竇磊娜，王戰(zhàn)輝，余文博，沈建忠

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物源食品安全檢測(cè)技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家獸藥安全評(píng)價(jià)中心，北京 100193）

食品是人類賴以生存和發(fā)展的必需品，食品安全與人類健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展密切相關(guān)。近年來(lái)，食源性致病菌已成為食品安全事件暴發(fā)的主要誘因，導(dǎo)致食品安全事件層出不窮。大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、空腸彎曲菌、蠟狀芽孢桿菌等引起的感染是許多嚴(yán)重疾?。ㄈ绶窝?、敗血癥、化膿性關(guān)節(jié)炎、皮膚病和炎癥性腸病）的最主要誘因，且發(fā)病率和死亡率極高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年15億腹瀉病例中70%是由于患者食用受食源性致病菌污染的食品引起的。在美國(guó)，由食源性致病菌感染引起的疾病每年約有7 600萬(wàn) 例，導(dǎo)致約325 000 例住院治療，5 000余例死亡，總醫(yī)療費(fèi)用達(dá)到371億 美元。我國(guó)僅2021年5月就發(fā)生食物中毒事件28 起，累計(jì)病患963 例，其中，微生物性食物中毒事件9 起，中毒患者593 例，分別占32.14%和61.58%，這對(duì)于患者、家庭和社會(huì)而言都是沉重的負(fù)擔(dān)。

鑒于食源性致病菌對(duì)食品安全和人類健康構(gòu)成的重大威脅，對(duì)其進(jìn)行有效的鑒定和檢測(cè)是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。平板法是食源性致病菌鑒定和檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，具有準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，然而該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，通常需要3～5 d才能確定病原微生物，已不能滿足當(dāng)前日益增長(zhǎng)的對(duì)食源性致病菌快速鑒定和檢測(cè)的需求。因此，近年來(lái)，眾多研究者開(kāi)發(fā)了大量具有獨(dú)特化學(xué)和物理特性的材料構(gòu)建新型食源性致病菌傳感器，其中量子產(chǎn)率高、光學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)和靈敏度高的熒光材料受到了廣泛關(guān)注。但是常規(guī)的熒光團(tuán)（如小分子熒光染料、熒光微球、量子點(diǎn)等）存在聚集導(dǎo)致淬滅（aggregate caused quenching，ACQ）效應(yīng)，極大地限制了其在生物分析中的標(biāo)記數(shù)量，導(dǎo)致生物檢測(cè)的信號(hào)低、靈敏度差以及易于發(fā)生光漂白。針對(duì)上述問(wèn)題，唐本忠院士課題組于2001年發(fā)現(xiàn)的一類新型熒光材料——聚集誘導(dǎo)發(fā)光（aggregate induced emission，AIE）材料有效地克服了這個(gè)問(wèn)題，為熒光傳感器的構(gòu)建提供了理想探針材料。AIE熒光團(tuán)（AIEgens）通常具有“螺旋槳狀”結(jié)構(gòu)，由于分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)的限制，它在稀溶液中無(wú)熒光，但在固態(tài)或聚集狀態(tài)下卻具有高強(qiáng)度熒光，可以在生物檢測(cè)中提供更低的背景和更可靠的信號(hào)。同時(shí)，AIE探針的應(yīng)用無(wú)需洗滌步驟，可節(jié)省操作時(shí)間及減少檢測(cè)樣品的損失。自AIE概念提出以來(lái)，其在致病菌鑒定和檢測(cè)領(lǐng)域得到了極大關(guān)注。眾多研究者利用AIE材料核心結(jié)構(gòu)結(jié)合不同的配體基團(tuán)，設(shè)計(jì)了高性能的AIEgens對(duì)致病菌進(jìn)行了高效鑒定和檢測(cè)。本文從AIEgens在食源性致病菌鑒定和檢測(cè)的應(yīng)用出發(fā)，對(duì)AIEgens進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與機(jī)理功能總結(jié)，并指出該領(lǐng)域未來(lái)可能的研究趨勢(shì)。

1 AIEgens在食源性致病菌鑒定中的應(yīng)用

1.1 AIEgens在食源性致病菌分型中的應(yīng)用

基于細(xì)菌細(xì)胞壁的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及組成的不同，革蘭氏染色法可將細(xì)菌分為G和G菌。而對(duì)G和G菌進(jìn)行更快速的區(qū)分可為后續(xù)細(xì)菌種類的進(jìn)一步鑒定提供基礎(chǔ)，縮小鑒定范圍。重要的是，由于G和G菌的致病機(jī)制（G菌：產(chǎn)生外毒素，G菌：產(chǎn)生內(nèi)毒素）完全不同，而且廣譜或窄譜抗生素在治療G和G菌感染的效果上存在差異，對(duì)G和G菌進(jìn)行準(zhǔn)確快速的區(qū)分可為后續(xù)治療藥物的選擇提供指導(dǎo)。

Hu Rong等利用G和G菌在肽聚糖組成上的不同設(shè)計(jì)了具有AIE性質(zhì)的探針，對(duì)G菌和G菌進(jìn)行鑒定。該探針將具有AIE活性且可以選擇性和穩(wěn)定結(jié)合脂滴的2-{[(二苯基亞甲基)肼基]甲基}苯酚（2-{[(diphenylmethylene)hydrazono]methyl}phenol，DPAS）衍生物與嗎啉和萘基單元相結(jié)合，形成2-{[(二苯基亞甲基)肼基]甲基}萘（2-{[(diphenylmethylene)hydrazono]methyl}naphthalene，M1-DPAN）（圖1A）。所合成的M1-DPAN與G菌結(jié)合時(shí)顯示強(qiáng)烈的熒光，且信號(hào)可持續(xù)24 h。隨后通過(guò)實(shí)驗(yàn)探究該AIEgen與細(xì)菌的相互作用過(guò)程時(shí)發(fā)現(xiàn)，M1-DPAN分子的嗎啉基團(tuán)可通過(guò)較強(qiáng)的疏水作用與G菌細(xì)胞壁上的脂磷壁酸結(jié)合，而微生物自身的電荷特性在探針識(shí)別過(guò)程中影響不大。因此，使用M1-DPAN進(jìn)行G菌的選擇性鑒定時(shí)，細(xì)胞壁的特定成分和結(jié)構(gòu)都起著重要的作用。Feng Guangxue等設(shè)計(jì)了一種以四苯乙烯（tetraphenylethylene，TPE）為核心結(jié)構(gòu)，萬(wàn)古霉素（vancomycin，Van）為配體（圖1B）且具有良好水溶性的AIEgen（AIE-2Van）。該探針的細(xì)菌分型機(jī)制主要是Van分子對(duì)G菌細(xì)胞壁上肽聚糖的特有序列具有特異性結(jié)合能力。此外由于其AIE特性，AIE-2Van與G菌特異性結(jié)合后顯示出強(qiáng)烈的熒光，可直接進(jìn)行G菌的肉眼可視化識(shí)別。Jiang Guoyu等以TPE為核心結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)并合成了帶有正電荷吡啶鎓側(cè)基的AIE探針TPEPyE（圖1C）。帶正電的TPEPyE可以通過(guò)靜電相互作用有效且特異性地與細(xì)菌表面帶負(fù)電的脂多糖結(jié)合并發(fā)生AIE效應(yīng)。此外，脂多糖烷基鏈與TPEPyE之間的疏水作用也可能對(duì)其高特異性起到一定的作用。利用這一特性，該探針可以用于區(qū)分G（金黃色葡萄球菌，無(wú)熒光信號(hào)）和G菌（大腸桿菌，黃綠色熒光信號(hào)）。綜上所述，在使用AIEgens對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型的研究中，研究者主要利用G和G菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成的差異，有針對(duì)性地在AIEgens的核心結(jié)構(gòu)上設(shè)計(jì)了不同的配體基團(tuán)，從而讓AIEgens可以特異性的結(jié)合G或G菌表面的關(guān)鍵生物分子，進(jìn)而達(dá)到對(duì)G菌與G菌分型的目的。

圖1 用于食源性致病菌分型的M1-DPAN（A）、AIE-2Van（B）及TPEPyE（C）結(jié)構(gòu)[28-30]Fig. 1 Structures of M1-DPAN (A), AIE-2Van (B) and TPEPyE (C) used for typing of food-borne pathogens[28-30]

1.2 AIEgens在食源性致病菌種類鑒定中的應(yīng)用

不同種類的致病菌在細(xì)菌結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性以及感染后的臨床癥狀等方面具有明顯差異，因此，對(duì)致病菌進(jìn)行種類鑒定可精確判斷污染的致病菌種類，對(duì)監(jiān)測(cè)食品以及環(huán)境污染狀況起到至關(guān)重要的作用。更重要的是，在臨床診斷中可為后續(xù)針對(duì)性的抗生素使用提供指導(dǎo)，對(duì)于個(gè)體感染患者的治療意義重大。

Zhou Chengcheng等開(kāi)發(fā)了一種基于TPE衍生物的傳感器陣列，用于食源性致病菌的種類區(qū)分。每個(gè)傳感器陣列均由含有3 個(gè)陽(yáng)離子銨基和不同疏水取代基的AIEgens組成（共合成7 個(gè)AIEgens，統(tǒng)稱為TPE-ARs，R代表不同的取代基），結(jié)構(gòu)如圖2A所示。這種結(jié)構(gòu)改造可靈活地調(diào)節(jié)lg（正辛醇/水分配系數(shù)）值，從而實(shí)現(xiàn)與不同食源性致病菌之間的靜電和疏水相互作用。7 個(gè)TPE-ARs可分為3 組，分別對(duì)G菌、G菌及真菌有不同的熒光響應(yīng)。借助線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）可實(shí)現(xiàn)對(duì)7 種病原菌的有效種類鑒定，甚至可以區(qū)分正常菌和耐藥菌，準(zhǔn)確率接近100%。Chen Wenwen等提出了一種可快速有效地區(qū)分8 種致病菌（包含2 種耐藥菌）的方法，該方法利用5 種AIEgens組成陣列，并結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析來(lái)進(jìn)行致病菌種類區(qū)分。5 種探針A1～A5均以TPE為核心結(jié)構(gòu)，通過(guò)連接不同的基團(tuán)使探針具有不同的電荷與疏水特征（圖2B）。不同細(xì)菌的表面結(jié)構(gòu)決定了其與探針相互作用時(shí)的差異，因此可利用上述特性進(jìn)行細(xì)菌種類的區(qū)分。通過(guò)流式細(xì)胞儀記錄熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)并采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和二次判別分析（quadratic discriminant analysis，QDA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。此外，由于細(xì)菌表面帶負(fù)電，帶正電的AIEgens和細(xì)菌有更強(qiáng)的結(jié)合特性。通過(guò)PCA模型對(duì)探針進(jìn)行篩選后，僅使用3 種甚至2 種帶正電AIEgens即可實(shí)現(xiàn)8 種致病菌的有效鑒定。Liu Guangjian等以TPE為核心結(jié)構(gòu)，利用醛基、羧基和季銨鹽基團(tuán)進(jìn)行功能化設(shè)計(jì)，共合成了6 種AIEgens（分別為TPEMA和TPEDA、TPEMC和TPEDC、TPEMN和TPEDN），結(jié)構(gòu)如圖2C所示。通過(guò)與8 種代表性細(xì)菌（包括單核細(xì)胞增生李斯特菌、霍亂弧菌和肺炎克雷伯菌等）一起進(jìn)行孵育，同時(shí)采用LDA分析方式，可實(shí)現(xiàn)致病菌的有效鑒定。之后通過(guò)比較細(xì)菌孵育前后AIE熒光強(qiáng)度的變化，探討了上述AIEgens對(duì)細(xì)菌鑒定的傳感機(jī)制。結(jié)果表明靜電與疏水相互作用在AIE材料和細(xì)菌之間的結(jié)合占主導(dǎo)，不同細(xì)菌表面的組成成分影響了其電荷與親/疏水特征，進(jìn)而導(dǎo)致AIE熒光強(qiáng)度在不同細(xì)菌間的差異。Shen Jianlei等從分析微生物裂解物的角度出發(fā)，首先從前期已報(bào)到的AIEgens文庫(kù)中篩選出可與微生物裂解物相互作用并發(fā)生AIE效應(yīng)的7 種AIEgens（圖2D），其中探針A1帶負(fù)電，探針A2～A4、A6和A7帶正電，探針A5為中性。隨后在微生物裂解物與AIEgens的反應(yīng)體系中引入氧化石墨烯（graphene oxide，GO），一方面與AIEgens共同競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合生物裂解物，使AIEgens的熒光恢復(fù)；另一方面還可以清除反應(yīng)體系中常見(jiàn)的蛋白質(zhì)與核酸，從而降低基質(zhì)影響。因此，將AIEgens與GO混合后加入微生物裂解物，同時(shí)結(jié)合PCA分析模型，可以對(duì)6 種微生物（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、釀酒酵母菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌）進(jìn)行精確的區(qū)分。

在將AIEgens用于細(xì)菌種類區(qū)分時(shí)，研究人員均合成了多種熒光發(fā)射波段不同的AIEgens作為光學(xué)信號(hào)檢測(cè)源；利用所合成AIEgens的電荷特性對(duì)細(xì)菌進(jìn)行標(biāo)記（主要利用了靜電和疏水相互作用）；同時(shí)結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，如LDA、PCA和QDA等對(duì)熒光強(qiáng)度、波長(zhǎng)等參數(shù)進(jìn)行了比較分析，最終實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同種類細(xì)菌的有效區(qū)分。

圖2 不同研究中用于食源性致病菌種類區(qū)分的AIEgens結(jié)構(gòu)Fig. 2 Structures of AIEgens used for species identification of food-borne pathogens in different study

1.3 AIEgens在食源性致病菌活性鑒定中的應(yīng)用

利用正常以及失活的細(xì)菌在形態(tài)、細(xì)胞完整性以及分泌物等方面的差異，可對(duì)食源性致病菌的活性進(jìn)行鑒定。快速精確地鑒定細(xì)菌活性可為評(píng)估飲用水和食品質(zhì)量、確定消毒及殺菌方法是否有效以及探索新的殺菌劑和開(kāi)發(fā)新的抗菌材料提供關(guān)鍵信息。

Zhao Engui等以TPE為核心結(jié)構(gòu)，結(jié)合硼酸（boric acid，BA）分子構(gòu)建了一種AIEgens，命名為TPE-2BA（圖3A）。該探針的細(xì)胞毒性低、熒光穩(wěn)定性強(qiáng)，可用作細(xì)菌長(zhǎng)期生存力測(cè)定。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知TPE-2BA是一種DNA染料，DNA雙螺旋形成的凹槽結(jié)構(gòu)起到了結(jié)合TPE-2BA的關(guān)鍵作用。因此，當(dāng)細(xì)菌失活后，表面膜結(jié)構(gòu)受損，從而打開(kāi)了TPE-2BA到達(dá)雙鏈DNA的通道，致使發(fā)生AIE效應(yīng)。該AIEgens對(duì)細(xì)菌活性鑒定的機(jī)理可能與商業(yè)化染料Hoechst 33342類似。在此基礎(chǔ)上，該課題組結(jié)合TPE-2BA和另一種AIEgens，命名為DCQA（圖3B），形成雙AIEgen體系對(duì)活細(xì)菌進(jìn)行定量。該DCQA探針可通過(guò)靜電作用與活細(xì)菌或者失活細(xì)菌結(jié)合。使用上述兩種染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行共染色。所有細(xì)菌均可以與DCQA結(jié)合發(fā)出紅色熒光，而只有細(xì)菌失活時(shí)可與TPE-2BA結(jié)合發(fā)出藍(lán)色熒光，之后利用酶標(biāo)儀測(cè)定不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度或者利用共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像可以對(duì)細(xì)菌活力以及活細(xì)菌所占細(xì)菌總量的比例進(jìn)行定量。上述研究均利用了失活細(xì)菌釋放核酸類物質(zhì)的特性，設(shè)計(jì)了AIEgens對(duì)核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，從而達(dá)到食源性致病菌活性鑒定的目的。表1從探針結(jié)構(gòu)和鑒定機(jī)理兩方面對(duì)AIEgens在食源性致病菌分型、種類鑒定及活性鑒定中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)。

圖3 用于食源性致病菌活性鑒定的TPE-2BA（A）及DCQA（B）結(jié)構(gòu)[35-36]Fig. 3 Structures of TPE-2BA (A) and DCQA (B) used for viability identification of food-borne pathogens[35-36]

表1 AIE材料在食源性致病菌分型、種類鑒定及活性鑒定中的應(yīng)用Table 1 Application of AIEgens in typing, species and viability identification of food-borne pathogens

2 AIEgens在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 AIEgens在單種食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1.1 致病性大腸桿菌

致病性大腸桿菌能夠引起人體胃腸道、尿道以及敗血型感染等疾病。腸出血性大腸桿菌O157:H7是大腸桿菌中致病性極強(qiáng)的血清型，其感染劑量極低，可引起急性劇烈腹痛和水樣腹瀉，數(shù)天后出現(xiàn)出血性腹瀉，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡。生的或未熟制的肉制品和乳制品是致病性大腸桿菌污染風(fēng)險(xiǎn)最高的食物。另外，食用受污染的水以及食物加工過(guò)程中的交叉污染，也是導(dǎo)致感染的重要原因。大腸桿菌O157:H7因污染食物（如菠菜、黃瓜等）在全球已經(jīng)引發(fā)了多次大規(guī)模的食源性疾病感染，導(dǎo)致大量患者死亡。因此，致病性大腸桿菌的快速檢測(cè)對(duì)保障食品安全以及人民身體健康具有重要意義。

Ajish等研究了葡萄糖基單丙烯酰胺（glucose based acrylamides，Glc-acryl）和雙丙烯酰胺（glucose based bisacrylamide，Glc-bis）（圖4A）的AIE性質(zhì)，并將其作為AIEgens進(jìn)行了細(xì)菌檢測(cè)應(yīng)用，該探針可與細(xì)菌凝集素以及菌毛中的FimH蛋白結(jié)合，因此，與大腸桿菌一起孵育時(shí)熒光強(qiáng)度與大腸桿菌濃度成正相關(guān)，使用該AIEgen對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)線性范圍為1.00×10～1.70×10cell/mL，檢測(cè)限（limit of detection，LOD）為7.30×10cell/mL。Li Yamin等設(shè)計(jì)了一種基于兩親性星形共聚物的AIEgen，命名為TPE-star-P，該探針以TPE為核心結(jié)構(gòu)，以兩親/陽(yáng)離子為配體，通過(guò)非共價(jià)作用力結(jié)合，該AIEgen與帶負(fù)電荷的細(xì)菌表面接觸后，靜電復(fù)合物的形成將限制TPE核心的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)，從而導(dǎo)致協(xié)同熒光的“Turn-On”。利用此現(xiàn)象對(duì)大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，探針在475 nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度與0～4.5×10CFU/mL范圍內(nèi)的大腸桿菌濃度呈線性關(guān)系，LOD約8.5×10CFU/mL。Zhao Long等結(jié)合電紡絲纖維的高接枝能力和高孔隙度結(jié)構(gòu)，在聚苯乙烯-馬來(lái)酸酐（polystyrene-co-maleic anhydride，PSMA）靜電紡絲上連接以TPE為核心結(jié)構(gòu)、三聚氯氰為配體的TPE-三聚氯氰（TPE-cyanuric chloride，TPEC）（圖4B）和甘露糖。靜電紡絲上的甘露糖含有大量羥基，可與大腸桿菌菌毛中的FimH蛋白特異性結(jié)合導(dǎo)致TPEC熒光“Turn-On”，從而使材料的熒光強(qiáng)度隨大腸桿菌濃度的增大而升高。使用該AIEgen對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)范圍為10～10CFU/mL。Zhao Jianliang等首先合成了具有AIE效應(yīng)的超支化聚酰胺（hyperbranched polyamide amine，H-PAMAM），然后，通過(guò)在H-PAMAM的外圍開(kāi)環(huán)聚合-氨基酸-羧基酐制備了納米工程肽接枝超支化聚合物（nanoengineered peptide-grafted hyperbranched polymers，NPGHPs）。利用熒光光譜探究NPGHPs與細(xì)菌之間的相互作用機(jī)理，結(jié)果表明AIEgen與細(xì)胞膜之間的靜電相互作用導(dǎo)致其在細(xì)胞膜表面快速聚集，熒光強(qiáng)度升高。隨后大量的NPGHPs滲透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，造成該材料在細(xì)胞有限空間內(nèi)的大量聚集，使得熒光強(qiáng)度急劇增加。之后，隨著細(xì)胞的破裂，熒光強(qiáng)度上升速度變慢?；谏鲜鲈韺?duì)大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明在大腸桿菌濃度為1×10～1×10CFU/mL時(shí)，NPGHPs的熒光強(qiáng)度與大腸桿菌濃度成正比，LOD為1×10CFU/mL。Zhang Ganggang等將已報(bào)道的AIEgen（TCBPE）（圖4C）與聚甲基丙烯酸甲酯/聚馬來(lái)酸酐十八醇酯通過(guò)“一鍋法”合成AIE熒光微球，隨后在其表面偶聯(lián)抗大腸桿菌O157:H7的單克隆抗體作為特異性識(shí)別分子，構(gòu)建夾心模式的側(cè)流免疫層析檢測(cè)體系。熒光強(qiáng)度與分析物的濃度成正比，配合熒光讀條儀可對(duì)大腸桿菌O157:H7進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法對(duì)大腸桿菌O157:H7檢測(cè)的LOD為3.98×10CFU/mL，該AIE熒光微球的檢測(cè)靈敏度比基于兩種商業(yè)化的熒光微球Ocean和Merk的層析方法分別高11 倍和7 倍。

圖4 用于檢測(cè)大腸桿菌的Glc-acryl（A1）和Glc-bis（A2）、TPEC（B）以及TCBPE（C）結(jié)構(gòu)[40-41,44]Fig. 4 Structures of Glc-acryl (A1) and Glc-bis (A2), TPEC (B) and TCBPE (C) used for detecting E. coli[40-41,44]

2.1.2 金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌（）是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，常寄生于人和動(dòng)物的皮膚、鼻腔、咽喉、腸胃和化膿瘡口中，也廣泛存在于空氣、污水等自然環(huán)境中。另外，金黃色葡萄球菌對(duì)高溫及高鹽有一定的耐受能力，在80 ℃以上的高溫環(huán)境下30 min才可以將其徹底殺死，最高可以耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的氯化鈉溶液。金黃色葡萄球菌本身不會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生危害，但它在繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的腸毒素卻是引發(fā)食物中毒的主要致病因子。在蛋白質(zhì)含量豐富、水分含量高、油脂較多同時(shí)含一定量淀粉的食物中易產(chǎn)生腸毒素，如乳品、蛋及其制品、肉制品等。一般情況下，人體攝入腸毒素污染的食物2～6 h后，會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐和腹瀉、腹痛、絞痛等急性胃腸炎癥狀。近年來(lái)金黃色葡萄球菌中毒的報(bào)道層出不窮，有數(shù)據(jù)表明，2003—2015年全國(guó)共報(bào)告1 050 起學(xué)校食源性疾病暴發(fā)事件，累計(jì)發(fā)病37 281 人次，其中由金黃色葡萄球菌感染所致的發(fā)病人數(shù)占20.93%。因此，需要對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)。

Naik等以TPE為核心結(jié)構(gòu)，采用磺酸鹽進(jìn)行功能化合成了兩種AIEgens，TPE-單磺酸鹽和TPE-雙磺酸鹽（圖5）用于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。兩個(gè)探針均帶負(fù)電，可與G菌外細(xì)胞壁中脂磷壁酸的氨基之間產(chǎn)生靜電相互作用，兩者相互結(jié)合后發(fā)生AIE效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TPE-雙磺酸鹽與TPE-單磺酸鹽相比具有更好的水溶性和更高的靈敏度。在金黃色葡萄球菌的檢測(cè)中，隨著細(xì)菌濃度的增加TPE-雙磺酸鹽的熒光強(qiáng)度逐漸增加。該探針對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)范圍為1.19×10～12.00×10CFU/mL，LOD約為1.19×10CFU/mL。該檢測(cè)策略可應(yīng)用于真實(shí)食品樣品的檢測(cè)，在金黃色葡萄球菌污染的蘋果汁中其熒光信噪比仍然較高。

圖5 用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的TPE-單磺酸鹽（A）和TPE-雙磺酸鹽（B）結(jié)構(gòu)[48]Fig. 5 Structures of TPE-mono-sulfonate (A) and TPE-di-sulfonate (B)used for detecting S. aureus[48]

在金黃色葡萄球菌中，感染性最強(qiáng)的是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant，MRSA），俗稱“超級(jí)細(xì)菌”，是臨床上常見(jiàn)的毒性較強(qiáng)的細(xì)菌，從發(fā)現(xiàn)至今MRSA感染幾乎遍及全球，已成為社區(qū)感染的主要病原菌之一。由于其對(duì)許多抗生素有多重耐藥性，對(duì)其感染的治療是臨床上十分棘手的難題之一。因此，對(duì)MRSA的快速檢測(cè)和控制尤其重要。

Gupta等設(shè)計(jì)了一類水溶性強(qiáng)且?guī)в薪饘倥浠ōh(huán)金屬化銥（III））與多聚吡啶的AIEgens。細(xì)菌表面的脂多糖和磷脂酸存在多種磷酸鹽/羧酸鹽基團(tuán)，因此兩者是高度帶負(fù)電的分子，而且兩種分子中均含有疏水區(qū)。所設(shè)計(jì)的陽(yáng)離子銥（III）復(fù)合物可通過(guò)靜電介導(dǎo)的疏水相互作用靶向細(xì)菌表面的脂多糖和磷脂酸區(qū)域，從而使銥（III）復(fù)合物分子間發(fā)生π-π堆疊作用，從而發(fā)生AIE現(xiàn)象?；谠撛韺?duì)MRSA進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，該探針可在5 min內(nèi)檢測(cè)出濃度僅為1.2 CFU/mL的MRSA。在較高M(jìn)RSA濃度（10CFU/mL）下，裸眼即可觀察到AIE熒光強(qiáng)度的變化。

2.1.3 單核細(xì)胞增生李斯特菌

單核細(xì)胞增生李斯特菌（），一種人畜共患的食源性致病菌，該菌在4 ℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。人主要通過(guò)食用未經(jīng)充分加熱的冷飲、蔬菜、乳品、肉及肉制品而造成感染。感染后可引起人類李斯特菌病，甚至引發(fā)可導(dǎo)致死亡的敗血病和腦膜炎，造成二至三成的感染者死亡，是最致命的食源性致病菌之一?？紤]到單核細(xì)胞增生李斯特菌對(duì)公共衛(wèi)生的巨大威脅，迫切需要快速準(zhǔn)確的方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。

Guo Yuanyuan等在牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）形成的納米顆粒中包裹1-(4-羥苯基)-1,2,2-三苯乙烯（1-(4-hydroxyphenyl)-1,2,2-triphenylethene，TPE-OH），隨后偶聯(lián)抗體合成復(fù)合納米（IgG-coated TPE-OH@BSA NPs），該材料由于TPEOH（圖6）在BSA中的聚集產(chǎn)生了明亮的AIE熒光信號(hào)，隨后合成了表面帶有核酸適配體的納米磁珠。利用上述兩種材料中特異性抗體與核酸適配體對(duì)李斯特菌的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的識(shí)別與磁分離。通過(guò)檢測(cè)磁分離上清中AIE熒光信號(hào)的強(qiáng)度可表征單增李斯特菌的濃度，該檢測(cè)方法對(duì)單增李斯特菌的檢測(cè)范圍為10～10CFU/mL，LOD低至10 CFU/mL，具有良好的選擇性。對(duì)加標(biāo)湖水與豬肉樣品的回收率范圍為95.37%～101.90%。

圖6 用于檢測(cè)單增李斯特菌的TPE-OH結(jié)構(gòu)[54]Fig. 6 Structure of TPE-OH used for detecting Listeria monocytogenes[54]

在上述單一食源性致病菌種類檢測(cè)的研究中，研究者大多利用細(xì)菌的電荷性質(zhì)及其表面的一些特定結(jié)構(gòu)來(lái)設(shè)計(jì)AIE探針，通過(guò)靜電相互作用或者基團(tuán)之間的相互結(jié)合達(dá)到細(xì)菌檢測(cè)的目的。然而，筆者認(rèn)為這種結(jié)合模式的特異性相對(duì)較弱，在大多數(shù)報(bào)道中也未針對(duì)AIEgens的細(xì)菌結(jié)合特異性進(jìn)行深入研究，僅有少部分研究將抗體作為特定細(xì)菌的特異性識(shí)別分子，所構(gòu)建的免疫分析方法可對(duì)細(xì)菌進(jìn)行特異性檢測(cè)。此外，上述檢測(cè)方法的靈敏度相對(duì)較低，LOD大多在10～10CFU/mL之間，與現(xiàn)有食源性致病菌檢測(cè)試劑盒（約10～10CFU/mL）相比還有一定提升空間。

2.2 AIEgens在多種食源性致病菌同時(shí)檢測(cè)中的應(yīng)用

食源性致病菌種類繁多，食品中豐富的營(yíng)養(yǎng)成分可為不同種類致病菌的持續(xù)生長(zhǎng)、繁殖和代謝提供良好的生存環(huán)境，進(jìn)一步導(dǎo)致食品中的多種食源性致病菌菌株并存。因此，同時(shí)檢測(cè)食品中的多種食源性致病菌對(duì)降低檢測(cè)成本，提升檢測(cè)效率以及指導(dǎo)臨床的聯(lián)合用藥具有重要意義，已成為當(dāng)前國(guó)際食品安全研究的熱點(diǎn)。

Kang等將陽(yáng)離子聚乙烯吡咯烷酮（poly(vinylpyrrolidone)，PVP）與磷酸功能化的2-羥基查耳酮（2-hydroxychalcone，HCAP）結(jié)合形成了具有AIE效應(yīng)的探針HCAP-PVP（圖7A），其在溶液中具有極好的溶解性，溶解可產(chǎn)生黃綠色熒光。而部分細(xì)菌可表達(dá)主要位于細(xì)菌表面周質(zhì)區(qū)域的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）。當(dāng)探針與這一類細(xì)菌混合后，細(xì)菌表達(dá)的ALP可使HCAP-PVP探針上的磷酸基團(tuán)被裂解，從而激發(fā)探針的AIE效應(yīng)，其熒光由黃綠色變?yōu)榧t色?；谠撛硗瑫r(shí)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，該探針對(duì)兩種菌的檢測(cè)范圍均為10～10CFU/mL。Dong Zhenzhen等將低分子質(zhì)量殼聚糖（chitooligosaccharide，COS）作為主鏈，將抗菌多肽（antimicrobial peptides，AMP）連接到其氨基上，構(gòu)建了COS-AMP探針（圖7B）。一方面該探針中的COS本身具有AIE效應(yīng)；另一方面，COS-AMP具有與細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖組分類似的結(jié)構(gòu)，可促使探針通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞壁?；谔结樈Y(jié)構(gòu)與細(xì)菌細(xì)胞壁組分類似的原理以及探針的AIE效應(yīng)，同時(shí)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行定量分析。檢測(cè)結(jié)果顯示，該探針對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的檢測(cè)范圍均為1.25×10～5.00×10CFU/mL，LOD均為1.25×10CFU/mL。Chen Shuai等首先合成了帶正電的親脂性分子，然后連接以TPE為核心結(jié)構(gòu)、羧酸酯為配體的四(4-羧基苯)乙烯（tetrakis(4-carboxyphenyl)ethylene，TPE-(COOH)）（圖7C），構(gòu)成TPE/Q-PGEDA-OP納米探針，該復(fù)合物探針在溶液中具有強(qiáng)烈的熒光。在加入待檢測(cè)細(xì)菌后，細(xì)菌表面的負(fù)電將與探針的陽(yáng)離子配基產(chǎn)生靜電相互作用，致使TPE-(COOH)從復(fù)合探針中釋放，從而降低熒光強(qiáng)度?；谠撛硗瑫r(shí)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，該探針對(duì)兩種菌的檢測(cè)范圍均為10～10CFU/mL，LOD均為10CFU/mL。與上述研究相似的是，Li Qiaoying等在介孔二氧化硅納米球表面負(fù)載了TPE羧酸酯衍生物（TPE-(COOH)）（圖7C）、乙二胺修飾的聚甲基丙烯酸甘油酯（polyglycerol methacrylate，PGEDA）等多種化合物。當(dāng)細(xì)菌與該納米材料相互作用時(shí)，細(xì)菌表面陰離子與該材料表面帶有陽(yáng)離子的PGEDA結(jié)合。該過(guò)程會(huì)影響PGEDA與TPE-(COOH)之間的相互作用，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的減弱?；诖嗽恚瑢?duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，該探針對(duì)大腸桿菌的LOD為2.5×10CFU/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的LOD為5.0×10CFU/mL。

圖7 用于同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)菌所用的AIEgens結(jié)構(gòu)[55-58]Fig. 7 Structures of AIEgens used for simultaneous detection of multiple bacteria[55-58]

與2.1節(jié)中的檢測(cè)原理類似，在對(duì)多種致病菌進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)時(shí)，研究者利用的結(jié)合原理仍然是帶電性質(zhì)或者是一類細(xì)菌均具有的特性，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的AIEgens可與不同濃度的致病菌結(jié)合后發(fā)生熒光強(qiáng)度的變化，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)多種食源性致病菌的同時(shí)檢測(cè)。表2從探針結(jié)構(gòu)和檢測(cè)性能兩方面對(duì)AIEgens在食源性致病菌檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了匯總。

表2 AIE材料在食源性致病菌檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用匯總Table 2 Application of AIEgens in the detection of food-borne pathogens

3 結(jié) 語(yǔ)

基于優(yōu)異的光物理特性，近10 年來(lái)，AIE材料與傳感技術(shù)的結(jié)合推動(dòng)了一系列用于食源性致病菌鑒定和檢測(cè)的熒光傳感器的發(fā)展。與傳統(tǒng)的熒光鑒定或檢測(cè)方法相比，以AIE材料為探針的檢測(cè)方法具有更高的靈敏度和更好的精度。本綜述在文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上，對(duì)AIE材料在食源性致病菌鑒定和檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)。首先在食源性致病菌的鑒定中，研究者主要利用致病菌的電荷或表面基團(tuán)特性，以TPE為母體結(jié)構(gòu)，利用不同基團(tuán)進(jìn)行修飾構(gòu)建功能各異的AIEgens，隨后通過(guò)靜電和疏水相互作用，將AIEgens與致病菌結(jié)合，結(jié)合共聚焦熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法（如LDA、PCA和QDA等）對(duì)成像結(jié)果或者熒光強(qiáng)度、波長(zhǎng)等參數(shù)進(jìn)行比較分析，實(shí)現(xiàn)了對(duì)食源性致病菌的分型、種類鑒定及活性鑒定。

在食源性致病菌的檢測(cè)方面，研究者利用AIE母體結(jié)構(gòu)結(jié)合多種配體，如羧基、季銨鹽、Van等基團(tuán)形成AIEgens，或者利用具有AIE特性的其他材料與食源性致病菌結(jié)合，構(gòu)建熒光探針，達(dá)到食源性致病菌檢測(cè)的目的。目前利用AIE材料對(duì)食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè)的研究相對(duì)較少，總體而言，利用AIE材料進(jìn)行食源性致病菌檢測(cè)時(shí)，其靈敏度僅能與傳統(tǒng)檢測(cè)手段的LOD持平或稍有提升。大部分文獻(xiàn)所報(bào)道的LOD在10～10CFU/mL。因此，未來(lái)研究可從以下幾方面著手提升其對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)靈敏度：1）設(shè)計(jì)具有更高光學(xué)性能的AIEgens，如設(shè)計(jì)長(zhǎng)波長(zhǎng)發(fā)射的AIEgens；2）結(jié)合有效的前處理，提升致病菌從培養(yǎng)基等基質(zhì)中的分離效果，從而降低檢測(cè)信號(hào)背景、提升信噪比；3）將AIEgens與特異性生物識(shí)別材料，如抗體、適配體等結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，提升檢測(cè)的特異性。

本綜述是對(duì)AIE材料在食源性致病菌鑒定和檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行的專門分析與總結(jié)，有助于研究人員更好地了解AIE材料在食源性致病菌鑒定和檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀，從而促進(jìn)AIE材料在此領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展。