司建萍，段瑞君，周嘉誠，馬生蓮，王改妮

(青海大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，西寧 810016)

油菜素類固醇(brassinosteroids, BRs)是一種廣泛存在的天然植物激素，對植物的生長發(fā)育必不可少，且密切參與植物的抗逆調(diào)節(jié)過程(旱、寒、蟲、病、重金屬污染等)。在農(nóng)作物中，BRs參與控制多個重要的農(nóng)藝性狀，如開花時間、植株形態(tài)結(jié)構(gòu)、種子產(chǎn)量以及脅迫耐受等，通過改變內(nèi)源BRs水平或信號通路，抑或外源施加激素或激素抑制劑等方式，都有望增強(qiáng)植物的抗逆性，改善農(nóng)藝性狀，提高作物產(chǎn)量。在水稻中，內(nèi)源油菜素內(nèi)酯的水平變化不僅改變?nèi)~片直立角度，還直接影響花粉和種子的發(fā)育[1-2]。此外，外源施加人工合成的BRs能夠提高亞麻與番茄幼苗的抗旱性[3-4]，增強(qiáng)玉米和西瓜的耐鹽性[5-6]，降低冷害對桃果實(shí)的傷害[7]。

目前發(fā)現(xiàn)的BRs已超過70種，但其中僅有終產(chǎn)物油菜素內(nèi)酯(brassinolide，BL)和油菜素甾酮(castasterone，CS)具有生物活性[8]?；钚訠Rs的水平受到其合成與分解的雙重調(diào)節(jié)。在擬南芥中，目前發(fā)現(xiàn)6個BRs失活相關(guān)基因：SOB7、BAS1、AtUGT73C5、AtUGT73C6、AtST4a和AtST1，通過羥基化、糖基化或磺基化方式使BRs失活，其中BAS1編碼蛋白作為C-26羥化酶催化BL和CS的失活[9-10]。

自1999年在擬南芥中發(fā)現(xiàn)BAS1基因以來[9]，科研工作者陸續(xù)在不同植物中發(fā)現(xiàn)其同源基因：如胡蘿卜中的DcBAS1，DcBAS1能夠催化CS和BL的C-26發(fā)生羥化反應(yīng)，該基因在擬南芥中異源過表達(dá)后植株表現(xiàn)出為矮化、葉片卷曲、葉柄縮短等典型的BR缺失表型，而且纖維素的合成受到抑制[11]。在番茄中發(fā)現(xiàn)2個BAS1同源基因：CYP734A7和CYP734A8，它們與BAS1 氨基酸序列的相似性分別為60%與69%。實(shí)驗(yàn)證實(shí)CYP734A7能夠催化CS向 26-OH-CS的轉(zhuǎn)化[12]，CYP734A8的功能尚不明確。2006年，在水稻中發(fā)現(xiàn)第一個BR失活基因OsCYP734A6，其T-DNA插入突變體表現(xiàn)出類似BRs處理的表型，同時內(nèi)源BRs合成基因OsDWARF4下調(diào)[13]。隨后，Sakamoto等從水稻基因組中分理出4個擬南芥BAS1同源基因：CYP734A2、CYP734A4、CYP734A5和CYP734A6，其中CYP734A2、CYP734A4與CYP734A6三者間氨基酸序列相似性高(70.2%～82.1%)，都能夠催化CS和其他C-22羥化中間產(chǎn)物26位碳的羥基化，各自過表達(dá)后表現(xiàn)出典型的BRs缺失表型，但三者與CYP734A5間的同源性僅有58.0%～58.9%[14]，CYP734A5的功能目前尚不明確。

目前有關(guān)BR失活基因的研究主要集中在擬南芥等少數(shù)幾種植物中，且研究結(jié)果初步表明BRs失活基因無論是數(shù)目還是功能都存在很大的物種差異。糧食作物青稞能夠適應(yīng)高原地區(qū)寒冷、紫外線強(qiáng)、有機(jī)物積累時間短等諸多惡劣自然條件，必然離不開植物激素的調(diào)控。因此，研究青稞中BRs失活基因的功能，不僅是對BRs代謝通路的拓展，而且對深入研究BRs與青稞抗逆性間的關(guān)系具有重要理論意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料青稞農(nóng)家品種‘肚里黃’由青海省遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

實(shí)驗(yàn)所用油菜素唑(brassinazole, BRZ)購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，24-表油菜素內(nèi)酯(24-epibrassinolide, 24-eBL)購自上海實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司，限制性內(nèi)切酶、抗生素等常規(guī)藥品購自生工生物工程(上海)股份有限公司；植物RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量試劑盒均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(Takara)；凝膠回收試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；引物合成與DNA測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1 24-eBL和BRZ處理對青稞幼苗的影響選飽滿的‘肚里黃’種子，用20%的過氧化氫消毒后加入去離子水在黑暗中25 ℃條件培養(yǎng)36 h。隨后，轉(zhuǎn)入裝滿有1/5 MS+0.1 mg/L 24-eBL、或5 mg/L BRZ、或空白對照的10 mL離心管中，置于室溫(22 ℃)條件下正常光照(16 h光/8 h暗)液體培養(yǎng)，每個處理20顆。5 d后直尺量取幼苗的株高，所得數(shù)據(jù)用origin軟件進(jìn)行處理并做圖。

1.2.2 基因克隆青稞苗種植方法同1.2.1，參考TaKaRa-RNA提取試劑盒說明書，分別提取7與21 d苗齡的青稞根部總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物參考大麥中其同源基因序列設(shè)計(jì)，具體見表1。反應(yīng)體系為50 μL，其中引物各1 μL、模板0.5 μL、酶25.0 μL。反應(yīng)程序如下：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 8 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，按試劑盒說明書進(jìn)行目的片段回收。用NcoⅠ和SpeⅠ雙酶切表達(dá)載體pCAMBIA1302，將目的片段與線性化載體連接后立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含Kan抗生素平板上篩選陽性克隆，并采用菌落PCR方法進(jìn)行陽性克隆驗(yàn)證，所用引物和程序同上。將陽性克隆送公司測序。

表1 引物序列信息

1.2.3 生物信息學(xué)分析將測序獲得的序列在NCBI中blast分析其同源序列，并找出其完整開放閱讀框(ORF)。對其編碼蛋白質(zhì)大小、等電點(diǎn)、亞細(xì)胞定位以及進(jìn)化保守型進(jìn)行分析預(yù)測，所用工具見表2。選用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列多重對比和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建。

表2 生物信息學(xué)分析網(wǎng)站

1.2.4 表達(dá)分析同1.2.1進(jìn)行青稞幼苗的培養(yǎng)，取BRZ處理4 d的青稞幼苗全株用于目標(biāo)基因表達(dá)分析，分別取正常生長條件下5、10及15 d的青稞幼苗的根和葉，用于目標(biāo)基因表達(dá)分析，每個樣品取3個生物學(xué)重復(fù)。所有樣品總RNA提取與cDNA合成方法同1.2.2。運(yùn)用表1中實(shí)時定量PCR引物，PCR程序與反應(yīng)體系參考熒光定量試劑盒說明書。實(shí)驗(yàn)樣品與內(nèi)參(HvActin)均設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對表達(dá)量計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源24-eBL、BRZ處理對青稞幼苗的影響

分別用人工合成生長調(diào)節(jié)劑24-eBL和BRs合成抑制劑BRZ處理青稞幼苗，4 d后觀察統(tǒng)計(jì)幼苗高度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照相比，施加24-eBL能夠有效促進(jìn)青稞幼苗的生長，而BRZ處理后幼苗長勢明顯減緩(圖1)。

2.2 HvBAS1基因克隆與生物信息學(xué)分析

本研究發(fā)現(xiàn)，青稞中存在2個BAS1同源基因HvBAS1-1和HvBAS1-2。為了深入研究它們的功能，克隆其cDNA序列并測序(圖2)。

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示：HvBAS1-1的ORF全長1 629 bp，編碼一條542個氨基酸的肽鏈，肽鏈分子量為60 932.18 kD，等電點(diǎn)為9.85；HvBAS1-2的ORF為1 689 bp，編碼肽鏈含562個氨基酸，分子量為63 083.94，等電點(diǎn)為9.33。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)二者相似性達(dá)76.42%(圖3)，亞細(xì)胞定位在線預(yù)測結(jié)果顯示二者均存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

除了青稞，近年來，在水稻、番茄、玉米等植物中均已找到擬南芥BAS1的同源基因，氨基酸保守序列分析顯示，它們均屬于細(xì)胞色素P450家族的734A亞家族。進(jìn)一步分析進(jìn)化關(guān)系可知(圖4)：在單、雙子葉植物間出現(xiàn)了明確的分支，而青稞作為單子葉植物， HvBAS1-1和HvBAS1-2分別與水稻中的CYP734A4和CYP734A2比較接近。

2.3 表達(dá)分析

BRZ是一種油菜素類固醇激素合成抑制劑，BRZ處理青稞幼苗后，實(shí)時定量PCR檢測HvBAS1-1與HvBAS1-2表達(dá)變化情況，結(jié)果如圖5，A所示：HvBAS1-1與HvBAS1-2的轉(zhuǎn)錄水平均受到BRZ的下調(diào)，且HvBAS1-2更為明顯。

HvBAS1-1與HvBAS1-2在青稞中的表達(dá)模式存在很大差異。分別選擇5、10及15 d的青稞，實(shí)時定量PCR檢測它們在根和蓮座葉中的表達(dá)變化情況，結(jié)果圖5，B、C所示，HvBAS1-1根中的表達(dá)量高于葉中，而HvBAS1-2恰好相反。此外，隨著苗齡的增大，HvBAS1-1在根中的表達(dá)呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，HvBAS1-2在葉片中的先降低后升高。整體來看，HvBAS1-1與HvBAS1-2表達(dá)模式完全不同。

3 討 論

BRs具有促生長、提高抗逆性的功能，這在棉花、葡萄、黃瓜等多種植物均已有探索[15-17]，但在青稞中尚未研究。本研究中通過外源施加人工合成的24-eBL與BRZ確定BRs也能促進(jìn)青稞幼苗的生長，且效果非常顯著，這意味著利用BRs相關(guān)基因改良青稞具有很大的潛力。

作為一種非常重要的植物激素，BRs的合成和代謝受到精細(xì)的調(diào)控。當(dāng)體內(nèi)BRs過多時，植物通過反饋機(jī)制降低BRs的合成，促進(jìn)BRs的失活。擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，BRs信號轉(zhuǎn)錄因子能夠直接結(jié)合到多個BRs合成和代謝基因的啟動子區(qū)域, 從而調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)[18]，BAS1就是其中一個關(guān)鍵基因，BR信號能夠通過轉(zhuǎn)錄因子ATAF2與BAS1的啟動子結(jié)合，抑制其表達(dá)[19]。在青稞中，我們找到了擬南芥BAS1的同源基因HvBAS1-1和HvBAS1-2，當(dāng)我們用BRs合成特異性抑制劑BRZ處理后，二者的表達(dá)均下調(diào)，這一結(jié)果意味著HvBAS1-1和HvBAS1-2很可能都參與青稞內(nèi)源BRs的失活。

擬南芥BAS1的同源基因的數(shù)目在青稞中增加到2個，而在其他已有研究的物種中數(shù)目不等：胡蘿卜和馬鈴薯中都僅有1個[11, 20]，水稻中有4個[21]，番茄中有2個[12]。盡管從功能上來看，這些基因中除了水稻CYP734A5外，都參與了BRs的失活，但這種數(shù)目的變化在物種間并未找到明顯規(guī)律。然而，根據(jù)氨基酸序列信息進(jìn)行進(jìn)化分析時發(fā)現(xiàn)，他們在單、雙子葉植物間出現(xiàn)了明確的分支。

青稞中為何存在2個擬南芥BAS1同源基因？這可能是因?yàn)镠vBAS1-1和HvBAS1-2與擬南芥BAS1的功能并不完全相同。從氨基酸序列上來看，HvBAS1-1與水稻CYP734A4相似性最高，為81.54%；HvBAS1-2與水稻CYP734A2相似性最高，為81.50%；而他們與擬南芥BAS1相似性分別僅有55.72%與55.95%，這意味著HvBAS1-1和HvBAS1-2的功能很可能更接近水稻CYP734A4與CYP734A2，而非擬南芥BAS1。更有證據(jù)表明擬南芥和水稻內(nèi)源BRs的代謝存在很大的差異，舉例來說，擬南芥中有CS和BL兩種活性終產(chǎn)物，而在水稻中僅有CS[8]。此外，CYP734A4和CYP734A2作為多功能、多底物酶，都能夠催化諸多C-22羥基化中間體C-26的羥基化，導(dǎo)致過表達(dá)水稻都表現(xiàn)出典型的BRs缺乏表型，但二者對底物的偏好性并不相同[21]，這意味著HvBAS1-1與HvBAS1-2的功能很可能也存在差異。在本研究中，HvBAS1-1和HvBAS1-2的表達(dá)水平及時空性都不相同，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了上述推測。

CYP734A亞家族成員在進(jìn)化的過程中除了數(shù)目發(fā)生變化外，在功能上可能也出現(xiàn)了分化，比如，胡蘿卜DcBAS1除了參與 BR失活外，還能抑制纖維素的合成[21]，而水稻CYP734A5和番茄CYP734A8雖然也屬CYP734A亞家族，但他們并不能催化BRs失活，具體功能目前尚不清楚。這意味著HvBAS1-1和HvBAS1-2除了參與BRs失活外可能還具有其他的功能。