石慧敏，侯建華，蘇飛燕，王艷霞，李丹丹，周佳嶺

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 呼和浩特 010019)

干旱是世界范圍內(nèi)限制農(nóng)作物產(chǎn)量的主要因素之一[1]。在干旱頻發(fā)地區(qū)，種植耐旱性較強(qiáng)的作物顯得尤為重要[2]。向日葵是干旱半干旱地區(qū)一種十分重要的油料作物，根系發(fā)達(dá)，具有良好的抗旱潛力[3-5]，但其分布和產(chǎn)量仍受干旱的影響很大[6-11]。苗期是向日葵生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，苗期受旱對(duì)向日葵形態(tài)建成、生長(zhǎng)發(fā)育以及后期產(chǎn)量和品質(zhì)形成都具有很大的影響，因此開(kāi)展向日葵苗期抗旱性的研究至關(guān)重要。由于農(nóng)作物抗旱的遺傳機(jī)制非常復(fù)雜，因此常規(guī)育種方法在該領(lǐng)域若想取得重大進(jìn)展比較困難[12]。近年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)已成功地應(yīng)用于數(shù)量性狀位點(diǎn)的鑒定(QTL)，且在挖掘作物對(duì)干旱脅迫響應(yīng)的重要性狀基因位點(diǎn)中已經(jīng)有廣泛的應(yīng)用[12-13]。HERVé等[14]報(bào)道了4個(gè)葉綠素濃度QTL和1個(gè)相對(duì)含水量 QTL，分別解釋了53%和9.8%的表型變異。Nishtman等[15]從PAC2×RHA266雜交的123個(gè)自交系及其親本中選取70個(gè)自交系為材料，在淹水狀態(tài)下分別檢測(cè)到葉綠素濃度和相對(duì)含水量的3個(gè)和6個(gè)QTL。在水分脅迫條件下，鑒定出7個(gè)和2個(gè)QTL。并發(fā)現(xiàn)葉綠素濃度和相對(duì)含水量的QTL在連鎖群10和16上存在重疊現(xiàn)象。最終認(rèn)為兩種水分條件下不同性狀的共同QTL位點(diǎn)在連鎖群10上顯得更為重要。張永虎[16]構(gòu)建了1張包含17個(gè)連鎖群并分布有738個(gè)標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜，兩種水分處理下檢測(cè)到30個(gè)QTL。盡管前人對(duì)向日葵干旱脅迫的研究取得了一定的進(jìn)展，但是由于上述用于QTL定位的遺傳圖譜所涉及到的標(biāo)記數(shù)量少、密度低，因此無(wú)法揭示向日葵耐旱性的綜合遺傳機(jī)制。隨著向日葵基因組的公布，為挖掘向日葵抗旱相關(guān)的重要候選基因提供了可能。

基于此，本研究利用前期構(gòu)建的高密度分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜，通過(guò)對(duì)150個(gè)株系組成的重組自交系群體苗期抗旱相關(guān)性狀的表型及遺傳統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行了QTL定位和候選基因的挖掘，為油葵遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)所用材料，是內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院提供的2個(gè)親本材料K55(弱抗旱性)和K58(強(qiáng)抗旱性)，雜交后由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)通過(guò)單粒傳法構(gòu)建的150個(gè)株系組成的F7代重組自交系群體。

1.2 材料種植和指標(biāo)測(cè)定

2018年春季，選擇籽粒飽滿(mǎn)的向日葵種子，用氯化汞溶液消毒浸泡5 min，用蒸餾水多次沖洗，在水分合適的培養(yǎng)皿內(nèi)室溫催芽2 d，種植于塑料盆(250 mm×190 mm×160 mm)，每盆中裝4 kg土壤(75%砂：20%營(yíng)養(yǎng)土壤：5%蛭石)，種植前澆透水，每盆留苗8株，置于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)人工智能溫室中。溫室內(nèi)的溫度設(shè)置為25 ℃，濕度設(shè)置為40%。試驗(yàn)設(shè)置干旱脅迫和正常澆水(對(duì)照)2個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。在向日葵幼苗生長(zhǎng)到3片葉時(shí)開(kāi)始進(jìn)行干旱脅迫處理，脅迫期間每3 d 測(cè)定1次土壤含水量，干旱脅迫土壤含水量控制在5%～10%，正常澆水土壤含水量控制在15%～20%，對(duì)照條件下以最高土壤含水量20%，脅迫條件下以最高土壤含水量10%來(lái)計(jì)算每次澆水量，澆水量=(土壤最高含水量-土壤測(cè)定含水量)×土壤風(fēng)干重量，土壤含水量和澆水量見(jiàn)表1。

表1 土壤含水量及澆水量對(duì)照表

脅迫15 d之后，每個(gè)材料隨機(jī)選取5株，對(duì)正常澆水和干旱脅迫兩種水分條件處理下的向日葵幼苗的葉片相對(duì)電導(dǎo)率、葉綠素含量、葉面積、葉片相對(duì)含水量、根長(zhǎng)共5個(gè)性狀進(jìn)行測(cè)定。根長(zhǎng)用根系掃描儀(萬(wàn)深 LA-S) 測(cè)定，葉綠素含量(SPAD值)使用葉綠素儀(TYS-A) 測(cè)定，葉面積用葉面積系數(shù)法測(cè)定，葉片相對(duì)電導(dǎo)率用DDS-11A電導(dǎo)儀測(cè)定；采用飽和稱(chēng)重法測(cè)定葉片的相對(duì)含水量[17]，計(jì)算公式為：

RWC=[(Wf-Wd) / (Wt-Wd)]×100%

其中，Wf為葉片鮮重，Wd為葉片干重，Wt為被水飽和后的葉片重量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Excel 2019軟件對(duì)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入整理，利用SPSS23.0軟件進(jìn)行表型性狀分析、相關(guān)分析等，利用JoinMap4.0，采用CIM(復(fù)合區(qū)間作圖法)定位方法對(duì)向日葵幼苗性狀進(jìn)行QTL定位。

1.4 QTL定位

本研究定位所使用的高密度遺傳連鎖圖譜是呂品等[18]于2017年以油用向日葵強(qiáng)抗旱自交系K58為父本，弱抗旱自交系K55為母本進(jìn)行雜交獲得150個(gè)F7重組自交系(RIL)群體所構(gòu)建的。該圖譜包含4 912個(gè)SNP標(biāo)記和93個(gè)SSR標(biāo)記，分布于向日葵17個(gè)連鎖群上，總長(zhǎng)2 425.05 cM，相鄰2個(gè)標(biāo)記間的平均距離0.49 cM。 采用JoinMap4.0軟件對(duì)RIL定位群體的所有基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析。使用復(fù)合區(qū)間映射(CIM)方法[19]來(lái)識(shí)別QTL。用PT檢驗(yàn)1 000次設(shè)定閾值，首先考慮0.99置信度對(duì)應(yīng)的LOD閾值，若沒(méi)有定位區(qū)間則考慮0.95置信度對(duì)應(yīng)的LOD閾值；若沒(méi)有定位區(qū)間則考慮0.90置信度的閾值。若仍沒(méi)有結(jié)果則沒(méi)有考慮PT檢驗(yàn)的結(jié)果，手動(dòng)降低閾值到3.0；若3.0沒(méi)有區(qū)間則降到2.5或2.0。檢測(cè)到的各性狀QTL位點(diǎn)命名方法為：q+所測(cè)性狀的英文名縮寫(xiě)+連鎖群位置+QTL編號(hào)。

1.5 候選基因篩選

利用遺傳連鎖圖譜中的所有SNP和SSR標(biāo)記，確定了物理圖譜和遺傳圖譜的比對(duì)關(guān)系。在基因組上檢測(cè)到的與QTL的置信區(qū)間一致的區(qū)域被認(rèn)為是QTL區(qū)域，位于QTL內(nèi)的基因被定義為QTL的候選基因，如Chao等[20]的方法所述。本研究選擇掃描標(biāo)記區(qū)間內(nèi)基因組區(qū)域?qū)?yīng)的候選基因，以2017年發(fā)布的向日葵基因組作為參考基因組進(jìn)行比對(duì)[21]，并利用GO、KEGG、COG、NR、pam、Swiss-Prot等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀分析

圖1顯示，兩個(gè)親本和RIL群體中的150個(gè)材料在正常澆水和干旱脅迫條件下5個(gè)抗旱相關(guān)性狀的正態(tài)分布結(jié)果。從圖1可以看出，所有性狀均呈連續(xù)分布，且呈現(xiàn)正態(tài)分布或偏正態(tài)分布，符合QTL定位的要求。

從表2可以看出，在正常灌水條件下，兩親本間的平均值差異不是很明顯；強(qiáng)抗旱種質(zhì)K58葉片相對(duì)電導(dǎo)率、葉綠素含量、葉片相對(duì)含水量、葉面積和根長(zhǎng)等5個(gè)性狀均高于K55(弱抗旱種質(zhì))，RIL群體的變異系數(shù)為7.6%～45.4%。在干旱條件下，K58(強(qiáng)抗旱種質(zhì))的所有性狀也均高于K55(弱抗旱種質(zhì))，RIL群體的變異系數(shù)在12.0%～42.2%之間。

表2 正常澆水和干旱脅迫條件下親本和RIL群體各性狀指標(biāo)

從表3可知，正常澆水條件下，葉片相對(duì)電導(dǎo)率與葉綠素含量呈極顯著正相關(guān)，與葉片相對(duì)含水量呈顯著性負(fù)相關(guān)，但未達(dá)到極顯著水平；干旱脅迫條件下，葉片相對(duì)電導(dǎo)率與葉綠素含量仍呈極顯著正相關(guān)；此外，根長(zhǎng)與葉面積呈顯著性正相關(guān)，但未達(dá)到極顯著水平。

表3 正常澆水和干旱脅迫條件下RIL群體各性狀間的相關(guān)分析

2.2 QTL定位

兩種水分條件下向日葵苗期抗旱相關(guān)性狀的QTL定位結(jié)果顯示，在RIL群體中共有11個(gè)QTL位點(diǎn)，正常澆水條件下5個(gè)QTL，干旱脅迫條件下6個(gè)QTL。定位于5號(hào)連鎖群上的位點(diǎn)最多，為3個(gè)QTL位點(diǎn)。各性狀的表型貢獻(xiàn)率處于0.768%～7.547%之間(表4，圖2)。

表4 兩種水分條件下苗期各性狀的QTL定位結(jié)果

正常灌水條件下檢測(cè)到的5個(gè)QTL位點(diǎn)中，葉片相對(duì)電導(dǎo)率、葉綠素含量、葉面積、葉片相對(duì)含水量和根長(zhǎng)各檢測(cè)到一個(gè)QTL位點(diǎn)。位于第16連鎖群上與葉片相對(duì)電導(dǎo)率緊密關(guān)聯(lián)的qCCn-16-1位點(diǎn)LOD值最大，為4.271，表型貢獻(xiàn)率為5.765%；第5連鎖群上與葉綠素含量緊密相關(guān)的qLRCn-5-1位點(diǎn)表型貢獻(xiàn)率最大，為7.547%。

干旱脅迫條件下檢測(cè)到的6個(gè)QTL位點(diǎn)中，葉片相對(duì)含水量檢測(cè)到2個(gè)位點(diǎn)，葉片相對(duì)電導(dǎo)率、葉綠素含量、葉面積和根長(zhǎng)各1個(gè)QTL位點(diǎn)。位于第8連鎖群上與葉面積緊密相關(guān)的qLA-8-1的位點(diǎn)表型貢獻(xiàn)率最大，為6.705%；位于第16連鎖群上與葉綠素含量緊密相關(guān)的QTL位點(diǎn)LOD值最大，為4.204。

2.3 與干旱相關(guān)的候選基因

本研究將檢測(cè)到的位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的QTL區(qū)間序列與NCBI上發(fā)表的向日葵基因組[21]進(jìn)行比對(duì)，利用GOG、GO、KEGG、NR等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)候選基因進(jìn)行基因功能注釋。COG(同源蛋白簇)主要注釋到以下幾條：3條參與翻譯后修飾、蛋白質(zhì)更新、伴侶；1條參與脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝；5條參與無(wú)機(jī)離子的運(yùn)輸與代謝；3條參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；1條參與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生；1條參與防御機(jī)制；1條參與復(fù)制、重組和修復(fù)；1條參與次生代謝產(chǎn)物的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝；3條參與碳水化合物的運(yùn)輸和代謝；1條參與輔酶的運(yùn)輸和代謝。在兩種水分條件下，共注釋和篩選到62個(gè)重要的候選基因，候選基因位于3個(gè)連鎖群(8、13、16)的3個(gè)QTL內(nèi)，與3個(gè)性狀(葉片相對(duì)電導(dǎo)率、葉面積、葉綠素)相關(guān)(表5)。

表5 與干旱脅迫相關(guān)的重要候選基因

續(xù)表5 Continued Table 5

基于基因功能注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)許多基因與干旱脅迫有關(guān)。位于8號(hào)染色體上的QTL qLA-8-1區(qū)間內(nèi)的候選基因rna22964編碼熱擊蛋白90-5，該基因參與翻譯后修飾和蛋白質(zhì)更新；rna23294編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子2；rna22215編碼細(xì)胞色素P450 90A1；rna23271編碼細(xì)胞色素P450 82G1；rna23019和rna23004均編碼乙烯反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子RAP2-7；rna22100編碼E3泛素蛋白連接酶RHC2A；rna22868編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子26；rna22783編碼水通道蛋白TIP2-1，參與碳水化合物的運(yùn)輸和代謝；rna22224編碼脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3；rna22878編碼細(xì)胞色素P450 71A1；rna22577編碼小熱激蛋白；rna22661和rna22193分別編碼脫落酸受體PYL2和PYL4；rna22948編碼ABC運(yùn)輸者G家庭成員31。位于13號(hào)染色體上與葉綠素含量緊密關(guān)聯(lián)的QTL位點(diǎn)qCC-13-1區(qū)間內(nèi)的候選基因rna40140編碼水通道蛋白TIP4;1，參與碳水化合物的運(yùn)輸和代謝；rna40077編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G家庭成員15，該基因參與防御機(jī)制。位于16號(hào)染色體上的QTL位點(diǎn)qCCn-16-1的區(qū)間內(nèi)的候選基因rna49909編碼光調(diào)節(jié)蛋白。

3 討 論

3.1 表型性狀分析

作物抗旱性是一種綜合性狀，單一指標(biāo)往往不具有代表性。因?yàn)樗袉蝹€(gè)抗旱的生物學(xué)過(guò)程最終都將反映在植物生長(zhǎng)及其最終產(chǎn)品(產(chǎn)量)上[22]，因此，選擇多個(gè)指標(biāo)來(lái)綜合評(píng)價(jià)作物的抗旱性才較為客觀(guān)。本研究選取了5個(gè)與向日葵抗旱相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行QTL定位；干旱脅迫下，K58所有性狀均高于K55，說(shuō)明K58具有較強(qiáng)抗旱性。此外，本研究利用5個(gè)與抗旱相關(guān)的性狀對(duì)RIL群體進(jìn)行抗旱性評(píng)價(jià)，但是有些性狀間相關(guān)性不大，這可能是試驗(yàn)誤差造成的。由表2可以發(fā)現(xiàn)，兩種水分條件下葉片相對(duì)電導(dǎo)率與葉綠素含量均呈極顯著正相關(guān)，且干旱脅迫下，相關(guān)系數(shù)增大，說(shuō)明二者與干旱脅迫具有密切的關(guān)系，因此認(rèn)為這兩個(gè)指標(biāo)是衡量向日葵干旱脅迫的重要指標(biāo)，這與張海燕等[23]在甘薯中的研究結(jié)論一致。

3.2 油葵抗旱性的遺傳基礎(chǔ)和QTL

近幾十年中，QTL定位是植物數(shù)量性狀位點(diǎn)挖掘中十分重要的方法之一，并且已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種遺傳結(jié)構(gòu)不同的群體進(jìn)行定位。RIL是永久性分離群體，故常作為 QTL定位群體[24]。在本研究中，對(duì)RIL群體進(jìn)行表型分析，并在正常澆水和干旱脅迫兩種條件下對(duì)油葵苗期的5個(gè)抗旱相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位，共檢測(cè)到油葵5條染色體上與抗旱相關(guān)的11個(gè)QTL位點(diǎn)。位于8號(hào)染色體上與葉面積緊密相關(guān)的2個(gè)位點(diǎn)qLAn-8-1和qLA-8-1在兩種水分條件下被重復(fù)檢測(cè)到，表明所檢測(cè)到的QTL是穩(wěn)定的。尚未定位到與前人研究一致的抗旱相關(guān)性狀的QTL位點(diǎn)。本研究在干旱條件下于5號(hào)染色體檢測(cè)到與葉片相對(duì)含水量相關(guān)的QTL，HERVé等[14]于5號(hào)染色體上也定位到了控制葉片含水量相關(guān)的1個(gè)QTL位點(diǎn)。Nishtman ABDI等[15]在正常澆水和干旱條件下分別在16號(hào)染色體上定位到控制葉綠素含量1個(gè)和2個(gè)QTL，而本研究也在正常澆水條件下也于16號(hào)染色體上檢測(cè)到1個(gè)控制葉綠素含量的QTL，這2個(gè)性狀雖然與前人研究定位到同一個(gè)染色體上，但物理位置卻不相同，QTL標(biāo)記區(qū)間的差異可能是由于圖譜之間的標(biāo)記種類(lèi)和密度不一致所造成的。此外，qLRWC-5-1、qLRWC-5-2和qLRCn-5-1均定位于5號(hào)染色體上；qLRC-16-1和qCCn-16-1均定位于16號(hào)染色體上，qLRWCn-17-1和qRL-17-1均定位于17號(hào)染色體上，這些QTL之間雖然控制著不同的性狀，但是卻定位到同一染色體上，這些結(jié)果從各性狀間的相關(guān)分析中也可以看出，兩種水分條件下葉片相對(duì)電導(dǎo)率與葉綠素含量均呈極顯著正相關(guān)；正常澆水條件下葉片相對(duì)電導(dǎo)率與葉片相對(duì)含水量呈顯著性負(fù)相關(guān)，由此也可以看出相關(guān)性較高的性狀間，可能是由同一染色體調(diào)控的，且該結(jié)果與Nishtman等利用RIL群體在水分脅迫下獲得的結(jié)果一致[15]。

3.3 候選基因

從大量候選基因中選擇重要的候選基因往往是一項(xiàng)困難的任務(wù)，然而，QTL信息和基因表達(dá)變異的整合是一種常見(jiàn)策略[25-26]。在此基礎(chǔ)上本研究推測(cè)了一些可能與干旱脅迫密切相關(guān)的重要候選基因。位于8號(hào)染色體上與葉面積緊密關(guān)聯(lián)的QTL位點(diǎn)上注釋到的rna23019和rna23004均編碼乙烯反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子RAP2-7；Somayeh Najaf等[27]對(duì)向日葵的AP2/ERF基因進(jìn)行全基因組識(shí)別后，選取9個(gè)AP2/ERF基因，通過(guò)qPCR驗(yàn)證所選基因在不同非生物脅迫條件下葉片和根組織中的表達(dá)情況證實(shí)AP2/ERFs基因能有效抵抗非生物脅迫。rna22661和rna22193分別編碼脫落酸受體PYL2和PYL4；已知PLY參與ABA響應(yīng)干旱脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程[28]。研究發(fā)現(xiàn)ABA受體PYL4先前被檢測(cè)到參與了植物對(duì)各種脅迫的響應(yīng)。過(guò)表達(dá)TaPYL4可以提高小麥的抗旱性[29]。rna23294編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子2，研究發(fā)現(xiàn)CsWRKY2參與了茶樹(shù)的干旱脅迫，當(dāng)使用外源ABA后CsWRKY2的表達(dá)得到了增強(qiáng)，當(dāng)使用ABA合成抑制劑時(shí)，CsWRKY2的表達(dá)受損[30]。另外，ThWRKY2可在干旱脅迫下啟動(dòng)ThERF1(乙烯響應(yīng)因子)基因的表達(dá)，該基因編碼一種新的乙烯響應(yīng)因子，并且對(duì)干旱脅迫在內(nèi)的非生物脅迫進(jìn)行負(fù)調(diào)控。在芥菜中過(guò)表達(dá)ThERF1增加了植物的蒸騰速率，導(dǎo)致植物對(duì)干旱脅迫更敏感[26]。rna22783和rna40140分別編碼水通道蛋白TIP2;1和TIP4;1。有研究結(jié)果表明，HvTIP2;1和HvTIP4;1在大麥對(duì)干旱脅迫條件的適應(yīng)過(guò)程中具有重要作用[31]。另有研究者在水稻中發(fā)現(xiàn)OsTIP2;1在根部強(qiáng)烈表達(dá)，幾乎沒(méi)有在葉片中表達(dá)，這說(shuō)明水通道蛋白調(diào)控生理過(guò)程使植物獲得抗旱性可能具有特異性[32-33]。

下一步，我們將開(kāi)展精細(xì)定位，對(duì)這些候選基因進(jìn)行克隆和功能鑒定，并通過(guò)群體的擴(kuò)大等途徑，繼續(xù)發(fā)掘與其他性狀相關(guān)的候選基因，為加強(qiáng)向日葵種質(zhì)資源中優(yōu)異基因的深度發(fā)掘和其在育種中的利用奠定基礎(chǔ)。

本研究表明葉片相對(duì)電導(dǎo)率和葉綠素含量可以作為向日葵苗期抗旱性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。此外，本研究對(duì)向日葵苗期抗旱相關(guān)的5個(gè)性狀進(jìn)行QTL定位，于兩種水分條件下共得到11個(gè)QTL位點(diǎn)，并對(duì)這些位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因組區(qū)域進(jìn)行候選基因的功能注釋?zhuān)埠Y選到62個(gè)與干旱脅迫相關(guān)的候選基因，這些基因可作為后期重點(diǎn)研究的對(duì)象。