魏甲園，邾 倩，楊亞星，申 明

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095)

顆粒細(xì)胞的活躍增殖是確保卵泡正常發(fā)育的重要前提之一。然而，隨著卵泡發(fā)育的進(jìn)行，壁層顆粒細(xì)胞的G0/G1比例增多，顆粒細(xì)胞增殖能力逐漸降低。另一方面，由于卵泡中毛細(xì)血管的分布局限于卵泡表面膜層，卵泡發(fā)育過程必然會(huì)導(dǎo)致卵泡內(nèi)部缺血缺氧狀態(tài)的加劇。進(jìn)一步研究證實(shí)，卵泡內(nèi)部低氧是造成顆粒細(xì)胞增殖活性下降(G0/G1阻滯)的重要原因。前期在豬卵泡中收集G0/G1阻滯高組和低組的顆粒細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)差異性表達(dá)的基因。功能富集分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)的基因絕大多數(shù)聚集在DNA損傷相關(guān)功能及通路上。然而，目前尚未見報(bào)道DNA氧化損傷是否參與低氧引起的顆粒細(xì)胞增殖阻滯。

本研究利用氯化鈷(CoCl)誘導(dǎo)豬卵泡顆粒細(xì)胞產(chǎn)生化學(xué)性缺氧，并在此基礎(chǔ)上添加抗氧化劑GSH，比較缺氧組與抗氧化劑處理組顆粒細(xì)胞增殖活性、ROS水平、DNA氧化損傷(Oxo-8-G水平)、γH2AX蛋白活性變化，研究化學(xué)低氧誘導(dǎo)的DNA氧化損傷對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胰蛋白酶、FBS胎牛血清(美國Gibco公司)，谷胱甘肽(GSH)、CoCl(美國Sigma公司)、CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué))、DCFA-DC探針(碧云天生物技術(shù))、FITC熒光小鼠單克隆抗體(Abcam公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及試驗(yàn)分組

按實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法分離和培養(yǎng)豬卵泡顆粒細(xì)胞。簡要步驟為：從屠宰場采集商品肉豬的卵巢，放在裝有37 ℃無菌生理鹽水的保溫桶中2 h內(nèi)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室。使用含有慶大霉素的37 ℃生理鹽水和37 ℃的75% 乙醇交替洗滌卵巢，然后用10 mL注射器抽取卵泡液及顆粒細(xì)胞，1 200×離心5 min去除卵泡液，用PBS洗滌顆粒細(xì)胞兩次，1 000×g離心5 min去除PBS后，用完全培養(yǎng)基在37 ℃、5%、CO條件下培養(yǎng)于含15%胎牛血清的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h左右進(jìn)行第一次消化傳代。正常對(duì)照組為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h；CoCl誘導(dǎo)缺氧處理組給予終濃度200 μmol·LCoCl的培養(yǎng)基進(jìn)行模擬低氧培養(yǎng)12 h；單獨(dú)GSH處理組加入濃度為2 mmol·L的GSH進(jìn)行處理12 h；GSH+CoCl聯(lián)合處理組，加入200 μmol·LCoCl和2 mmol·L的GSH聯(lián)合處理細(xì)胞后培養(yǎng)12 h。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活力

48孔板每孔加入50 μL CCK-8溶液，并置于37 ℃的5% CO的培養(yǎng)箱中孵育12 h，再將48孔板置于酶標(biāo)儀中，測定波長為450 nm時(shí)各孔液體的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞的增殖活力。

1.4 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的測定

用PBS洗滌細(xì)胞1次，12孔板中每孔加1 μL DCFH-DA探針溶于培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中孵育20 min，加入PBS洗3次，除去多余探針，加入DAPI染色細(xì)胞核10 min，加入1 mL PBS洗5遍，每次5 min，共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 ELISA法檢測Oxo-8-G水平

用冰冷甲醇固定5 min，PBS洗滌3次；用0.1% TritonX-100透化細(xì)胞30 min，PBS洗滌3次，每次5 min；室溫用1% BSA封閉1 h，PBS洗3次，每次5 min；室溫用DNA/RNA抗體染色細(xì)胞核10 min，PBS洗3次，每次5 min；共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 蛋白免疫印跡法檢測γH2AX水平

用RIPA細(xì)胞裂解液提取豬卵泡顆粒細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后取25 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜并封閉，用稀釋后的兔一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3次后，放入二抗在室溫下?lián)u床孵育1 h，再次TBST洗3次后，添加顯色液，于ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像，并用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，TUBA1A作為內(nèi)參蛋白。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad PRISM 9.0軟件分析，當(dāng)2個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行比較時(shí)使用檢驗(yàn)進(jìn)行分析，當(dāng)3個(gè)或者更多試驗(yàn)組進(jìn)行比較時(shí)使用ANOVA進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 CoCl2對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞增殖活力的影響

在體內(nèi)和體外研究中，CoCl作為一種低氧模擬劑被廣泛使用。本研究采用200 μmol·LCoCl分別培養(yǎng)豬卵泡顆粒細(xì)胞12和24 h。圖1顯示了CCK-8檢測豬卵泡顆粒細(xì)胞增殖活力的變化。與對(duì)照組相比，CoCl處理12 h組和24 h組細(xì)胞增殖活力均極顯著下降(<0.000 1)。結(jié)果表明，CoCl介導(dǎo)的化學(xué)低氧可抑制豬卵泡顆粒細(xì)胞增殖。根據(jù)圖1顯著性水平，選取200 μmol·LCoCl處理12 h這一試驗(yàn)條件用于后續(xù)試驗(yàn)。采用Western blot進(jìn)一步檢測CoCl處理后低氧標(biāo)記物-低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)CoCl能極顯著提高顆粒細(xì)胞HIF-1α蛋白累積(<0.000 1，圖2)。

A. CoCl2處理12 h細(xì)胞增殖活力檢測；B. CoCl2處理24 h細(xì)胞增殖活力檢測。****. P<0.000 1，下同A.Detection of proliferation activity in granulosa cells treated with cobalt chloride for 12 h; B. Detection of proliferation activity in granulosa cells treated with cobalt chloride for 24 h. ****. P<0.000 1,the same as below圖1 CoCl2處理對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞增殖活力的影響Fig.1 Effects of cobalt chloride treatment on proliferation activity of porcine follicular granulosa cells

A.CoCl2處理12 h后顆粒細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)的Western blot檢測圖；B.HIF-1α的相對(duì)表達(dá)量，HIF-1α相對(duì)表達(dá)水平采用ImageJ軟件的灰度分析功能進(jìn)行量化A. The Western blot analysis of HIF-1α protein levels in granulosa cells treated with cobalt chloride for 12 h; B. The relative expression of HIF-1α quantified by densitometric analysis using ImageJ software圖2 CoCl2處理對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of cobalt chloride treatment on expression of HIF-1α protein in porcine follicular granulosa cells

2.2 CoCl2對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞ROS水平的影響

圖3顯示了ROS熒光探針檢測200 μmol·L的CoCl處理12 h下豬卵泡顆粒細(xì)胞ROS水平變化。與對(duì)照組相比，CoCl處理組ROS水平極顯著上升(<0.000 1)。檢測結(jié)果表明，CoCl誘導(dǎo)的化學(xué)性缺氧可導(dǎo)致豬卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高。

A.CoCl2處理12 h后熒光檢測ROS水平；B.CoCl2處理12 h后各處理組平均熒光強(qiáng)度A. The fluorescent imaging of ROS detection in granulosa cells after 12 h of CoCl2 treatment; B. The ROS level was assessed by analyzing the average fluorescence intensity in each treatment group after 12 h of CoCl2 treatment圖3 CoCl2處理對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.3 Effects of cobalt chloride treatment on ROS levels in porcine follicular granulosa cells

2.3 CoCl2對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)γH2AX蛋白表達(dá)的影響

組蛋白2A變異體H2AX是細(xì)胞中感應(yīng)DNA損傷最敏感的分子，損傷發(fā)生后可以迅速磷酸化產(chǎn)生γH2AX，因此可用來反映DNA損傷斷裂程度。Western blot檢測結(jié)果(圖4A)顯示，與對(duì)照組相比，CoCl處理組γH2AX表達(dá)極顯著升高(<0.000 1)。檢測結(jié)果表明，CoCl誘導(dǎo)的化學(xué)性缺氧可促進(jìn)豬卵泡顆粒細(xì)胞γH2AX蛋白的表達(dá)。

A. CoCl2處理12 h后顆粒細(xì)胞中γH2AX蛋白表達(dá)的Western blot檢測圖；B. γH2AX的相對(duì)表達(dá)量，γH2AX相對(duì)表達(dá)水平采用ImageJ軟件的灰度分析功能進(jìn)行量化A. The Western blot analysis of γH2AX protein levels in granulosa cells treated with cobalt chloride for 12 h; B. The relative expression of γH2AX quantified by densitometric analysis using ImageJ software圖4 CoCl2處理對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)γH2AX蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of cobalt chloride treatment on expression of γH2AX protein in porcine follicular granulosa cells

2.4 CoCl2對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞DNA氧化損傷的影響

圖5顯示了FITC熒光Anti-DNA/RNA Damage抗體檢測200 μmol·L的CoCl處理12 h豬卵泡顆粒細(xì)胞Oxo-8-G水平變化，通過檢測細(xì)胞質(zhì)RNA中的Oxo-8-G水平來反映DNA氧化損傷情況。與對(duì)照組相比，缺氧12 h后Oxo-8-G水平極顯著上升(<0.000 1)。檢測結(jié)果表明，CoCl誘導(dǎo)的化學(xué)性缺氧可導(dǎo)致豬卵泡顆粒細(xì)胞DNA 損傷(Oxo-8-G和 DNA 斷裂的積累)。

A. CoCl2處理12 h后熒光檢測Oxo-8-G水平；B. 各處理組Oxo-8-G熒光水平量化統(tǒng)計(jì)，采用ImageJ軟件分析細(xì)胞中Oxo-8-G的平均熒光強(qiáng)度A. The fluorescence detection of Oxo-8-G level in granulosa cells after 12 h of CoCl2 treatment; B. The average fluorescence intensity in each treatment group was assessed using ImageJ software圖5 CoCl2處理對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)Oxo-8-G水平的影響Fig.5 Effects of cobalt chloride treatment on Oxo-8-G levels in porcine granulosa follicular cells

2.5 CoCl2處理基礎(chǔ)上抑制DNA氧化損傷對(duì)豬卵泡細(xì)胞增殖活力的影響

為了進(jìn)一步探究缺氧引起的DNA氧化損傷機(jī)制，本研究在CoCl處理基礎(chǔ)上添加抗氧化物GSH處理豬卵泡顆粒細(xì)胞。試驗(yàn)組已研究出豬卵泡顆粒細(xì)胞的最適GSH濃度為2 mmol·L。圖6顯示了CCK-8檢測豬卵泡顆粒細(xì)胞增殖活力的變化，與CoCl處理組相比，在CoCl處理基礎(chǔ)上添加抗氧化物GSH處理 12 h后，細(xì)胞增殖水平極顯著上升(<0.000 1)。結(jié)果表明，在模擬缺氧環(huán)境的基礎(chǔ)上加入抗氧化劑GSH處理后恢復(fù)了細(xì)胞增殖活力。圖7顯示了ROS熒光探針檢測豬卵泡顆粒細(xì)胞ROS水平變化，與CoCl處理組相比，在CoCl處理基礎(chǔ)上添加抗氧化物GSH處理12 h后，ROS水平極顯著下降(<0.000 1)。結(jié)果表明，在模擬缺氧環(huán)境的基礎(chǔ)上加入抗氧化劑GSH處理后可降低ROS表達(dá)。Western blot檢測結(jié)果(圖4A，圖8)顯示，與CoCl處理組相比，在CoCl處理基礎(chǔ)上添加抗氧化物GSH處理12 h后 γH2AX表達(dá)極顯著降低(<0.000 1)。結(jié)果表明，在模擬缺氧環(huán)境的基礎(chǔ)上加入抗氧化物GSH處理后能夠降低γH2AX蛋白的表達(dá)。圖9顯示了FITC熒光Anti-DNA/RNA Damage抗體檢測豬卵泡顆粒細(xì)胞Oxo-8-G水平變化，與CoCl處理組相比，在CoCl處理基礎(chǔ)上添加抗氧化物GSH處理12 h后，Oxo-8-G水平極顯著下降(<0.000 1)，結(jié)果表明，在模擬缺氧環(huán)境的基礎(chǔ)上加入抗氧化物GSH處理后能夠挽救DNA損傷。

A. CoCl2和GSH處理12 h細(xì)胞增殖活力檢測；B. CoCl2和GSH處理24 h細(xì)胞增殖活力檢測A. Detection of proliferation activity in granulosa cells treated with CoCl2 and/or GSH for 12 h； B. Detection of proliferation activity in granulosa cells treated with CoCl2 and/or GSH for 24 h圖6 GSH處理對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞增殖活力的影響Fig.6 Effects of GSH treatment on proliferation activity of porcine follicular granulosa cells

A. CoCl2和GSH處理12 h后熒光檢測ROS水平；B. 各處理組ROS熒光水平量化統(tǒng)計(jì)，采用ImageJ軟件分析細(xì)胞中ROS的平均熒光強(qiáng)度A. The fluorescent imaging of ROS detection in granulosa cells following 12 h of CoCl2 and/or GSH treatment; B. The average fluorescence intensity in each treatment group was calculated using ImageJ software圖7 GSH處理對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.7 Effects of GSH treatment on ROS levels in porcine follicular granulosa cells

圖8 GSH處理對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)γH2AX蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effects of GSH treatment on expression of γH2AX protein in porcine follicular granulosa cells

A. CoCl2和GSH處理12 h后熒光檢測Oxo-8-G水平；B. 處理12 h后各處理組平均熒光強(qiáng)度A. The fluorescence detection of Oxo-8-G levels after 12 h of CoCl2 and/or GSH treatment; B. The average fluorescence intensity of each treatment group after 12 h of treatment圖9 GSH處理對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)Oxo-8-G水平的影響Fig.9 Effects of GSH treatment on Oxo-8-G levels in porcine granulosa follicular cells

3 討 論

3.1 低氧抑制顆粒細(xì)胞增殖活性的潛在途徑

卵泡發(fā)育是雌性動(dòng)物繁殖的基礎(chǔ)，而顆粒細(xì)胞的活躍增殖是保證卵泡生長發(fā)育的前提條件。然而，卵泡發(fā)育過程伴隨顆粒細(xì)胞增殖活力的逐漸降低。揭示顆粒細(xì)胞增殖調(diào)控規(guī)律對(duì)于認(rèn)清卵泡發(fā)育的機(jī)制具有重要意義。細(xì)胞增殖是一個(gè)高度耗能的過程，細(xì)胞群體的快速增殖會(huì)加速氧氣消耗，導(dǎo)致低氧環(huán)境的出現(xiàn)。另一方面，在哺乳動(dòng)物卵巢中，卵泡毛細(xì)血管分布于卵泡壁外側(cè)的內(nèi)膜細(xì)胞層，而卵泡內(nèi)部的顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞則處于無血管缺氧環(huán)境中。隨著卵泡發(fā)育變大，內(nèi)層顆粒細(xì)胞與卵泡壁的距離越來越遠(yuǎn)，但卵泡血管系統(tǒng)始終無法穿透基底膜進(jìn)入顆粒細(xì)胞，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞缺氧問題更加突出。有研究表明，卵泡直徑越大，卵泡內(nèi)部O濃度就越低。這提示，在卵泡發(fā)育過程中，顆粒細(xì)胞可能面臨低氧應(yīng)激。前期結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，低氧會(huì)造成顆粒細(xì)胞周期發(fā)生G0/G1阻滯，導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性下降。然而低氧抑制顆粒細(xì)胞增殖的機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。本研究利用CoCl介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞化學(xué)低氧模型，通過檢測抗氧化物GSH處理前后細(xì)胞增殖、ROS水平、DNA氧化損傷等相關(guān)指標(biāo)，揭示DNA氧化損傷可能是低氧誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞增殖阻滯的潛在途徑。

3.2 利用CoCl2成功建立了顆粒細(xì)胞化學(xué)低氧模型

物理性缺氧常在充有氮?dú)馊毖跹b置及常氧裝置中完成，因需要嚴(yán)格檢測氧濃度，技術(shù)性要求高，所以其運(yùn)用受到限制，化學(xué)性缺氧則操作方便，CoCl為常用的化學(xué)性低氧模擬劑。其作用機(jī)理在于Co與O結(jié)合后，可阻斷氧感受器中Fe與氧結(jié)合，使細(xì)胞在不缺氧的條件下產(chǎn)生缺氧錯(cuò)覺，最終達(dá)到常氧下物理誘導(dǎo)低氧類似的效果。CoCl可誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生化學(xué)性缺氧損傷，但不同細(xì)胞對(duì)CoCl誘導(dǎo)缺氧的敏感性有所不同。本研究在體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細(xì)胞中添加CoCl，通過濃度梯度試驗(yàn)，前期篩選到200 μmol·LCoCl是引起顆粒細(xì)胞增殖活力出現(xiàn)極顯著抑制的最低濃度。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CoCl處理體外細(xì)胞的濃度一般在50～400 μmol·L范圍，200 μmol·L屬于細(xì)胞試驗(yàn)常用的處理濃度。因此采用200 μmol·L作為CoCl的最適濃度處理濃度。為確認(rèn)CoCl是否產(chǎn)生低氧效果，對(duì)顆粒細(xì)胞中的低氧指標(biāo)進(jìn)行測定。HIF-1α屬于低氧誘導(dǎo)因子(HIF)家族成員，是介導(dǎo)低氧反應(yīng)的核心調(diào)控因子。在常氧條件下，HIF-1α通過泛素-蛋白酶體途徑迅速降解；只有在低氧環(huán)境中，HIF-1α蛋白才能維持穩(wěn)定。因此根據(jù)HIF-1α蛋白表達(dá)水平即可判斷組織、細(xì)胞是否缺氧。通過測定HIF-1α的蛋白累積情況(圖2)，進(jìn)一步證實(shí)CoCl處理能顯著增強(qiáng)顆粒細(xì)胞中的低氧應(yīng)答反應(yīng)，說明利用CoCl化學(xué)低氧模型能成功模擬顆粒細(xì)胞的低氧狀態(tài)。

3.3 CoCl2會(huì)增加顆粒細(xì)胞細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，誘導(dǎo)DNA氧化損傷

研究表明，低氧條件會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇(ROS)。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞ROS產(chǎn)生速度超過其清除速度，過量累積的ROS會(huì)攻擊DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子，造成細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。就DNA而言，氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致包括DNA鏈斷裂、DNA位點(diǎn)突變、DNA雙鏈畸變、原癌基因與腫瘤抑制基因突變等形式的DNA損傷。DNA損傷過程中會(huì)形成某些特定的損傷產(chǎn)物(如γH2AX、Oxo-8-G等)，因此通過測定這些DNA損傷標(biāo)記物的水平可反映DNA損傷情況。本研究發(fā)現(xiàn)，CoCl處理顯著增加了豬卵泡顆粒細(xì)胞中ROS水平，并導(dǎo)致γH2AX蛋白的大量累積。而添加抗氧化劑GSH阻斷ROS生成，可顯著降低γH2AX蛋白水平。同樣，GSH能顯著抑制CoCl處理后DNA氧化損傷標(biāo)記物Oxo-8-G的累積。上述結(jié)果表明，CoCl介導(dǎo)的化學(xué)性缺氧能誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激狀態(tài)，繼而誘發(fā)DNA氧化損傷。

3.4 DNA氧化損傷與顆粒細(xì)胞增殖阻滯的關(guān)系

DNA損傷會(huì)激活細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)，阻斷細(xì)胞周期的運(yùn)行，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，CoCl誘導(dǎo)的化學(xué)性缺氧會(huì)導(dǎo)致豬卵泡顆粒細(xì)胞增殖活性降低，該過程伴隨細(xì)胞ROS水平升高，DNA損傷增加及DNA氧化損傷水平的升高。而在CoCl處理基礎(chǔ)上添加GSH以阻斷ROS的產(chǎn)生，可顯著降低DNA氧化損傷水平，并恢復(fù)顆粒細(xì)胞增殖活力。該結(jié)果表明，CoCl造成的豬顆粒細(xì)胞增殖阻滯與DNA氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)，而其中涉及的信號(hào)通路和效應(yīng)分子仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究證明，DNA氧化損傷可能參與低氧誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞增殖阻滯。該發(fā)現(xiàn)從DNA氧化損傷的角度解析低氧對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的調(diào)控作用及機(jī)制，這對(duì)于認(rèn)清低氧影響卵泡發(fā)育的基本規(guī)律、豐富和完善繁殖學(xué)理論具有重要意義。另一方面，研究結(jié)果揭示，添加抗氧化劑GSH可以緩解顆粒細(xì)胞中的DNA氧化損傷，解除低氧狀態(tài)下顆粒細(xì)胞增殖阻滯狀態(tài)，這為后續(xù)開發(fā)促卵泡發(fā)育的技術(shù)與措施提供了試驗(yàn)證據(jù)。