馬旭華，楊 波，李亞蕾，羅瑞明，張杏亞，張 萌

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

作為一種低脂肪、高蛋白的食品，牛肉深受消費(fèi)者喜愛(ài)。其中，嫩度是影響消費(fèi)者滿意度和接受度的主要因素，也是衡量牛肉食用品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)之一。因此，國(guó)內(nèi)外對(duì)肉嫩度變化機(jī)理的研究一直沒(méi)有停止。綜合學(xué)者的研究成果，可總結(jié)出影響嫩度形成的4 個(gè)主要機(jī)理：一是肌原纖維蛋白的碎裂或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變導(dǎo)致Z線弱化；二是通過(guò)蛋白酶（鈣蛋白酶、組織蛋白酶）和蛋白酶體裂解蛋白質(zhì)引發(fā)嫩度變化；三是糖酵解酶在宰后調(diào)節(jié)嫩度；四是細(xì)胞凋亡和熱休克蛋白參與嫩度形成。

蛋白質(zhì)組學(xué)是指研究一個(gè)組織或細(xì)胞的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)起初是用于人體醫(yī)學(xué)檢測(cè)，隨著技術(shù)的發(fā)展，逐漸應(yīng)用到食品學(xué)科中，為研究食品深層變化機(jī)理提供了新的方法。此技術(shù)不用同位素標(biāo)記，通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，分析蛋白質(zhì)酶解后肽段的信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而對(duì)蛋白質(zhì)定性定量。在3D蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中主要從3 個(gè)維度（離子強(qiáng)度、質(zhì)荷比和保留時(shí)間）檢測(cè)蛋白質(zhì)，4D-非標(biāo)記定量（4D-label free quantification，4D-LFQ）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)則是在3D分離技術(shù)基礎(chǔ)上增加了參數(shù)離子淌度，其主要根據(jù)離子的截面及形狀進(jìn)行分離，為測(cè)定秦川牛肉組織這種復(fù)雜體系樣本帶來(lái)了更多的可能。李升升利用同位素相對(duì)標(biāo)記和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)研究牦牛平滑肌貯藏過(guò)程嫩度的變化機(jī)理，結(jié)果表明ADP/ATP轉(zhuǎn)位酶1、鈣蛋白酶抑素、原肌球蛋白-3鏈、細(xì)胞色素b-c1復(fù)合物亞基1等蛋白可能是牦牛平滑肌貯藏期嫩度變化的指示蛋白。Sawdy等研究表明牛背長(zhǎng)肌貯藏7 d后嫩度的變化與肌球蛋白重鏈斷裂有關(guān)，結(jié)果顯示，在肌肉嫩化過(guò)程中，肌球蛋白輕鏈1、2和重鏈1的表達(dá)量明顯降低。Alessandro等研究發(fā)現(xiàn)在肉成熟過(guò)程中肌動(dòng)蛋白顯著降解，產(chǎn)生了31 kDa條帶。

本研究主要采用4D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選差異蛋白質(zhì)，在貯藏0～8 d對(duì)秦川牛背最長(zhǎng)肌的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行檢測(cè)，分析其涉及的信號(hào)通路，探索秦川牛宰后結(jié)構(gòu)蛋白降解對(duì)嫩化機(jī)制的影響，以更加深入地研究剪切力、肌原纖維小片化指數(shù)（myofibrillar fragmentation index，MFI）、肌肉總可溶性蛋白、肌原纖維蛋白、肌漿蛋白的變化機(jī)理。實(shí)驗(yàn)選用秦川黃牛背最長(zhǎng)肌作為研究對(duì)象，秦川黃牛作為陜甘寧地區(qū)優(yōu)勢(shì)特色畜種，肉質(zhì)細(xì)膩、瘦肉比例高、大理石紋路明顯，其背最長(zhǎng)肌可做成高檔牛排。利用4D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究其嫩度變化機(jī)理，有望為秦川牛肉工業(yè)加工中對(duì)嫩度的控制提供相應(yīng)的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

25 月齡秦川公牛由甘肅省平?jīng)鍪袥艽h旭康食品有限責(zé)任公司提供。

三乙基碳酸氫銨、尿素、碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇美國(guó)Sigma公司；三氟乙酸 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；胰酶 美國(guó)Promega公司；蛋白酶抑制劑 德國(guó)Calbiochem公司；乙腈 美國(guó)Fisher Chemical公司；甲酸 瑞士Fluka公司；聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒 上海碧云天公司；2X還原性Losding Buffer、考馬斯亮藍(lán)G-250、考馬斯亮藍(lán)R-250、牛血清白蛋白 中國(guó)上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NAI-CS150超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 上海那艾精密儀器有限公司；205便捷式pH計(jì) 德國(guó)德圖集團(tuán)；MiniVac Alpha冷凍離心機(jī) 美國(guó)Scan Speed公司；timsTOF Pro質(zhì)譜儀 德國(guó)Bruker公司；Forma 994-80 ℃超低溫冰箱 美國(guó)Thermo公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；Power Pac基礎(chǔ)電泳儀 美國(guó)伯樂(lè)公司；c150凝膠成像儀 美國(guó)Azure Biosystems公司；JXFSTPRP-CL冷凍研磨儀 杭州優(yōu)嘉科學(xué)儀器有限公司；UV-1200紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

采樣對(duì)象選用3 頭自然放養(yǎng)、發(fā)育正常、健康無(wú)病、體質(zhì)量相近、25 月齡左右的秦川公牛。用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液對(duì)采樣所需刀具、鑷子等工具進(jìn)行消殺處理。屠宰后的秦川公牛對(duì)胴體修整后，用去離子水沖洗，取3 頭牛的左胴體背最長(zhǎng)肌，每個(gè)背最長(zhǎng)肌樣品平均分割成3 份，共計(jì)9 個(gè)樣品。樣品分割成塊后用透氣性為23.5 g/（m·d）的聚乙烯薄膜密封，貯存于0～4 ℃的冰箱中。待貯存時(shí)間為0、2、4、6、8 d時(shí)立即置入液氮中2 h，然后放入-80 ℃低溫冰箱中保存，待檢測(cè)分析使用。

1.3.2 秦川牛背最長(zhǎng)肌剪切力測(cè)定

參考李桂霞等的方法稍作修改。取規(guī)格約3 cm×6 cm×6 cm肉塊除去表面的脂肪和筋膜，將肉樣置于蒸煮袋內(nèi)，抽去袋內(nèi)空氣，使肉塊表面緊貼蒸煮袋，肉塊中插入熱電偶溫度計(jì)，密封袋口，置于水浴鍋在80 ℃下加熱至中心溫度為70 ℃后立即取出，冷卻至室溫，將肉樣沿肌纖維方向用直徑1.27 cm采樣器平行取4 個(gè)肉柱，然后用質(zhì)構(gòu)儀V型活動(dòng)剪切刀架垂直于肌纖維方向測(cè)定其剪切力，剪切速率1.5 mm/s，剪切距離40 mm，測(cè)定4 次取平均值。

1.3.3 秦川牛背最長(zhǎng)肌蛋白質(zhì)溶解度測(cè)定

選取宰后貯藏0、2、4、6、8 d的秦川牛背最長(zhǎng)肌樣品，參考Joo等的方法提取總可溶性蛋白和肌漿蛋白，參考李升升的方法提取肌原纖維蛋白，并采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，即為溶解度。

參考焦?jié)?、Bradford等的方法，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，595 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，通過(guò)Origin軟件線性擬合可得方程＝5.767 6-0.018 2（＝0.996 1）（為吸光度；為蛋白質(zhì)含量/（mg/g））。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳分析

根據(jù)黃峰的方法稍作修改。制備5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的濃縮膠和12%的分離膠，將1.3.3節(jié)所得總可溶性蛋白溶液統(tǒng)一調(diào)至質(zhì)量濃度1.00 mg/mL，加入7.5 μL樣品緩沖液（2×還原性Loading Buffer）和15 μL蛋白質(zhì)溶液樣品于小離心管中混勻，煮沸加熱5 min，室溫冷卻后加入到上樣孔中。加入10 μL蛋白Marker（10～250 kDa）。濃縮膠電流設(shè)置為15 mA，待溴酚藍(lán)指示條帶遷移至分離膠與濃縮膠分割線處調(diào)整電流為25 mA，蛋白Marker不同條帶均分離后關(guān)閉電源，電泳完成。小心取出凝膠置于培養(yǎng)皿中，加入考馬斯亮藍(lán)R-250，50 r/min搖床染色1 h后脫色，脫色劑更換3～5 次，每30 min更換1 次。脫色完成后置于凝膠成像儀中成像。

1.3.5 MFI測(cè)定

參考Culler等的方法，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)量濃度。用MFI緩沖液將蛋白溶液稀釋至質(zhì)量濃度0.5 mg/mL，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，取平均值帶入下式計(jì)算MFI。

式中：為MFI；為。

1.3.6 4D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)含量

參照張杏亞等的方法提取蛋白質(zhì)并測(cè)定蛋白質(zhì)含量，參照羅輝等的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索、生物信息學(xué)分析篩選差異蛋白質(zhì)，利用京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genome，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genome.jp/kegg/）檢索代謝途徑，并利用String 10.0（http://string-db.org/）和Cytoscape 3.6.1軟件繪制差異蛋相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用SPSS 24軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan檢驗(yàn)，確定數(shù)據(jù)間是否具有差異顯著性，＜0.05為差異顯著，＜0.01為差異極顯著，利用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏時(shí)間秦川牛背最長(zhǎng)肌剪切力的變化

肉的嫩度直接影響其食用時(shí)的口感，故嫩度是牛肉的重要品質(zhì)指標(biāo)之一。在研究中常用剪切力來(lái)反映肉的嫩度情況。

由圖1可知，0～8 d貯藏期剪切力總體呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，且上升的幅度小于下降的幅度。牛肉在貯藏0 d時(shí)的剪切力為（120.25±5.15）N，0～4 d時(shí)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，4 d時(shí)最高，剪切力為（157.94±2.53）N；4 d后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，8 d時(shí)達(dá)到整個(gè)貯藏期的最低點(diǎn)，剪切力為（93.41±5.08）N。馬秀利在研究牛肉品質(zhì)變化時(shí)剪切力也出現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)。

圖1 秦川牛背最長(zhǎng)肌不同貯藏時(shí)間剪切力變化Fig. 1 Changes in shear force of Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle at different storage times

2.2 不同貯藏時(shí)間秦川牛背最長(zhǎng)肌總可溶性蛋白含量的變化

由圖2可知，0～8 d貯藏期總可溶性蛋白含量呈顯著下降趨勢(shì)（＜0.05）。貯藏0 d時(shí)含量為（196.44±2.10）mg/g，貯藏8 d時(shí)總可溶性蛋白含量達(dá)到整個(gè)過(guò)程的最低點(diǎn)（（128.47±0.87）mg/g），總體下降了34.60%。這一結(jié)果表明秦川牛肉貯藏期蛋白質(zhì)變化較為明顯，宰后貯藏過(guò)程中肌肉組織進(jìn)行代謝，氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的氧化修飾程度高導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化加劇，從而使蛋白質(zhì)分子內(nèi)暴露更多的疏水基團(tuán)，表面疏水性不斷增加。同時(shí)由于游離巰基易氧化轉(zhuǎn)化為二硫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)大量聚集和沉淀，使肌肉組織蛋白發(fā)生降解。

圖2 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏過(guò)程中總可溶性蛋白的含量變化Fig. 2 Changes in total soluble protein content of Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during storage

根據(jù)秦川牛背最長(zhǎng)肌蛋白分子質(zhì)量選擇蛋白Marker指示范圍（10～250 kDa），共有10 條條帶。電泳前在每個(gè)凹糟中加入等質(zhì)量濃度的溶液，保證有且僅有蛋白降解變化影響條帶的顏色和寬度。

由圖3可知，秦川牛背最長(zhǎng)肌條帶眾多，由此可判斷蛋白種類(lèi)較多。隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，150～250 kDa內(nèi)蛋白條帶逐漸變窄；秦川牛背最長(zhǎng)肌總可溶性蛋白100 kDa處I條帶逐漸變淺；37～50 kDa內(nèi)蛋白條帶逐漸變淺且分散；25～37 kDa內(nèi)原肌球蛋白條帶逐漸變淺，但I(xiàn)I條帶顯著變深；10～25 kDa內(nèi)III、IV條帶變深，IV條帶明顯變深。總體上，高分子質(zhì)量蛋白條帶逐漸變淺，低分子質(zhì)量蛋白條帶逐漸變深，這一結(jié)果與總可溶性蛋白分析結(jié)果結(jié)合，可以推測(cè)出秦川牛背最長(zhǎng)肌總可溶性蛋白出現(xiàn)顯著降解現(xiàn)象，其結(jié)構(gòu)總可溶性蛋白變化可能會(huì)影響嫩度的形成。

圖3 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏過(guò)程總可溶性蛋白電泳圖Fig. 3 Degradation of total soluble proteins in Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle during storage

2.3 不同貯藏時(shí)間秦川牛背最長(zhǎng)肌肌漿蛋白含量的變化

利用肌漿蛋白在水溶液和低鹽溶液中具有較高的溶解性提取肌漿蛋白，以此判斷肌漿蛋白含量的變化。由圖4可知，0～8 d貯藏期內(nèi)肌漿蛋白含量呈上升趨勢(shì)，由（43.48±0.43）mg/g增加至（52.97±0.35）mg/g，總體增加了21.83%。

圖4 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏過(guò)程中肌漿蛋白含量的變化Fig. 4 Changes in sarcoplasmic protein content in Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle during storage

由圖5可知，0～8 d貯藏期I（150～250 kDa范圍內(nèi)兩條蛋白條帶）逐漸變淺；II（100 kDa蛋白條帶）逐漸變淺變窄；III（37 kDa蛋白條帶）由3 條蛋白條帶逐漸變成兩條，中間條帶消失；IV（25 kDa蛋白條帶）在前2 d逐漸明顯加深，2～8 d貯藏期內(nèi)變化不明顯；V（15 kDa蛋白條帶）在2 d后逐漸變寬，可能是大分子蛋白分解的結(jié)果；其他條帶無(wú)顯著變化。通過(guò)以上5 處條帶的變化也可歸納出，高分子質(zhì)量蛋白條帶逐漸變淺，低分子質(zhì)量蛋白條帶逐漸變深變寬?？梢酝茰y(cè)出，貯藏過(guò)程中秦川牛背最長(zhǎng)肌肌漿蛋白中高分子質(zhì)量蛋白出現(xiàn)分解，含量變少，低分子質(zhì)量蛋白種類(lèi)逐漸增多，濃度不斷增大。

圖5 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏過(guò)程中肌漿蛋白降解電泳圖Fig. 5 Degradation of sarcoplasmic protein in Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle during storage

2.4 不同貯藏時(shí)間秦川牛背最長(zhǎng)肌肌原纖維蛋白含量的變化

利用肌原纖維蛋白具有高鹽溶解性提取肌原纖維蛋白，觀察肌原纖維蛋白的變化情況。由圖6可知，0～8 d貯藏期肌原纖維蛋白含量呈下降趨勢(shì)，由（136.72±3.06）mg/g持續(xù)下降至（67.60±0.84）mg/g。前期下降速率較快，后期下降速率有所放緩，總體下降了50.56%。

圖6 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏過(guò)程中肌原纖維蛋白含量的變化Fig. 6 Changes in myofibrillar protein content in Qinchuan cattle Longissimus doris muscle during storage

由圖7可知，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，分子質(zhì)量在100～250 kDa范圍內(nèi)蛋白條帶逐漸變深，蛋白含量逐漸增多；分子質(zhì)量在37～50 kDa內(nèi)的蛋白條帶變淺；分子質(zhì)量在25～37 kDa內(nèi)出現(xiàn)相對(duì)高分子質(zhì)量蛋白條帶變深、相對(duì)低分子質(zhì)量蛋白條帶逐漸消失或變淡；分子質(zhì)量在15～20 kDa內(nèi)的蛋白條帶逐漸變深；10～15 kDa處隨著貯藏期延長(zhǎng)逐漸出現(xiàn)漸變蛋白條帶。由以上蛋白條帶變化可知，其發(fā)生降解的肌原纖維蛋白出現(xiàn)在37～75 kDa范圍內(nèi)，而其含量增加的肌原纖維蛋白出現(xiàn)在10～20、100 kDa以上范圍內(nèi)，總體變化較為顯著，其變化可能會(huì)影響蛋白嫩度的形成。貯藏過(guò)程中秦川牛背最長(zhǎng)肌總可溶性蛋白在內(nèi)源酶的作用下被降解，而導(dǎo)致總可溶性蛋白含量下降，肌原纖維蛋白含量減少。這與李婷婷報(bào)道大黃魚(yú)中不同溶解性蛋白冷藏期間的濃度變化規(guī)律一致。

圖7 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏過(guò)程中肌原纖維蛋白降解電泳圖Fig. 7 Degradation of myofibril protein in Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle during storage

2.5 不同貯藏時(shí)間秦川牛背最長(zhǎng)肌MFI分析

肌纖維降解程度常用MFI來(lái)反映。由圖8可知，秦川牛背最長(zhǎng)肌在整個(gè)貯藏過(guò)程中MFI呈上升趨勢(shì)，0～2 d和6～8 d貯藏期上升較緩，2～6 d時(shí)上升較快。貯藏0 d時(shí)MFI為28.50±5.16，之后MFI一直增加，貯藏8 d時(shí)達(dá)到整個(gè)貯藏過(guò)程的最高點(diǎn)（99.98±1.20），增長(zhǎng)了250.81%。這一結(jié)果與李升升對(duì)牦牛平滑肌嫩度形成機(jī)理的研究中MFI的變化趨勢(shì)相一致。

圖8 秦川牛背最長(zhǎng)肌不同貯藏時(shí)間MFI的變化Fig. 8 Changes in MFI of Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle at different storage times

2.6 結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)宰后秦川牛背最長(zhǎng)肌嫩化影響的機(jī)制分析

由表1可知，0～8 d貯藏期表征肌纖維降解程度的MFI與剪切力并無(wú)顯著相關(guān)性（＝-0.285），D’Alessandro等在牛肉嫩度研究中也出現(xiàn)相同結(jié)果。結(jié)合大量學(xué)者提出的嫩度形成與肌原纖維降解有密切關(guān)系，可得貯藏前期肌原纖維小片化程度增大，主要是能量與pH值的變化引起肌肉收縮、組織僵化，進(jìn)而影響嫩度的降低，對(duì)剪切力影響較小。貯藏期內(nèi)MFI逐漸升高，中后期肌原纖維小片化累積到一定量時(shí)對(duì)嫩度的形成有貢獻(xiàn)。

此外，MFI與總可溶性蛋白、肌原纖維蛋白含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），與肌漿蛋白含量呈極顯著正相關(guān)（＜0.01）。這說(shuō)明MFI變化與肌肉蛋白組成變化有密切的關(guān)系，蛋白降解會(huì)增大MFI。

表1 秦川牛背最長(zhǎng)肌MFI、總可溶性蛋白、肌漿蛋白、肌原纖維及基質(zhì)蛋白含量和剪切力之間的相關(guān)性Table 1 Correlation between MFI and total protein, sarcoplasmic protein, myofibrillar protein and matrix protein contents and shear force in Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle

肌肉所含蛋白質(zhì)是由肌漿蛋白、基質(zhì)蛋白和作為結(jié)構(gòu)蛋白的肌原纖維蛋白組成。由圖9可知，貯藏0 d時(shí)測(cè)得秦川牛背最長(zhǎng)肌肌肉中肌原纖維占比69.60%，肌漿蛋白占比22.13%，基質(zhì)蛋白占比6.60%，符合肌肉組織中蛋白結(jié)構(gòu)組成比例。此外，貯藏0～8 d肌原纖維蛋白所占比例呈持續(xù)減少趨勢(shì)，由0 d時(shí)的69.60%逐漸降至8 d 時(shí)的52.61%；肌漿蛋白所占比例呈持續(xù)上升趨勢(shì)，由0 d時(shí)的22.13%逐漸增加至8 d時(shí)的41.23%，但基質(zhì)蛋白含量?jī)H有少量變化。由此可得肌肉所含蛋白質(zhì)中主要是肌原纖維蛋白的降解。而肌原纖維蛋白主要由肌動(dòng)蛋白（45 kDa）、肌球蛋白重鏈（200 kDa）和原肌球蛋白蛋白（35 kDa）組成，由圖7可知，0～8 d貯藏期肌動(dòng)蛋白與原肌球蛋白所屬條帶呈顯明顯變淺趨勢(shì)，可得肌動(dòng)蛋白與原肌球蛋白發(fā)生降解，在31 kDa附近出現(xiàn)新條帶有可能是肌動(dòng)蛋白的分解產(chǎn)物，作為肌動(dòng)蛋白降解標(biāo)志物。對(duì)于肌球蛋白重鏈的降解情況，在總可溶性蛋白凝膠電泳圖中發(fā)現(xiàn)在200 kDa附近條帶變淺，但在肌原纖維蛋白電泳圖中未發(fā)現(xiàn)有明顯變淺的情況，由此無(wú)法判斷肌球蛋白重鏈?zhǔn)欠癯霈F(xiàn)降解。肌原纖維蛋白降解可能是因?yàn)橘A藏過(guò)程中受到內(nèi)源酶（鈣蛋白酶、組織蛋白酶、細(xì)胞凋亡酶）作用，同時(shí)微生物對(duì)肌肉污染和對(duì)蛋白質(zhì)分解利用也有加速肌動(dòng)蛋白降解的作用。研究表明肉中肌原纖維蛋白降解會(huì)導(dǎo)致其在空間結(jié)構(gòu)、溶解度、疏水性等方面發(fā)生改變。肌原纖維是肌肉結(jié)構(gòu)骨架中主要的蛋白質(zhì)，是肌纖維的物質(zhì)基礎(chǔ)，其出現(xiàn)降解后，MFI逐漸增加，表明肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，結(jié)合剪切力4～8 d呈下降趨勢(shì)，可推測(cè)出肌肉中結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生降解，對(duì)嫩度形成可能會(huì)有一定影響。

圖9 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏過(guò)程中蛋白組成占比Fig. 9 Change in protein composition of Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle during storage

2.7 差異蛋白質(zhì)篩選

實(shí)驗(yàn)中采用4D-LFQ檢測(cè)了秦川牛宰后蛋白質(zhì)組的變化，對(duì)所得的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行質(zhì)譜檢索，共檢索確定蛋白1 149 個(gè)，設(shè)置1.2 倍為標(biāo)準(zhǔn)差異倍數(shù)，共篩選出120 個(gè)符合標(biāo)準(zhǔn)的差異蛋白質(zhì)，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這120 種差異蛋白進(jìn)行生物信息分析，所得的數(shù)據(jù)利用SPSS 25軟件中Pearson相關(guān)性分析，共確定11 種差異蛋白質(zhì)與嫩度形成機(jī)理有關(guān)，如表2所示。

表2 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏0、4、8 d嫩度相關(guān)差異蛋白對(duì)比Table 2 Comparison of tenderness-related differential proteins in Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle at days 0 versus 4 versus 8 of storage

2.8 生物信息學(xué)分析

圖10是利用Cytoscape 3.6.1和String 10.0軟件制作篩選出的與嫩度相關(guān)的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖。此網(wǎng)絡(luò)圖聚類(lèi)系數(shù)為0.759，蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）富集值為1.0×10。ACTN1、MYH9、MYLPF、MYL12B、MYH13、MYL2、MYH6、ACTC1、TNNI1、TNNI2、MYH15的相互作用強(qiáng)烈。以上11 種蛋白在肌球蛋白結(jié)合、鈣離子結(jié)合、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合的肌原纖維組裝、骨骼肌組織發(fā)育過(guò)程等途徑調(diào)控細(xì)胞的生理狀態(tài)。

圖10 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 10 Protein-protein interaction network diagram

2.9 結(jié)構(gòu)蛋白變化對(duì)秦川牛背最長(zhǎng)肌嫩度形成的影響

利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出11 種肌肉結(jié)構(gòu)蛋白（ACTN1、ACTC1、TNNI1、TNNI2、MYH9、MYH13、MYH6、MYH15、MYL2、MYL2B、MYLPF）出現(xiàn)異常表達(dá)，豐富度發(fā)生了不同程度變化。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的ACTN1與ACTC1均屬于肌動(dòng)蛋白家族。ACTN在細(xì)胞骨架蛋白家族廣泛表達(dá)，通常是以反向平行二聚體形式存在。據(jù)報(bào)道，ACTN有4 種亞基，ACTN2和ACTN3在肌肉細(xì)胞中表達(dá)，ACTN1和ACTN4與細(xì)胞膜上肌動(dòng)蛋白偶聯(lián)。ACTN1被認(rèn)為能將肌動(dòng)蛋白錨定在多種細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)上，是一種捆綁蛋白，0～8 d貯藏期內(nèi)呈現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢(shì)，推測(cè)是由于在肌原纖維束過(guò)于松散時(shí)的應(yīng)激反應(yīng)試圖重新固定松散的纖維束，增強(qiáng)骨架結(jié)構(gòu)；ACTC1也屬于肌動(dòng)蛋白家族，與肌原纖維細(xì)絲的聚集和形成有關(guān)，謝珊珊利用多組學(xué)技術(shù)整合分析梅山豬，發(fā)現(xiàn)ACTC1與肌原纖維形成有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中0～8 d貯藏期內(nèi)ACTC1表達(dá)量顯著下調(diào)，其低表達(dá)可能會(huì)影響肌纖維聚集度和結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致肌原纖維骨架網(wǎng)抗剪切能力降低。

TNNI1與TNNI2均屬于肌鈣蛋白家族，分別為肌鈣蛋白的1型和2型，是肌鈣蛋白的重要組成部分。有研究表明TNNI1與TNNI2在肌肉放松和收縮時(shí)發(fā)揮重要作用，同時(shí)影響肌原纖維的直徑、類(lèi)型、形態(tài)，肌原纖維這些特征會(huì)直接影響肉質(zhì)，尤其是肌纖維的類(lèi)型與直徑會(huì)直接影響牛肉的嫩度。由表2可知，TNNI1與TNNI2表達(dá)量在0～8 d貯藏期內(nèi)均出現(xiàn)顯著下調(diào)，呈現(xiàn)低表達(dá)現(xiàn)象。有研究證明，TNNI1在脊椎動(dòng)物排酸成熟過(guò)程中比較容易降解，且TNNI1發(fā)生降解后會(huì)伴隨著肉品嫩度的增加。綜上可得秦川牛宰后肌肉組織通過(guò)TNNI1與TNNI2低表達(dá)，調(diào)節(jié)肌肉纖維的直徑與形體，進(jìn)而參與嫩度的形成。

MYH6、MYH9、MYH13、MYH15、MYL2、MYL12B與MYLPF 7 種蛋白均屬于肌球蛋白家族。MYH6、MYH9、MYH13與MYH15均屬于肌球蛋白激酶ATPase超家族。Fang Xinhui等應(yīng)用對(duì)比實(shí)驗(yàn)將敲除，發(fā)現(xiàn)在缺氧情況下未敲除組基因的表達(dá)量明顯上調(diào)，與敲除組相比細(xì)胞葡萄糖消耗量與乳酸產(chǎn)生量明顯增多，這一結(jié)果表明MYH9可能會(huì)參與糖酵解過(guò)程。在本研究中MYH9表達(dá)量在0～4 d顯著上調(diào)，可以看出，秦川牛宰后缺氧情況下，會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)MYH9的表達(dá)量，增強(qiáng)無(wú)氧呼吸的強(qiáng)度，增加產(chǎn)能。MYH6屬于肌球蛋白重鏈家族。付睿琦利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)北京油雞肌肉基因篩選，結(jié)果表明MYH6可能是肌肉細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)組成成分，穆琳等研究也表明MYH6可能參與肌纖維發(fā)育過(guò)程，當(dāng)肌肉組織的生長(zhǎng)速度加快時(shí)，MYH6表達(dá)水平也會(huì)提高。有研究表明，MYH6的低表達(dá)會(huì)影響心肌的收縮，造成心肌衰竭，由此可判斷MYH6還可能與纖維收縮有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MYH6表達(dá)量在0～8 d顯著下調(diào)，其低表達(dá)可能會(huì)影響秦川牛背最長(zhǎng)肌肌肉纖維的再生速度，減少生成量，較難維持肌肉纖維骨架原有狀態(tài)，并影響了肌肉的收縮功能，增加肌肉的松弛度。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)MYH13的研究較少，主要集中在眼外肌和喉肌上，MYH13的表達(dá)可以使肌肉具有更強(qiáng)的收縮能力和較小的張力。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MYH13表達(dá)量在4～8 d顯著下調(diào)，可推斷出，其低表達(dá)可能會(huì)使肌肉收縮能力減弱、張力發(fā)生變化、肌肉松弛、質(zhì)地變軟、彈性減小、剪切力變小和嫩度變大。MYH15被認(rèn)為是一種慢性肌球蛋白，參與肌肉的收縮和細(xì)胞骨架的重塑，是哺乳動(dòng)物橫紋肌纖維收縮的動(dòng)力分子。MYH15表達(dá)量在0～8 d內(nèi)顯著下調(diào)，其低表達(dá)可能會(huì)降低秦川牛背最長(zhǎng)肌橫紋肌纖維的收縮能力，使得肌肉長(zhǎng)期處于舒張狀態(tài)。

MYL2、MYL12B和MYLPF為肌球蛋白輕鏈家族。MYL2參與調(diào)解肌原纖維的活性，對(duì)肌肉纖維的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用，通過(guò)增加肌球蛋白杠桿臂剛度和促進(jìn)肌球蛋白頭部擴(kuò)散，從而增加最大收縮力和收縮力的鈣敏感性。MYL2表達(dá)量在0～8 d顯著下調(diào)，低表達(dá)可能會(huì)影響新纖維的生成及損傷纖維的修復(fù)過(guò)程。MYLPF可磷酸化，屬于快速骨骼肌。劉瑞莉等在對(duì)布萊凱特黑牛與魯西黃牛背最長(zhǎng)肌中基因表達(dá)量的變化規(guī)律進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，MYLPF可能起調(diào)節(jié)骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的作用。實(shí)驗(yàn)中MYLPF表達(dá)量在0～4 d顯著下調(diào)。MYL12B通過(guò)磷酸化在調(diào)節(jié)平滑肌和非肌肉細(xì)胞收縮活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，還與胞質(zhì)分裂、受體封頂和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)，Park等通過(guò)基因敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺失后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生顯著變化，肌動(dòng)蛋白纖維的形成會(huì)被嚴(yán)重破壞，纖維突起和長(zhǎng)度明顯增加，MYL12B對(duì)于維持MYH9、MYH10和MYL6的穩(wěn)定性也至關(guān)重要，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞肌動(dòng)球蛋白的正常功能也具有一定影響。本實(shí)驗(yàn)中MYL12B表達(dá)量在0～4 d顯著上調(diào)。通過(guò)基因本體注釋?zhuān)╣ene ontology，GO）分析可以看出MYL2、MYL12B和MYLPF 3 種蛋白共同參與了細(xì)胞組分的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和肌球蛋白復(fù)合體條目，生物過(guò)程中的鈣離子結(jié)合條目。以上3 種蛋白在貯藏0～8 d出現(xiàn)不同程度調(diào)控，對(duì)受損纖維修復(fù)、纖維再生、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架產(chǎn)生不同程度影響，改變肌纖維原有的穩(wěn)定狀態(tài)，最終影響纖維骨架強(qiáng)度，使剪切力下降，嫩度上升。

3 結(jié) 論

4D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，貯藏0～8 d秦川牛背最長(zhǎng)肌所含結(jié)構(gòu)蛋白溶解度降低，蛋白質(zhì)碎片從膜和肌纖維網(wǎng)絡(luò)如肌纖維網(wǎng)絡(luò)中釋放出來(lái)，其中ACTN1、MYH9、MYLPF、MYL12B、MYH13、MYL2、MYH6、ACTC1、TNNI1、TNNI2、MYH15豐富度發(fā)生變化，相互作用強(qiáng)烈，在肌球蛋白結(jié)合、鈣離子結(jié)合、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合的肌原纖維組裝、骨骼肌組織發(fā)育、肌肉器官發(fā)育、橫紋肌組織發(fā)育過(guò)程等途徑調(diào)控細(xì)胞的生理狀態(tài)，進(jìn)一步說(shuō)明貯藏期間，構(gòu)成肌肉骨架的結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生降解，影響肌肉收縮，引起肌肉僵直，從而造成肌肉剪切力增大、MFI增加，對(duì)秦川牛肉貯藏中后期嫩度的提高具有一定影響。