣孔減少水分的散失以應對干旱以及熱脅迫[27]。順式作用元件分析發(fā)現(xiàn), TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B和TaHSP90-1-D干旱響應元件均為MBS, 在啟動子區(qū)域的數(shù)量分別為1、0、2個。比較12個小麥品種的TaHSP90-1基因序列發(fā)現(xiàn), 僅皖麥33的第2個內(nèi)含子區(qū)域出現(xiàn)1個SNP位點；對皖麥33進行模擬干旱脅迫處理表明, 皖麥33中TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B和TaHSP90-1-D的表達量明顯高于旱敏感品種小白麥, 推測mRNA轉(zhuǎn)錄可能受內(nèi)含子影響；盡管TaHSP90-1-B的干旱響應元件個數(shù)為0, 但其表達量也較高, 因此, 推測TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B和TaHSP90-1-D基因可能對小麥耐旱性起正向調(diào)控。

TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B和TaHSP90-1-D啟動子區(qū)域的熱響應元件（HSE）數(shù)量分別為5、3、6個, 且HSE的堿基序列各不相同。熱響應元件的數(shù)量與受熱脅迫時基因的表達量成正比, 在熱敏感品種小白麥中, TaHSP90-1基因表達雖有上調(diào)趨勢, 但表達量遠低于耐熱品種矮抗58, 且在耐熱品種矮抗58受到熱脅迫時, TaHSP90-1-D基因的表達量在脅迫后2 h達到峰值, TaHSP90-1-A和TaHSP90-1-B在脅迫后4 h達到峰值, 表明TaHSP90-1-D較TaHSP90-1-A和TaHSP90-1-B具有更快的響應速度。研究發(fā)現(xiàn), HSF與HSE結合調(diào)控TaHSP90-1的表達, 且HSE數(shù)量越多TaHSP90-1基因轉(zhuǎn)錄越迅速、表達量越高[26]。矮抗58 TaHSP90-1-D啟動子區(qū)域特有的SNP可能影響基因表達, 推測高溫脅迫下TaHSP90-1-D的表達量與啟動子結構緊密相關。