劉音頌， 韋海文， 王繼剛， 李博， 楊二龍*

(1.東北石油大學(xué)石油工程學(xué)院, 大慶 163318; 2. 東北石油大學(xué)三亞海洋油氣研究院, 三亞 572000; 3.廣東石油化工大學(xué)機電工程學(xué)院, 茂名 525000)

目前，中國主力油田多已進(jìn)入開采中后期，由于長期開發(fā)，采出液含水率高，面臨儲采失衡、產(chǎn)量逐年遞減等矛盾。即便實施三次采油仍有30%～40%的原油地質(zhì)儲量滯留在地下，其開采難度進(jìn)一步增大，因此如何經(jīng)濟有效地開采這部分剩余油，對老油田可持續(xù)發(fā)展非常重要。

微生物采油技術(shù)是通過利用微生物生長、繁殖及其代謝產(chǎn)物(包括生物表面活性劑、生物聚合物、生物酸、酶、溶劑和生物酶)來調(diào)動殘余油[1]。微生物驅(qū)油分為外源微生物驅(qū)油和內(nèi)源微生物驅(qū)油[2]。外源微生物采油主要通過室內(nèi)篩選出自然采油菌或采用基因工程學(xué)方法培育出工程采用菌，經(jīng)地面培養(yǎng)后注入油藏[3]，而內(nèi)源微生物驅(qū)油技術(shù)則是通過注入適宜的營養(yǎng)激活劑以激活油井中的功能微生物，通過內(nèi)源微生物自身的代謝活動來提高原油采收率。相對而言，內(nèi)源微生物采油技術(shù)具有更能適應(yīng)油藏環(huán)境、不需要菌種保藏和菌液生產(chǎn)、操作成本低等特點，在油田中具有更廣闊的應(yīng)用前景[2，5]。目前現(xiàn)場試驗中，孤島油田向一區(qū)館3區(qū)塊累計注入營養(yǎng)體系405 t，實現(xiàn)累計增油量1×104t[5]；勝利油田辛68區(qū)塊通過注入營養(yǎng)激活劑實現(xiàn)日產(chǎn)油量提高0.8 t[6]，沾3區(qū)塊日產(chǎn)油量由激活前的2.5 t/d上升至14.0 t/d[7]；大慶油田第四采油廠A區(qū)塊在注入營養(yǎng)激活劑后平均日產(chǎn)液量由456 t增加倒528 t，平均日常油量由15.2 t增加到28.5 t[8]，驅(qū)油效率得到顯著提高。盡管激活劑的注入能夠刺激地層微生物的快速生長繁殖，從而改善原油驅(qū)替效果，但激活劑篩選周期長，對不同區(qū)塊的油藏都需要進(jìn)行重新篩選激活劑，主要原因是對地層中的群落結(jié)構(gòu)認(rèn)識不足，難以實現(xiàn)有針對性激活油藏微生物。

傳統(tǒng)人工培養(yǎng)方法難以完整反映群落生態(tài)系統(tǒng)，多種分子生物學(xué)技術(shù)逐漸被廣泛應(yīng)用于物種多樣性研究[9-11]。常用的分子生物學(xué)技術(shù)主要有變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)、端限制性片段長度多態(tài)性(terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)及高通量測序技術(shù)等。近年來16sRNA、宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組等高通量測序技術(shù)通過提高測序深度和覆蓋度，實現(xiàn)對低豐度菌群的有效鑒定與統(tǒng)計，在反映整體樣本情況上更加精確，隨著測序技術(shù)和計算機軟硬件的迅猛發(fā)展，數(shù)據(jù)量巨大的宏基因組研究的成本在逐步降低，宏基因組領(lǐng)域的研究數(shù)量在呈指數(shù)型增長[12-13]。進(jìn)一步拓展了人們對油藏微生物群落結(jié)構(gòu)的認(rèn)識，有助于提升對油藏微生群落結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識。

現(xiàn)通過對A油田和L油田的高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，解析不同溫度下水驅(qū)油藏注水井和生產(chǎn)井的群落結(jié)構(gòu)特征，分析樣品的優(yōu)勢菌屬與環(huán)境因子間的關(guān)系，為油藏微生物高效激活劑篩選提供指導(dǎo)，為微生物驅(qū)油技術(shù)的推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 分析方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

樣品數(shù)據(jù)采集來源于NCBI(National Center for Biotechnology Information (nih.gov))。本文中A油田表示阿爾及利亞油田，L油田表示陸梁油田。通過使用R軟件(https://www.r-project.org/)和dada2包分析L油田和A油田的相關(guān)序列數(shù)據(jù)，得到相應(yīng)的OTU (operational taxonomic units)以及物種注釋表等。L油田注水井包括Lu3084、Lu3064和生產(chǎn)井Lu3065和Lu3069。A油田注水井包括IBD、IS2、IT3和生產(chǎn)井PFOH1、PFOH2、PFS2[14-15]。L油田選用數(shù)據(jù)的登錄號分別為,SRX588796(Lu3064)，SRX588714(L3065)，SRX588677(Lu3084)，SRX588820(Lu3096)；A油田選用數(shù)據(jù)分別為SRX265483(IT3),SRX265484(PFS1), SRX265485(IS2),SRX265486(IBD),SRX265487(PFOH1),SRX265488(PFOH2)。兩個油田的生產(chǎn)井、注水井地層環(huán)境如表1所示，相關(guān)序列數(shù)信息如表2所示。

表1 A油田和L油田采樣井環(huán)境條件Table 1 Environmental conditions of sampling wells in Algeria oilfield and Luliang Oilfield

表2 有效序列數(shù)Table 2 Number of valid sequences

1.2 分析方法

1.2.1 物種組成分析

使用軟件R和SILVA庫(http://www.arb-silva.de/search/testprime/)對樣品序列進(jìn)行物種比對，得到物種注釋結(jié)果，并使用phyloseq包繪制物種豐度圖[16]，同時使用TBtools軟件繪制Venn圖[17]。

1.2.2 物種多樣性分析

使用R軟件進(jìn)行多樣性分析，計算物種的豐富度采用Chao1、ACE，菌群多樣性的指數(shù)采用Shannon-Wiener(H′)和Simpson(D)，H′=-∑pilnpi，其中pi=ni/N，D=∑ni(ni-1)/[N(N-1)],H′為樣品的信息含量，pi表示第i個物種占總數(shù)的比例，ni表示物種i的個體數(shù)，N為所在群落的所有物種的個體數(shù)之和。本研究中用于指數(shù)評估的OTU相似水平為100%[18-19]。

1.2.3 PcoA分析

使用軟件R和Vegan包對物種門水平和屬水平上的OTUs數(shù)據(jù)進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis,PCoA)。

1.2.4 冗余分析

使用R軟件和Vegan包先做去趨勢對應(yīng)分析(detrented correspondence, DCA)，根據(jù)Axis length值對采用典型相關(guān)分析(canonical correlation analysis, CCA)分析或者RDA分析進(jìn)行判定，同時分析環(huán)境因子于與物種及樣本間的相關(guān)性[20]。

2 分析結(jié)果

2.1 樣本物種組成分析

通過對樣本中屬水平的物種進(jìn)行統(tǒng)計分析得到物種相對豐度如圖1所示。由圖1(a)可知,A油田的注水井和生產(chǎn)井中的古菌菌種數(shù)較少，但在菌群豐度分布上差異性明顯。注水井中以甲烷嗜熱屬(Methanothermobacte，43.91%)、甲烷類菌屬(Methanosaeta，14.21%)、甲烷桿菌(Methanobacterium，5.53%)為主要菌屬。在生產(chǎn)井中的優(yōu)勢菌屬分別為亞硝酸鹽菌屬(CandidatusNitrocosmicus，45.11%)，酵母菌(Saccharolobus，22.43%)和甲烷嗜熱菌屬(Methanothermobacter，5.36%)。由圖1(c)所示,L油田的注水井和生產(chǎn)井并無太大差異，都以Methanolobus為主要菌屬。在注水井中主要菌屬分別為硫球菌(Sulfophobococcus，29.5%)、亞硝酸鹽菌屬(CandidatusNitrosopumilus，15.12%)、(Methanolobus，5.16%)和(Methanomethylovorans，20.66%)。生產(chǎn)井種以Methanolobus(91.63%)作為主要菌屬。如圖1(b)所示,A油田注水井中的細(xì)菌以嗜溫?zé)峋鷮?Tepidiphilus，24.35%)、脫硫弧菌(Desulfovibrio，15.52%)、海桿菌屬(Marinobacterium，9.1%)和假單胞菌屬(Pseudomonas，8.79%)為主要菌屬。在生產(chǎn)井中的優(yōu)勢細(xì)菌菌屬分別為假單胞菌屬(Pseudomonas，23.39%)和食酸菌(Acidovorax18.82%)，能夠明顯看出注水井和生產(chǎn)井間的群落組成差異較大，共同優(yōu)勢菌屬數(shù)量較少，僅存在一個共同優(yōu)勢菌種——假單胞菌屬。如圖1(d)所示,L油田的注水井和生產(chǎn)井中的細(xì)菌群落組成基本保持一致，但物種豐富度較低，并且優(yōu)勢菌屬上也存在顯著差異。注水井主要菌屬分別為(Denitromos，5.3%)、海桿菌屬(Marinobacterium，4.84%)。生產(chǎn)井中以龍血桿菌(Draconibacterium，6.95%)、假單胞菌(Pseudomonas，6.66%)和海桿菌屬(Marinobacterium，5.87%)為主要菌屬，其次還包含常見驅(qū)油菌屬芽孢桿菌(Bacillus，1.76%)。

A_Inj為A油田注水井，A_Pro為A油田生產(chǎn)井，L_Inj為L油田 注水井，L_Pro為L油田生產(chǎn)井 圖1 樣本古菌、細(xì)菌在屬水平上的物種組成圖Fig.1 Species composition diagram of sample archaea and bacteria at the genus leve

通過Venn圖分析A油田和L油田的注水井和生產(chǎn)井中的共有菌屬。如圖2所示，在古菌中共有菌屬數(shù)目保持一致性，數(shù)目都為2，其中A油田的生產(chǎn)井和生產(chǎn)井共有菌屬分別為甲烷嗜熱菌(Methanothermobacter)和un_f__SCGCAAA286-E23，L油田中的古菌共有菌屬分別為(甲烷球菌屬)Methanococcus和Methanolobus。但是在細(xì)菌中共菌屬數(shù)目具有較大差別，L油田的生產(chǎn)井和注水井共有菌屬數(shù)目163，A油田中的生產(chǎn)井和注水井共有菌屬數(shù)目僅有52，表明在屬水平上，L油田中的生產(chǎn)井和注水井間的物種相似程度要明顯高于A油田。

2.2 物種多樣性分析

Rank-abundance曲線能夠分析樣本的物種豐度和物種均度，在水平方向，物種的豐度由曲線的寬度來反映，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線的平滑程度反映了樣本中物種的均度，曲線越平緩，物種分布越均勻。如圖3所示，在A油田和L油田的Rank-abundance曲線圖中，A油田中的注水井和生產(chǎn)井間物種豐度和物種均度差異不明顯；L油田的注水井L3064的物種均度和物種豐度相對較高，注水井L3084和生產(chǎn)井間的物種均度和物種豐度差異不明顯。

2.3 PcoA分析

選取樣本門水平和屬水平上的數(shù)據(jù)，采用Bray-Curtis算法計算每個樣本的物種組成相似性，得到PCoA分析結(jié)果如圖4所示?；陂T水平的PCoA分析結(jié)果能夠看出L油田中生產(chǎn)井和注水井之間物種相似性較低，而A油田中，處于同一區(qū)塊的生產(chǎn)井和注水井在物種組成上差異不明顯，如生產(chǎn)井PFS1和注水井IS2，生產(chǎn)井PFOH1、PFOH2和注水井IT3。然而在屬水平PCoA分析結(jié)果中，A油田中的注水井和生產(chǎn)井間的物種相似性較低，而L油田中的注水井和生產(chǎn)井間的物種相似性較高，呈現(xiàn)與門水平相反的趨勢。

數(shù)字表示4個樣本之間相交和不相交的物種數(shù) 圖2 屬水平上的OTUs分布圖Fig.2 A horizontal OTUs distribution map

圖3 Rank-abundance曲線Fig.3 Rank-abundance curve

圖4 PCoA分析圖Fig.4 PCoA analysis diagram

2.4 冗余分析

圖5 樣本和樣本群落與理化因子之間的RDA分析Fig.5 RDA analysis between samples and sample communities and physical and chemical factors

3 討論

PcoA分析結(jié)果表明A油田得注水井與生產(chǎn)井中的微生物群落相似性具有明顯差異，這與任紅燕等[9]關(guān)于受環(huán)境影響導(dǎo)致了注入水和產(chǎn)出液中的微生物類型差異結(jié)論具有一致性。在物種相對豐度結(jié)中，A油田的注水井和生產(chǎn)井間的物種組成差異較大，在分析注水井和生產(chǎn)井間的優(yōu)勢菌群組成上，主要優(yōu)勢菌屬發(fā)生明顯改變，注水井中的嗜溫?zé)峋鷮?Tepidiphilus，24.35%)、脫硫弧菌(Desulfovibrio，15.52%)、甲烷類菌屬(Methanosaeta，14.21%)和甲烷桿菌屬(Methanobacterium，9.1%)等在生產(chǎn)井中占比大幅度下降，食酸菌(Acidovorax，18.82%)、Alicycliphilus(5.72%)、Acinetobacter(5.59%)等成為新的優(yōu)勢菌屬，有研究表明食酸菌能夠通過對石油烴進(jìn)行降解獲取代謝所需要的能量[21]，假單胞菌能夠通過降解碳?xì)浠衔锊⑹褂孟跛猁}作為末端受體電子[22]，是作為微生物驅(qū)油的常用菌屬之一[23-24]。

此外，根據(jù)Alpha多樣性分析結(jié)果表明(表3)，A油田注水井和生產(chǎn)井間的物種多樣性和物種豐度差異不明顯，表明注水井中的油藏微生物對于生產(chǎn)井中的地層環(huán)境適應(yīng)性較低，與生產(chǎn)井中的微生物群落在營養(yǎng)物質(zhì)等的競爭中處于劣勢，相對豐度逐漸降低。L油田中的物種相似較高，并且在物種組成上差異不顯著，共有菌屬較多，Alpha多樣性分析結(jié)果與A油田相似，生產(chǎn)井和注水井間差異不明顯，這為實施微生物驅(qū)油提供了良好的基本條件。

表3 Alpha多樣性結(jié)果Table 3 Alpha diversity results

表4 DCA分析結(jié)果Table 4 DCA analysis results

4 結(jié)論

主要通過分析A油田和L油田中注水井和生產(chǎn)井的物種組成以及環(huán)境因子對群落組成的影響，得到以下結(jié)論。

(1)A油田的注水井和生產(chǎn)井中的古菌菌種數(shù)較少，但在菌群豐度分布上差異性明顯；在細(xì)菌分布上，注水井和生產(chǎn)井間的群落組成差異明顯。L油田的注水井和生產(chǎn)井的古菌并無太大差異，都以Methanolobus為主要菌屬。在細(xì)菌分布上，群落組成基本保持一致，但物種豐富度較低，并且優(yōu)勢菌屬上也存在顯著差異。

(2)A油田和L油田中的注水井和生產(chǎn)井間物種豐度和物種均度差異不明顯，此外，兩油田間的物種豐度和物種多樣性差異不顯著。

(3)在屬水平上，A油田中的注水井和生產(chǎn)井間的物種相似性較低，而L油田中的注水井和生產(chǎn)井間的物種相似性較高。