王新新，封騰望，王慧姣，李晉成，孫慧武，劉歡*

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100141；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306)

磺胺類藥物基本結(jié)構(gòu)是對(duì)氨基苯磺酰胺，是可經(jīng)取代反應(yīng)合成的一類有機(jī)化合物的總稱，其磺酰胺基上的氫可被雜環(huán)取代，形成多種多樣的磺胺類化合物[1-2]，磺胺類藥物因其顯著的抗菌作用，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中常被用于預(yù)防疾病或作為飼料添加劑[3]。對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物使用磺胺類藥物后，大部分會(huì)以藥物本身或其代謝物的形式排出體外，造成其在環(huán)境中的污染和動(dòng)物體內(nèi)的殘留[4-8]，并經(jīng)食物鏈導(dǎo)致人體內(nèi)磺胺類藥物的富集[9-11]，因此，長(zhǎng)期攝入含磺胺類藥物的食品會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生致癌、致畸、致突變等嚴(yán)重的潛在危害[12-13]。

國(guó)際食品法典委員會(huì)、歐盟和美國(guó)都將磺胺類藥物列為動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中限制使用的藥物，中國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定水產(chǎn)品肌肉組織中磺胺類藥物總量以及單個(gè)磺胺類藥物的最大殘留限量為100 μg/kg[14-16]。目前，水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留常采用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定[17-18]，為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，有必要對(duì)測(cè)量不確定度的分量來(lái)源進(jìn)行具體分析，評(píng)定影響測(cè)定結(jié)果的不確定度[19-20]。根據(jù) 《檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定能力評(píng)價(jià)》 要求，應(yīng)建立評(píng)定測(cè)量不確定度的程序，在檢驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程出現(xiàn)臨界值、內(nèi)部質(zhì)量控制或客戶有要求時(shí)，報(bào)告測(cè)量不確定度。因此，本研究參照農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008，使用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了草魚(Ctenopharyngodonidella)中10種磺胺類藥物殘留，根據(jù)CNAS-GL06 《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[21]和 JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[22]，對(duì)測(cè)定過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、測(cè)量重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品的稱量等引入的不確定度進(jìn)行分析評(píng)定，確定對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大的不確定度因素，為正確評(píng)價(jià)和使用檢測(cè)數(shù)據(jù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磺胺甲噁唑(SMZ，CAS：723-46-6)、磺胺二甲異噁唑(SFZ，CAS：127-69-5)、磺胺二甲基嘧啶(SM2，CAS：57-68-1)、磺胺甲基嘧啶(SM1，CAS：127-79-7)、磺胺甲二唑(SMT，CAS：144-82-1)、磺胺喹噁啉(SQX，CAS：59-40-5)、磺胺噻唑(STZ，CAS：72-14-0)、磺胺嘧啶(SDZ，CAS：68-35-9)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM，CAS：1220-83-3)、磺胺氯噠嗪(SCP，CAS：80-32-0)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購(gòu)于德國(guó) Dr.Ehrenstorfer 公司；氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶(SDX-D3，CAS：2447-57-6)、氘代磺胺間二甲氧嘧啶(SDT-D6，CAS：122-11-2)均購(gòu)于德國(guó) Witega 公司；乙腈、甲醇、正己烷(色譜純，美國(guó) J.T.Baker 公司)；乙酸銨、甲酸(質(zhì)譜級(jí)，美國(guó) Fisher 公司)；無(wú)水硫酸鎂(上海麥克林生化科技有限公司)。

鮮活草魚購(gòu)自北京市房山區(qū)琉璃河鎮(zhèn)某養(yǎng)魚場(chǎng)(約1 kg/尾)，于北京市房山區(qū)中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院鱘魚繁育技術(shù)與工程中心養(yǎng)殖池中暫養(yǎng)備用。

1.2 儀器與設(shè)備

QTRAP?5500超高效液相色譜-三重四級(jí)桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó)SCIEX公司)； MVM-2500多管渦流混合器(上海泰坦科技股份有限公司)；MS3 Basic 基本型旋渦混勻器(德國(guó)IKA公司)；SB-5200DTN超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；PL2002電子天平(Mettler Toledo儀器(上海)有限公司)；H-2050R臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；Buchi R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取10.02 mg SMZ、10.03 mg SFZ、10.02 mg SM2、10.03 mg SM1、10.06 mg SMT、10.11 mg SQX、10.09 mg STZ、10.08 mg SDZ、10.19 mg SMM、10.09 mg SCP、10.02 mg SDX-D3、SDT-D6標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；分別移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成濃度為100.0 μg/mL、10.0 μg/mL的外標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液和內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液；以甲醇為溶劑，移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，配制成1.0 μg/mL、100.0 ng/mL外標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和1.0 μg/mL內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，-20 ℃保存。

1.3.2 樣品測(cè)定

樣品檢測(cè)按照農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008中的操作方法測(cè)定SMZ、SFZ、SM2、SM1、SMT、SQX、STZ、SDZ、SMM、SCP殘留量[23]。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相A為 0.1 %甲酸溶液(含5.0 mmol/L醋酸銨)，B為甲醇；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Conditions of gradient elution

1.3.4 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式下采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式采集數(shù)據(jù)。離子源的詳細(xì)參數(shù)如下：噴霧電壓(IS)：5 500 V；離子源溫度(TEM)：550 ℃；氣簾氣(CUR)：30 psi；霧化氣(GS1)：45 psi；輔助加熱氣(GS2)：55 psi；磺胺類化合物MRM質(zhì)譜參數(shù)參考農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008。

1.4 數(shù)學(xué)模型

不確定度評(píng)定要從測(cè)量全過(guò)程的每一個(gè)環(huán)節(jié)入手，根據(jù)測(cè)定方法，建立草魚樣品中磺胺類藥物殘留量的數(shù)學(xué)模型如下：

式(1)

式中：X為樣品中磺胺類藥物的殘留量，單位為μg/kg ；C為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中得到的樣品中被測(cè)組分的質(zhì)量濃度，單位為 ng/mL ；V為試樣最終定容體積，單位為mL；m為稱樣量，單位為g。

2 結(jié)果與分析

樣品中磺胺類藥物測(cè)量不確定度的來(lái)源主要有以下幾個(gè)方面：外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度u1；內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度u2；測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度u3；標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度u4；待測(cè)樣品稱量引入的不確定度u5；樣品定容引入的不確定度u6。

2.1 外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度u1

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

表2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度Tab.2 Uncertainty introduced by the purity of standard substances

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,12

表3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度Tab.3 Uncertainty introduced by the weighing of standard substances

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,13

2.1.4 稀釋過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,14

綜上，10種磺胺類藥物的外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果分別為：

2.2 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度u2

2.2.1 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,21

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度見表4。

表4 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度Tab.4 Uncertainty introduced by the purity of internal standard reference material

2.2.2 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,22

2.2.3 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,23

2.2.4 稀釋過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,24

2.2.5 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,25

綜上，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果如下：

urel,2,SDT-D6=

urel,2,SDX-D3=

2.3 測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度u3

測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度，在實(shí)驗(yàn)中主要是樣品平行測(cè)定引入的不確定度，按1.3實(shí)驗(yàn)方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，以 6 次測(cè)量的平均值作為測(cè)量結(jié)果，平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差S(x)及測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度見表5。

表5 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果和不確定度Tab.5 Repeatability determination results and uncertainty

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度u4

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定, 經(jīng)線性擬合得到校準(zhǔn)曲線。采用5個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)濃度測(cè)定6次，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度Ci為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)峰面積(A外標(biāo))與內(nèi)標(biāo)峰面積(A內(nèi)標(biāo))的比值為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法擬合獲得線性回歸方程A=a+b×C(a為截距，b為斜率)和相關(guān)系數(shù)。本研究中對(duì)樣品測(cè)定液測(cè)量次數(shù)為6次，線性回歸導(dǎo)致C0的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u4，根據(jù)下列公式對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度進(jìn)行計(jì)算[16]，結(jié)果見表6。

式(2)

式(3)

式(4)

式(5)

式(6)

表6 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線及不確定度Tab.6 Fitting standard curve and uncertainty by least square method

續(xù)表6，Tab.6 Continued

續(xù)表6，Tab.6 Continued

2.5 樣品稱量引入的不確定度u5

2.6 樣品定容引入的不確定度u6

2.7 合成不確定度uc

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定草魚中磺胺類藥物的相對(duì)合成不確定度urel和合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc分別按照urel=

表7 不確定度分量及相對(duì)合成不確定度Tab.7 Uncertainty component and relative combined uncertainty

2.8 擴(kuò)展不確定度U

包含因子取k=2，擴(kuò)展不確定度按照公式U=k·uc計(jì)算，因此，草魚中磺胺類藥物殘留不確定度評(píng)定結(jié)果見結(jié)果見表8。

表8 不確定度評(píng)定結(jié)果Tab.8 Uncertainty evaluation results

3 結(jié)論

本研究分析了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定草魚中10 種磺胺類藥物殘留的不確定度，通過(guò)評(píng)估各不確定度分量，建立了不確定度評(píng)估數(shù)學(xué)模型。不確定度評(píng)定結(jié)果如圖1所示：經(jīng)過(guò)分析和評(píng)定發(fā)現(xiàn)影響測(cè)定結(jié)果不確定度的主要因素為標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，其次是測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度，樣品定容與樣品稱量引入的不確定度貢獻(xiàn)較小，可忽略不計(jì)。因此，在實(shí)際操作過(guò)程中應(yīng)盡量提高實(shí)驗(yàn)人員的操作規(guī)范，并選擇經(jīng)過(guò)檢定、精度較高的容量瓶與移液管,減少由標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度。在檢測(cè)磺胺類藥物過(guò)程中，可采取增加測(cè)量的平行測(cè)定次數(shù)或提高標(biāo)準(zhǔn)曲線線性，減少不確定度。此外，還應(yīng)定期檢定、校準(zhǔn)儀器，嚴(yán)格管理和維護(hù)儀器設(shè)備，保持液質(zhì)聯(lián)用儀良好的穩(wěn)定性和較高的靈敏度，來(lái)保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，降低分析結(jié)果的不確定度。

圖1 不確定度分量評(píng)定結(jié)果Fig.1 Uncertainty component evaluation results