何錫忠，李嘉皓，林 鷙，趙本進(jìn)，朱永軍，彭麗英*

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.上海佳牧生物制品有限公司，上海 201403)

病毒是專性寄生物，自身無完整的酶系統(tǒng)，不能進(jìn)行獨立的物質(zhì)代謝，必須在活的宿主細(xì)胞內(nèi)才能進(jìn)行生長、復(fù)制和增殖。自20世紀(jì)40 年代末首次發(fā)現(xiàn)脊髓灰質(zhì)炎病毒在體外非神經(jīng)組織上生長復(fù)制以來，細(xì)胞培養(yǎng)已成為培養(yǎng)病毒的主要方法[1]。培養(yǎng)基是維持宿主細(xì)胞生存和生長所需的基本溶液，國產(chǎn)與進(jìn)口都屬于合成達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle's medium，DMEM)，是按人和動物體內(nèi)細(xì)胞所需成分模擬合成、配方恒定的一種較理想的培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)促進(jìn)了組織培養(yǎng)的發(fā)展，減少了生物個體差異的影響[2]。目前培養(yǎng)豬睪丸(swine testis，ST)細(xì)胞的DMEM 主要依賴進(jìn)口，價格昂貴，而且受限因素很多。近幾年，國產(chǎn)DMEM 發(fā)展迅速。本研究對國產(chǎn)和進(jìn)口DMEM 培養(yǎng)ST 細(xì)胞的效果進(jìn)行比較，并對豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)、豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus，PPV)和豬傳染性胃腸炎病毒 (transmissible gastroenteritis virus，TGEV)在國產(chǎn)和進(jìn)口培養(yǎng)基培養(yǎng)的ST細(xì)胞中敏感性進(jìn)行分析，以期為國產(chǎn)DMEM 大規(guī)模培養(yǎng)病毒等提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 細(xì)胞和病毒毒株

ST 細(xì)胞株購自湖南豐暉生物科技有限公司。PRVsx-gE、PPV 和TGEV 毒株由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物疾病診斷檢測中心保存。

1.2 試劑及耗材

進(jìn)口DMEM、新生牛血清、胰酶購自GIBCO公司，國產(chǎn)DMEM 由上海源培生物科技股份有限公司提供。

1.3 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱購自Thermo公司；Retiga 2000R 高敏感度冷熒光數(shù)碼顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

2 試驗方法

2.1 ST 貼壁細(xì)胞培養(yǎng)

取形成致密單層的適量T-75 方瓶ST細(xì) 胞，用含0.2%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA) 的PBS清洗3 次，加入 0.25%胰酶消化片刻，傾去胰酶，分別用含10%新生牛血清的國產(chǎn)與進(jìn)口DMEM 制備成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞初始接種密度統(tǒng)一為0.25×106個/mL，每組重復(fù)做4 瓶，37 ℃培養(yǎng)72 h。

2.2 ST 貼壁細(xì)胞連續(xù)傳代

細(xì)胞培養(yǎng)成致密單層后，按照“2.1 ST貼壁細(xì)胞培養(yǎng)”中的方法消化ST 貼壁細(xì)胞，分別用含10%新生牛血清的國產(chǎn)與進(jìn)口DMEM制備成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞初始接種密度調(diào)整為0.25×106個/mL，每組重復(fù)做3 瓶，取其平均數(shù)，37 ℃培養(yǎng)72 h 后傳代，連續(xù)傳10 代。觀察不同DMEM 對細(xì)胞連續(xù)傳代的影響。

2.3 病毒培養(yǎng)試驗

分別取國產(chǎn)與進(jìn)口DMEM 培養(yǎng)的致密單層的適量T-75 方瓶ST 細(xì)胞，按照“2.1 ST 貼壁細(xì)胞培養(yǎng)”中的方法消化ST 貼壁細(xì)胞，分別用含10%新生牛血清的國產(chǎn)與進(jìn)口DMEM 制備成細(xì)胞懸液，按1∶4 接種傳代，37 ℃培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)基后加入適量PBS 洗滌3 次，分別接種培養(yǎng)PPV、PRV 和TGEV，具體操作如下：

2.3.1 ST 細(xì)胞接種PPV

取洗滌好的ST 細(xì)胞各3 瓶，每瓶按1%接種PPV 工作種毒，37 ℃恒溫箱內(nèi)吸附1.5 h，向瓶內(nèi)分別加入國產(chǎn)或者進(jìn)口DMEM 的細(xì)胞維持液(含1%～2%的犢牛血清) 至10 mL，使維持液中毒種含量為0.1%，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)96 h。觀察到50%以上的細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時收獲，反復(fù)凍融3 次后測定滴度。

2.3.2 ST 細(xì)胞接種PRV

取洗滌好的ST 細(xì)胞各3 瓶，每瓶按1%接種PRV 工作種毒，37 ℃恒溫箱內(nèi)吸附1 h，向瓶內(nèi)分別加入國產(chǎn)或者進(jìn)口DMEM 的細(xì)胞維持液(含1%～2%的犢牛血清) 至10 mL，使維持液中毒種含量為0.1%，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。觀察到70%以上細(xì)胞出現(xiàn)拉絲變長、拉網(wǎng)脫落現(xiàn)象時收獲，反復(fù)凍融3 次后測定滴度。

2.3.3 ST 細(xì)胞接種TGEV

操作同上，觀察到70%以上細(xì)胞呈顆粒狀、拉網(wǎng)脫落現(xiàn)象，液相的透明度渾濁(但不是污染的云煙狀)時收獲，反復(fù)凍融3 次后測定滴度。

2.4 細(xì)胞密度和TCID50 測定

用含0.2% EDTA 的PBS 清洗3 次，加入0.25%胰酶消化片刻，傾去胰酶，用DMEM 制備成細(xì)胞懸液，取樣后用含10 g/L 結(jié)晶紫的檸檬酸溶液染色，用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞。TCID50測定按照常規(guī)方法測定。

3 結(jié)果與分析

3.1 ST 貼壁細(xì)胞培養(yǎng)情況

由表1 可知，用國產(chǎn)與進(jìn)口DMEM 培養(yǎng)ST細(xì)胞，72 h 后細(xì)胞均增殖到1.25×106個/mL以上，增加了5 倍多，兩者無顯著差異(P＞0.05)，表明國產(chǎn)DMEM 適合用于ST 貼壁細(xì)胞培養(yǎng)。

3.2 ST 細(xì)胞連續(xù)傳代情況

結(jié)果(表2) 顯示，用國產(chǎn)DMEM 靜止培養(yǎng)72 h，第1 代～第10 代細(xì)胞密度均達(dá)到1.25×106個/mL 以上，與進(jìn)口DMEM 相似，兩者無顯著差異(P＞0.05)，表 明國產(chǎn)DMEM 也可以連續(xù)傳代培養(yǎng)ST 細(xì)胞。

3.3 PPV、PRV 和TGEV 在ST 細(xì)胞中的增殖

如表3 所示，兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)同一病毒的滴度相近，兩者無顯著差異(P＞0.05)，初步表明PPV、PRV 和TGEV 在用國產(chǎn)DMEM 培養(yǎng)的ST 細(xì)胞中能正常增殖。

4 結(jié)論與討論

為了評價國產(chǎn)DMEM 的質(zhì)量，以進(jìn)口DMEM為對照，比較兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)ST 細(xì)胞的生長狀態(tài)和幾種病毒在ST 細(xì)胞中增殖的一致性。本試驗結(jié)果表明，國產(chǎn)DMEM 培養(yǎng)ST 細(xì)胞的生長狀態(tài)與進(jìn)口DMEM 相似，用國產(chǎn)DMEM 培養(yǎng)ST 細(xì)胞來增殖PPV、PRV 和TGEV，均能到達(dá)毒價標(biāo)準(zhǔn)。

李建平等[3]比較了國產(chǎn)與進(jìn)口DMEM 培養(yǎng)CHO-C28 細(xì)胞的培養(yǎng)上清中HBsAg 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)培養(yǎng)基略好于進(jìn)口培養(yǎng)基，二者純化圖譜和抗原電泳圖譜一致。

用原來過濾系統(tǒng)除菌過濾培養(yǎng)基，進(jìn)口培養(yǎng)基通透性優(yōu)于國產(chǎn)，可能是添加的營養(yǎng)成分不同所致；更換過濾系統(tǒng)后二者通透性基本一致。

綜上所述，通過利用國產(chǎn)DMEM 培養(yǎng)ST 細(xì)胞及應(yīng)用于PRV、PPV 和TGEV 的增殖培養(yǎng)，國產(chǎn)DMEM 達(dá)到了進(jìn)口培養(yǎng)基水平，可用于規(guī)?；a(chǎn)。