郝變青, 馬利平, 趙永勝, 石文鑫, 王建雄, 景玉川

（1.山西農業(yè)大學山西功能農產品檢驗檢測中心, 太原 030031；2.山西農業(yè)大學玉米研究所, 山西忻州 034000）

馬鈴薯營養(yǎng)豐富, 具有低脂肪、高碳水化合物、高維生素、高鉀等特點, 有“地下蘋果”“第二面包”之美譽, 市場前景十分廣闊[1]。全世界大約有150多個國家種植馬鈴薯, 歐洲和亞洲是馬鈴薯生產和種植的主要區(qū)域, 種植面積在106hm2以上的國家有中國、俄羅斯、印度和烏克蘭, 占世界總種植面積的58%以上；總產量在2×107t以上的國家有中國、印度、俄羅斯、烏克蘭和美國, 占世界總產量的60%以上[2]。據(jù)國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù), 2012—2019年, 我國馬鈴薯種植面積穩(wěn)定在5.6×106hm2左右, 鮮薯年產量達9.5×107t[3]。

近年來, 隨著我國馬鈴薯主糧化的推進, 馬鈴薯的種植面積逐漸擴大。然而, 隨著雨水的增多, 馬鈴薯病害發(fā)生也日趨嚴重。晚疫病是影響馬鈴薯產量最大的病害, 在馬鈴薯生育期發(fā)生晚疫病后, 植株地上部分受到真菌侵染, 葉片受損或壞死, 影響光合作用, 導致塊莖無法膨大生長, 造成產量損失嚴重[4-5]。目前, 生產上防治馬鈴薯晚疫病主要是采用代森錳鋅、甲霜靈·錳鋅波爾多液、多菌靈、杜邦克露、嘧菌酯、百菌清、福美雙、水合霉素等化學藥劑[6-7], 且化學農藥的噴施次數(shù)和噴施量呈逐年增長趨勢。過量施用化學農藥不僅增加生產成本, 還嚴重威脅農產品質量安全和生態(tài)環(huán)境安全, 由此引發(fā)的環(huán)境污染和農產品質量安全等重大問題日益突出。目前, 在馬鈴薯晚疫病的防治上, 采用生物防治的研究較少[8]。生物防治具有低毒、綠色環(huán)保等優(yōu)點, 已成為目前的研究熱點。為了大力推進馬鈴薯病害綠色防控工作, 減少化學農藥施用量, 實現(xiàn)“雙減”目標, 本研究利用自主研發(fā)的蠟狀芽孢桿菌BC98-Ⅰ（Bacillus cereus）和枯草芽孢桿菌B96-Ⅱ（Bacillus subtilis）發(fā)酵液對馬鈴薯晚疫病進行生物防治研究。前期試驗表明, BC98-Ⅰ和B96-Ⅱ發(fā)酵液對多種蔬菜土傳病害具有明顯的防治效果, 且對植株有顯著的促生作用[9]。因此, 為探究廣譜促生B96-Ⅱ和BC98-Ⅰ發(fā)酵液對馬鈴薯晚疫病的防治效果, 開展室內及田間試驗, 研究其對馬鈴薯生物量的促生作用及其對晚疫病的防治效果, 同時測定發(fā)酵液對土壤酶活性的影響, 探索適宜馬鈴薯晚疫病綠色防控的新型藥劑, 以期為山西地區(qū)馬鈴薯晚疫病高效、綠色防控提供理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蠟狀芽孢桿菌BC98-Ⅰ（Bacillus cereus）發(fā)酵液（T1）和枯草芽孢桿菌B96-Ⅱ（Bacillus subtilis）發(fā)酵液（T2）均為本研究室自主培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌生長速率和抑制率測定 制備蠟狀芽孢桿菌T1和枯草芽孢桿菌T2發(fā)酵液[10], 其活菌含量均為1×1012cfu·mL-1, 分別取T1和T1+T2發(fā)酵液4 mL, 加入10 mL無菌水進行稀釋, 混勻, 再倒入體積為386 mL 45℃的PDA培養(yǎng)基中, 混勻, 制作10個平板, 每個平板20 mL, 制成芽孢桿菌發(fā)酵液100倍稀釋液平板, 稀釋后T1和T1+T2菌液含菌量均為1×1010cfu·mL-1。馬鈴薯晚疫病致病疫霉菌的培養(yǎng)參考畢朝位等[11]的RSA培養(yǎng)基培養(yǎng)方法, 以無菌水為空白對照；24 h后接入培養(yǎng)5 d、直徑為4 mm的晚疫病致病疫霉菌餅, 置于28℃溫箱培養(yǎng), 記錄菌落直徑。同時挑取菌絲進行顯微鏡觀察。

1.2.2 盆栽馬鈴薯的促生實驗 用無菌水將枯草芽孢桿菌T2發(fā)酵液和蠟狀芽孢桿菌T1、枯草芽孢桿菌T2發(fā)酵液的混合液分別稀釋100和300倍, 其含菌量分別為1×1010和3.33×109cfu·mL-1, 將其分別命名為T2100、T2300和T1+T2100、T1+T2300。將田間菜園土過直徑4 mm篩, 將土壤與果園有機肥（山西平陸縣金牛肥業(yè)有限公司）按0.8∶1（體積比）混勻。選取無病斑的馬鈴薯切薯, 品種為晉薯17號, 每個薯塊留1個芽眼, 將切好的薯塊放置于培養(yǎng)盆中, 每盆放3個薯塊, 覆蓋約2 cm厚的菌土, 噴少量水, 蓋上塑料膜以保濕。播種后20 d開始灌根施加芽孢桿菌發(fā)酵液, T2100、T2300和T1+T2100、T1+T2300處理組分別倒入10 mL稀釋液, 以無菌水組為對照（CK）, 每組設3個重復, 每個重復18盆。播種后記錄馬鈴薯出苗時間, 計算出苗率；出苗20 d后開始測量株高, 以后每隔6 d測量1次, 連續(xù)測量6次；最后1次測量完成后開始采收馬鈴薯, 并測定根鮮重、植株總鮮重和馬鈴薯產量。

1.2.3 芽孢桿菌發(fā)酵液處理對盆栽馬鈴薯晚疫病的防治作用 馬鈴薯種植同方法1.2.2, 在馬鈴薯出苗2周后開始采用葉片噴霧接種馬鈴薯晚疫病菌孢子液, 孢子含量2×106cell·mL-1, 每盆噴菌懸液20 mL, 噴霧后用塑料膜覆蓋保濕24 h, 以保證菌液更好地接種于植株上。在接種菌液7、14和42 d后觀測全部葉片, 以葉片為單位按下列分級標準記錄觀察馬鈴薯晚疫病的發(fā)病情況并計算防治效率[12]。

0級：無病斑；1級：病斑面積占整個葉面積5%以下；3級：病斑面積占整個葉面積6%~10%；5級：病斑面積占整個葉面積11%~20%；7級：病斑面積占整個葉面積21%~50%；9級：病斑面積占整個葉面積51%以上。

1.2.4 大田馬鈴薯的防病實驗 于2020年2—7月在晉中市榆次區(qū)東陽鎮(zhèn)（37°33′N、112°40′E, 海拔765.6 m）進行。選取1塊平地, 采用隨機區(qū)組排列, 劃設15個小區(qū), 每個小區(qū)面積16 m2（4 m×4 m）, 均設置5行, 每行18穴, 每穴放入1個馬鈴薯塊, 共90株。每處理3次重復。于播種后20 d開始灌根施用芽孢桿菌發(fā)酵液, T2100、T2300和T1+T2100、T1+T2300處理組每穴分別施用相應稀釋液10 mL, 以無菌水組為對照（CK）。在馬鈴薯出苗后第14、第42天記錄馬鈴薯晚疫病的發(fā)病情況, 并計算防治效率；在馬鈴薯收獲期測量植株鮮重和馬鈴薯產量。

1.2.5 大田馬鈴薯土壤酶活性測定 根據(jù)方法1.2.4劃分的小區(qū), 按照5點取樣法, 在馬鈴薯播種前及出苗后第7、第14和第42周分別采集0—20 cm土層的土壤樣品裝入樣品袋, 做好標記帶回實驗室用于土壤過氧化物酶、脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性的測定, 其中, 土壤過氧化物酶、脲酶采用試劑盒測定, 試劑盒來自南京建成生物工程研究所；土壤磷酸酶和蔗糖酶活性測定方法參照周禮愷[13]的方法進行。

1.2.6 馬鈴薯植株高度、植株鮮重、根鮮重和產量的測定 于馬鈴薯成熟期（最后一次測量完成時）對各處理的馬鈴薯植株進行分組（區(qū)）收獲, 將馬鈴薯植株的根部和地上部分剪開, 分別測量植株的高度、地上部植株鮮重和根鮮重；同時挖出全部馬鈴薯清除表面泥土后稱量各組（區(qū)）馬鈴薯的質量, 計算產量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2013軟件進行統(tǒng)計分析, 利用IBM SPSS 22軟件進行獨立樣本t檢驗, 采用Origin 9.0進行繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌發(fā)酵液對馬鈴薯晚疫病致病疫霉菌生長的影響

由圖1可知, 芽孢桿菌發(fā)酵液T2及T1+T2混合液均能顯著抑制馬鈴薯晚疫病致病疫霉菌的菌絲生長。顯微觀察發(fā)現(xiàn), 2種芽孢桿菌發(fā)酵液處理使致病疫霉菌菌絲短縮、畸形, 子囊孢子變形, 導致其細胞壁溶解甚至細胞破裂等。

圖1 不同處理下馬鈴薯晚疫病病原菌的形態(tài)Fig.1 Morphology of fermentation on Phytophthorainfestans under different treatments

由圖2可知, 馬鈴薯在接種晚疫病菌10 d后, 對照組（CK）病原菌已長滿整個平皿, 而T2100、T2300和T1+T2100、T1+T2300處理的病原菌才開始生長, 表明2種芽孢桿菌發(fā)酵液對馬鈴薯晚疫病菌具有明顯的抑制效果。由表1可知, 接種馬鈴薯晚疫病致病菌1周后, 對照已長滿平皿, 菌落直徑為8.52 cm；而T2100、T2300和T1+T2100、T1+T2300處理的菌落直徑分別為1.31、1.59和1.31、1.24 cm, 均顯著低于CK。接種4周后, T2100、T2300和T1+T2100、T1+T2300處理疫霉致病菌的菌落直徑分別為4.88、5.44和5.16、4.60 cm；生長抑制率分別為86.21%、84.48%和85.34、87.07%。由此可見, 2種芽孢桿菌發(fā)酵液均能顯著抑制馬鈴薯晚疫病致病菌的菌絲生長。

表1 不同處理下馬鈴薯晚疫病菌菌落的生長速率Table 1 Growth rate of Phytophthorainfestans under different treatments

圖2 不同處理對馬鈴薯晚疫病菌的抑制Fig.2 Inhibition of different treatments on Phytophthorainfestans

2.2 芽孢桿菌發(fā)酵液對盆栽馬鈴薯的促生作用

由表2可知, 與空白對照相比, 2種芽孢桿菌發(fā)酵液處理能顯著提高馬鈴薯出苗率（P＜0.05）。CK處理的出苗率僅74.15%, 而通過2種芽孢桿菌發(fā)酵液處理后, T2100、T2300、T1+T2100和T1+T2300處理的出苗率分別較對照提高19.96%、31.95%、10.94%和22.95%；且T2300處理顯著高于T2100, T1+T2300顯著高于T1+T2100。由此表明, 低水平的發(fā)酵液處理更有利于馬鈴薯出苗。

表2 不同處理下馬鈴薯的出苗率Table 2 Emergence rate of potato under different treatments

由表3可知, 芽孢桿菌發(fā)酵液處理的馬鈴薯株高均顯著高于CK。出苗后34 d, 株高表現(xiàn)為T2300＞T1+T2100＞T1+T2300＞T2100?？梢? 施加2種芽孢桿菌發(fā)酵液都能顯著提高馬鈴薯株高。

表3 不同處理下馬鈴薯的株高Table 3 Plant height of potato under different treatments

測定馬鈴薯的生物量結果（表4）表明, 芽孢桿菌發(fā)酵液顯著影響馬鈴薯的根鮮重、地上部鮮重、植株鮮重及單株產量。其中, T2300和T1+T2300處理的根鮮重顯著高于CK；T2100和T2300處理的地上部和整株鮮重顯著高于CK。所有芽孢桿菌發(fā)酵液處理的馬鈴薯單株產量均顯著高于CK, 平均增產34.67%。其中, T2300、T1+T2100和T1+T2300處理又顯著高于T2100處理。

表4 不同處理下馬鈴薯的生物量Table 4 Biomass of potato under different treatments

2.3 芽孢桿菌發(fā)酵液對盆栽馬鈴薯的防病作用

由表5可知, 使用芽孢桿菌發(fā)酵液后, 盆栽馬鈴薯在第1、第2、第6周的發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于CK。施用芽孢桿菌發(fā)酵液1周, 防治效率平均達73.98%；第2周的防治效率平均達83.31%；第6周的防治效率平均達76.62%。第1和第2周時, T2100和T1+T2100處理的防治效率顯著高于T2300和T1+T2300處理, 且第2周時, T2300處理又顯著高于T1+T2300處理；第6周時, T1+T2300處理的防治效果顯著低于其他發(fā)酵液處理。綜上所述, 發(fā)酵液稀釋100倍時的防治效率高于稀釋300倍的防治效率, 即提高芽孢桿菌發(fā)酵液的濃度在一定程度上能提高防治效率。

表5 不同處理下盆栽馬鈴薯晚疫病的發(fā)病率和病情指數(shù)Table 5 Incidence rate and disease index of potato late blight under different treatments in pot culture

2.4 芽孢桿菌發(fā)酵液對大田馬鈴薯的防病促生效果研究

由表6可知, 經(jīng)芽孢桿菌發(fā)酵液灌根處理2周后, 無菌水對照組有14株發(fā)??；T1+T2300處理僅1株發(fā)病, 防治效果達90.86%, 其余3組均為零發(fā)病, 防治效果100%。隨著時間延長, 灌根處理6周后, 芽孢桿菌發(fā)酵液處理組雖全部出現(xiàn)發(fā)病植株, 但發(fā)病率較CK顯著降低, 其中, T2100處理的防治效果最高, 為78.98%；T1+T2300處理的防治效果最低, 為68.47%。大田收獲后測定馬鈴薯植株的鮮重和產量, 結果（表6）表明, 芽孢桿菌發(fā)酵液處理的植株鮮重均顯著高于CK, 平均增長率為13.64%；且馬鈴薯產量也均顯著高于CK, 較CK平均增產15.84%。由此表明, 芽孢桿菌發(fā)酵液灌根處理對大田馬鈴薯也具有顯著的防病促生作用。

表6 不同處理下大田馬鈴薯晚疫病的發(fā)病率和病情指數(shù)Table 6 Incidence rate and disease index of potato late blight under different treatments in field culture

2.5 芽孢桿菌發(fā)酵液對大田馬鈴薯土壤酶活性的影響

由圖3可知, 施用芽孢桿菌發(fā)酵液顯著影響土壤中過氧化物酶、脲酶、磷酸酶和蔗糖酶活性。與CK相比, 施用芽孢桿菌發(fā)酵液1~2周后土壤中4種酶活性均顯著升高；而后酶活性呈現(xiàn)下降趨勢, 但均顯著高于CK。由此說明, 2種芽孢桿菌發(fā)酵液均能顯著提高土壤酶活性。施用芽孢桿菌發(fā)酵液1周后, T2100處理的過氧化物酶、脲酶、磷酸酶和蔗糖酶活性較CK分別提高28.06%、64.29%、18.32%和57.01%；T2300處理較CK分別提高24.82%、85.71%、25.13%和52.84%；T1+T2處理組也得到類似的結果。施用芽孢桿菌發(fā)酵液2周后, 4種酶的活性繼續(xù)提高, 處理組的過氧化物酶、脲酶、磷酸酶和蔗糖酶活性較CK分別平均提高134.15%、64.51%、36.67%和84.41%。施用芽孢桿菌發(fā)酵液6周后, 4種酶的活性均明顯降低, 處理組的過氧化物酶、脲酶、磷酸酶和蔗糖酶活性較CK分別平均提高108.45%、46.15%、17.91%和35.15%。綜上所述, 施用T1+T2混合發(fā)酵液與單獨施用T2發(fā)酵液效果類似, 且不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液也存在類似的效果, 均能顯著提升土壤酶活性；但土壤酶活性隨著時間的延長又會逐漸降低。

圖3 不同處理下土壤酶的活性Fig.3 Activity of soil enzyme under different treatments

3 討論

隨著我國土地流轉、農業(yè)集約化經(jīng)營和馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的實施, 馬鈴薯種植方式和病蟲害發(fā)生方式也將發(fā)生深刻變化。馬鈴薯成片種植面積越大, 越易造成病害的大范圍發(fā)生。然而, 在馬鈴薯實際生產中主要依靠化學農藥防治病蟲害, 不僅易使病原菌產生抗藥性, 還會造成環(huán)境污染, 危害人體健康。因此, 未來馬鈴薯病蟲害的防治方向應順應國家專業(yè)化統(tǒng)防統(tǒng)治與綠色防控相融合政策的發(fā)展趨勢, 加快推進生物農藥等綠色防控技術在馬鈴薯生產中的推廣應用, 變“末端治理”為“源頭防控”, 為馬鈴薯質量安全提供根本保障。

在馬鈴薯晚疫病的生物防治上, 徐雪亮等[14]報道枯草芽孢桿菌對江西馬鈴薯瘡痂病有很好的防治效果, 但對晚疫病防效不佳；黃保全等[15]研究表明枯草芽孢桿菌在陜西對馬鈴薯晚疫病有很好的防病效果；Lal等[16]研究發(fā)現(xiàn)印楝油可用于馬鈴薯有機栽培中晚疫病的防治；Alaoui等[17]研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌發(fā)酵液對馬鈴薯晚疫病菌有較好的防治作用。本研究采用自主研發(fā)的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液T2及蠟狀芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的混合發(fā)酵液T1+T2進行了從實驗室到田間的全過程研究, 通過平皿試驗發(fā)現(xiàn)2種芽孢桿菌發(fā)酵液均能顯著抑制馬鈴薯晚疫病菌菌絲的生長；通過盆栽試驗發(fā)現(xiàn), 2種芽孢桿菌發(fā)酵液不僅能顯著提高馬鈴薯出苗率, 還對植株具有顯著的促生作用, 較CK平均提高馬鈴薯單產34.67%, 同時處理組植株的發(fā)病率和病情指數(shù)顯著低于CK, 第1周的平均防治效率達73.98%, 第2周達83.31%, 第6周達76.62%；大田系統(tǒng)試驗表明, 2種芽孢桿菌發(fā)酵液第6周的防治效果最低為68.47%, 最高為78.98%, 且均能顯著提高馬鈴薯產量, 較CK平均增產15.84%, 另外, 2種芽孢桿菌發(fā)酵液還能顯著提高土壤中過氧化物酶、脲酶、磷酸酶和蔗糖酶的活性。土壤酶活性是微生物功能的一種表現(xiàn), 微生物根據(jù)其需求和底物的可用性來合成酶, 將有機大分子分解為可供植物吸收的單體, 從而影響土壤中營養(yǎng)物質的轉化。因此, 下一步應對芽孢桿菌發(fā)酵液作用下的土壤養(yǎng)分和土壤微生物菌群進行動態(tài)研究, 分析該芽孢桿菌發(fā)酵液對馬鈴薯促生作用及晚疫病防治的具體作用機制。