趙新楠，彭吉星，吳海燕，鄭關(guān)超，郭萌萌，文藝曉，王聯(lián)珠，譚志軍*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室， 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島 266071； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室， 青島 266071)

磷脂不僅是生物細胞膜的重要組成成分，同時具有信號轉(zhuǎn)導功能和生理代謝調(diào)節(jié)作用，水產(chǎn)品中富含活性不飽和脂肪酸，并且大都以磷脂的形式存在。由于磷脂具有防治心血管疾病，增強免疫力等生物功能特性，是相關(guān)水產(chǎn)品營養(yǎng)品質(zhì)評價的重要指標[1]。目前磷脂的研究主要集中在大豆和蛋黃中的卵磷脂，水產(chǎn)品中磷脂的研究較少[2-9]。磷脂類化合物種類多，常見的磷脂有20余種，據(jù)文獻報道[10-18]水產(chǎn)品磷脂主要有磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰膽堿和鞘磷脂，其中磷脂酰膽堿(卵磷脂)和磷脂酰乙醇胺(腦磷脂)相對含量最高，以上5種磷脂占總磷脂含量的90%左右；牡蠣(Ostreagigastnunb)、鮭魚(Oncorhynchus keta)、磷蝦油、魚子、蟹和海膽中5種磷脂占其總磷脂含量的95%以上；貝類、刺參(Apostichopusjaponicas)和海膽(Echinoidea)等雖含有磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)和心磷脂(Cardiolipin，CL)，但僅占磷脂總含量的5%以下(見表1)。因此，本研究中磷脂化合物的分析選擇磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholines，PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)、溶血磷脂酰膽堿(Lysophosphatidylcholine，LPC)和鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)5種磷脂。

國內(nèi)針對磷脂檢測發(fā)布的相關(guān)標準有GB 5537—2008[19]、GB 5009.272—2016[20]、GB/T 35867—2018[21]，以上國標方法主要用于植物油或從中提取的卵磷脂中磷脂的檢測。GB/T 35867—2018和《中華人民共和國藥典》(2015年版)[22]中磷脂的檢測均用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(High performance liquid chromatography-Evaporative Light Scattering Detector，HPLC-ELSD)法，但其適用范圍僅涉及到油脂類或藥物用品中磷脂的檢測，均未涉及水產(chǎn)品。國內(nèi)常用的檢測方法如比色法、分光光度法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法，只能測定總磷脂的含量，而且影響因素多，成分的準確性較差，無法對其關(guān)鍵成分進行定量分析檢測，另外現(xiàn)有食品國標中的磷脂液相色譜檢測方法檢測范圍不包括水產(chǎn)品及其制品，導致不能用于分析評價水產(chǎn)品及其制品磷脂的質(zhì)量優(yōu)劣。液相色譜是目前磷脂分離和定性定量分析中最常用的方法，紫外檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器是常用檢測器，其中，蒸發(fā)光散射檢測器的響應信號獨立于分子中的雙鍵數(shù)目，對于紫外吸收弱的磷脂類物質(zhì)更為準確靈敏，適用于不同來源磷脂的檢測，是目前磷脂分析最常用的方法。

實驗室前期優(yōu)化建立了HPLC-ELSD測定南極磷蝦(Euphausiasuperba)油中磷脂的方法[23]，但是只涉及到磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰膽堿3種磷脂，且只分析了南極磷蝦油樣品。本研究在實驗室前期研究基礎上，進一步利用HPLC-ELSD檢測不同水產(chǎn)品中5種磷脂的含量，為水產(chǎn)品營養(yǎng)品質(zhì)評價提供支撐，對促進產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展以及水產(chǎn)品高值化利用具有重要的意義和經(jīng)濟價值。

表1 不同水產(chǎn)品中磷脂含量比例Tab.1 The content ratio of phospholipids in different aquatic products

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳山二倍體牡蠣于春季采自威海乳山海洋所鎮(zhèn)南泓村海域；刺參于春季采自威海榮成東楮島海域；磷蝦粉來自青島康境等磷蝦粉加工企業(yè)；虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、螃蟹、海參性腺、海膽醬、鱘魚子，購自青島某超市。磷脂酰膽堿(CAS：8002- 43-5，PC)、磷脂酰乙醇胺(CAS：39382-08-6，PE)、磷脂酰肌醇(CAS：383907-33-3，PI)、溶血磷脂酰膽堿(CAS：9008-30-4，LPC)、鞘磷脂(CAS：85187-10-6，SM)，均購于sigma公司，純度≥98%。鹽酸(優(yōu)級純)，購自國藥集團化學試劑有限公司；氯仿、乙醚、丙酮，乙酸均為色譜級，購自美國默克公司；甲醇、異丙醇、正己烷均為色譜級，購自賽默飛世爾科技公司。

N-EVAP-24氮吹儀(Organomation公司)；IKA渦旋振蕩器(德國艾卡公司)；KQ-600DE超聲清洗機(昆山舒美公司)；sigma 4-88離心機(sigma公司)；CPA 1003P天平(美國賽多利斯公司)；1 000 mg/6 mL氨基固相萃取柱(Waters公司)；Chromolith Performance-Si(100 mm×4.6 mm)硅膠整體柱(Merck公司)；Waters 2695高效液相色譜儀(Waters公司)；Waters 2424蒸發(fā)光散射檢測器(Waters公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

稱取適量水產(chǎn)品樣品(牡蠣、刺參凍干粉樣品0.200 g；磷蝦粉樣品0.100 g；虹鱒、海膽黃、蟹黃、鱘魚子、海參性腺鮮樣2.00 g)置于50.0 mL離心管中，加入15 mL氯仿∶甲醇(2∶1，V/V)溶液，超聲提取30 min，4 000 r/min離心5 min，收集上清液，對殘渣重復上述操作2次，合并上清液至分液漏斗中，加入10.0 mL 0.9%氯化鈉溶液，振蕩搖勻后靜置，收集下層氯仿，氯仿加入適量無水硫酸鈉脫水過濾后于30 ℃氮吹至近干，得到粗磷脂提取物。

采用氨基固相萃取柱完成磷脂的凈化，將粗磷脂提取物置于10.0 mL玻璃試管中，加入2.00 mL氯仿溶解樣品。氨基固相萃取柱先用5.00 mL氯仿活化，將溶解的試樣移入氨基固相萃取柱中，依次用10.0 mL 氯仿-異丙醇(2∶1，V/V)溶液和10.0 mL乙醚-乙酸(72∶1，V/V)溶液淋洗小柱，再依次用10.0 mL甲醇和10.0 mL甲醇-氯仿-2%鹽酸水(100∶200∶1，V/V/V)溶液洗脫，合并洗脫液；在30 ℃下氮吹至近干，加入適量正己烷-異丙醇(2∶3，V/V)溶液溶解試樣并定容至10.0 mL，取1.00 mL過0.45 μm尼龍濾膜后上機檢測分析。

1.2.2 色譜條件

色譜條件參考文藝曉等[23]的研究，柱溫：30 ℃；流速：1.5 mL/min；載氣壓力：50 psi；漂移管溫度：65 ℃，噴霧器：加熱模式75%；流動相：A為正己烷-三乙胺(2 500∶1，V/V)溶液，B為丙醇，C為13%乙酸溶液；梯度洗脫程序見表2。

表2 流動相梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution program of mobile phases

1.3 標準溶液配制及標準曲線

分別準確稱取30.0 mg磷脂酰膽堿、20.0 mg溶血磷脂酰膽堿、10.0 mg磷脂酰乙醇胺、10.0 mg磷脂酰肌醇和10.0 mg鞘磷脂，用正己烷-異丙醇(2∶3，V/V)溶液溶解定容至10.0 mL作為標準儲備液。取適量標準儲備溶液用正己烷-異丙醇(2∶3，V/V)溶液稀釋配制系列標準工作溶液。將標準系列工作液分別注入液相色譜儀，如圖1所示，混合標準工作液中的5種磷脂可以達到很好地分離效果，而且基線平穩(wěn)、干擾少，能在15 min內(nèi)完成一次分析。以系列標準溶液中各磷脂質(zhì)量濃度對數(shù)值作橫坐標，以相應色譜峰峰面積對數(shù)值作縱坐標，標準曲線見表2。根據(jù)蒸發(fā)光散射檢測原理y=axb，其中y指峰面積；x指磷脂標準溶液質(zhì)量濃度(mg/L)；a、b與蒸發(fā)溫度、流動相性質(zhì)等條件有關(guān)的常數(shù)，由于y和x為非線性關(guān)系，因此對等式兩邊取對數(shù)，則線性標準曲線方程為lgy=blgx+lga。

圖1 5種磷脂混合標準溶液的液相色譜圖(1-PE；2-PI；3-PC；4-SM；5-LPC)Fig.1 Liquid chromatogram of 5 kinds of phospholipid mixed standard solution(1-PE；2-PI；3-PC；4-SM；5-LPC)

1.4 試樣測定與數(shù)據(jù)處理

取試樣溶液注入液相色譜儀中，按相同色譜條件進行測定，記錄色譜峰的保留時間和峰面積，外標法定量。試樣溶液中各磷脂的響應值應在標準曲線范圍內(nèi)，超出范圍的試樣溶液可適當稀釋后再進行測定。

表3 磷脂標準曲線及R2值Tab.3 Standard curve and R2 value of phospholipids

2 結(jié)果與討論

2.1 不同來源標準品對結(jié)果影響

磷脂按照來源，可分為動物來源、植物來源和微生物來源，動物性來源的磷脂主要來自蛋黃、腦部組織、肝臟及水產(chǎn)動物等，水產(chǎn)動物尤其是海洋動物含有豐富的二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)。磷脂標準品分為植物來源(大豆)和動物來源(PI為牛肝臟來源，PC、PE、LPC、SM為雞蛋黃來源)2種不同生物來源，如圖2所示，不同來源標準品的響應值(峰面積)不同，經(jīng)對比分析，同濃度的大豆來源磷脂標準品色譜峰面積大于動物來源標準品(比值在1.11～1.36之間)，影響樣品定量結(jié)果。由于動物來源磷脂中脂肪酸碳鏈長度和不飽和脂肪酸種類及占比與水產(chǎn)品中磷脂更接近，因此宜選用動物性來源標準品。

圖2 5種磷脂混合標準溶液的液相色譜圖(左圖：大豆來源；右圖：動物來源)Fig.2 Liquid chromatogram of 5 kinds of phospholipid mixed standard solution (Left: soybean source; Right: animal source)

2.2 提取、凈化條件優(yōu)化

采用A：氯仿-甲醇(2∶1，V/V)、B：氯仿-甲醇(1∶2，V/V)、C：二氯甲烷-甲醇(2∶1，V/V)、D：95%乙醇、E：乙醇-丙酮(1∶1，V/V)、F：正己烷、G：正己烷-乙酸乙酯(7∶3，V/V)7種有機溶劑或混合溶液提取南極磷蝦粉中的磷蝦油，比較不同提取溶劑對南極磷蝦油得率及磷脂含量的影響。由圖3可知，采用95%乙醇溶液和氯仿-甲醇(2∶1，V/V)提取得到的南極磷蝦油得率最高，正己烷提取的南極磷蝦油得率最低，而在正己烷中加入極性相對較強的乙酸乙酯，磷蝦油得率有明顯提高。

圖3 有機溶劑提取南極磷蝦油得率Fig.3 The yield of Antarctic krill oil extracted by organic solvent

進一步分析不同溶劑提取的南極磷蝦粉中磷脂，如表4所示，通過乙醇提取得到的磷脂在色譜圖中有干擾峰；不同溶劑提取得到南極磷蝦油中均含有PC和LPC，其中95%乙醇和氯仿-甲醇(2∶1，V/V)溶液提取得到的PC、LPC和PE含量相近且最高；正己烷提取得到的磷蝦油中PC和LPC含量最少。綜合考慮，本方法采用氯仿-甲醇(2∶1，V/V)進行磷脂的提取。

表4 不同溶劑提取的南極磷蝦粉中磷脂含量Tab.4 Phospholipid content in Antarctic krill meal extracted with different solvents (mg·g-1)

根據(jù)前期磷蝦油中磷脂研究及文獻報道[23-25]，繼續(xù)選用氨基固相萃取柱作為凈化柱。由于前期研究以氯仿-異丙醇(2∶1，V/V)、乙醚-乙酸(72∶1，V/V)、甲醇分別作為淋洗液和洗脫液對磷蝦油中PE、PC、LPC 3種磷脂進行富集凈化，本研究發(fā)現(xiàn)僅用甲醇作為洗脫液時，PI的洗脫效果較差(PI易溶于氯仿-甲醇)，采用10.0 mL甲醇和10.0 mL甲醇-氯仿-2%鹽酸水(100∶200∶1，V/V/V)兩種溶液洗脫后再合并洗脫液的方法，對PI有較好洗脫效果。磷蝦油磷脂檢測結(jié)果表明，磷蝦油中含量最高的是PC，其次為LPC，最后是PE，與文獻報道的磷脂含量趨勢一致[8]。

2.3 定量限和檢出限

根據(jù)空白樣品加標以信噪比(S/N≥10)確定定量限，PC定量限為0.60 mg/g，PE、PI、SM的定量限為0.20 mg/g，LPC定量限為0.40 mg/g。

2.4 加標回收率和精密度

采用處理后的牡蠣、虹鱒、磷蝦粉樣品作為空白基質(zhì)，分別添加不同量的磷脂混合標準溶液，用本方法進行驗證，具體加標量見表5。5種磷脂的加標回收率及精密度良好，加標回收率范圍為77%～102%，RSD范圍為0.75%～9.78%，結(jié)果表明該方法具有較好的回收率和良好的精密度。

表5 不同固體基質(zhì)磷脂加標回收率和精密度Tab.5 Spiked recovery and precision of phospholipids from different solid matrices

2.5 樣品分析結(jié)果

對磷蝦粉、牡蠣粉、虹鱒、刺參粉等不同樣品檢測分析結(jié)果如表6所示，磷蝦粉中主要含有PE、PC、LPC 3種磷脂，其中PC含量在29.71～35.30 mg/g之間，占總磷脂含量的85.20%～90.14%，遠高于其他樣品，其次為LPC含量在2.55～4.12 mg/g之間，PE含量為0.99～2.01 mg/g，但PI、SM未檢出；乳山牡蠣凍干粉樣品中PC含量最高，在10.75～12.90 mg/g之間，占總磷脂含量的63.67%～70.08%；其次為PE含量在2.49～4.40 mg/g之間，PI和SM含量分別為1.64～2.32 mg/g和0.46～0.90 mg/g，部分樣品中未檢出；虹鱒鮮樣中也是PC含量最高，含量范圍在5.33～6.64 mg/g之間，占總磷脂含量的65.14%～72.25%，其次為PE含量在2.10～2.55 mg/g之間，PI和SM僅有部分樣品檢出，含量少且低于0.5 mg/g；刺參凍干粉樣品中主要含有PC、PE以及PI，其中PC含量最高，為15.84～20.41 mg/g，占總磷脂含量的74.23%～79.18%，其次為PE含量在2.90～3.69 mg/g之間，PI含量為1.60～2.70 mg/g，但未檢出LPC和SM。

表6 不同水產(chǎn)品樣品中磷脂含量Tab.6 Phospholipid content in different aquatic product samples

此外，對海膽醬、蟹黃、鱘魚子以及海參性腺等水產(chǎn)品生殖腺組織中磷脂含量分析，含量如表7所示。海膽黃中主要含有PE、PC、LPC、SM 4種磷脂，其中PC含量最高；大閘蟹蟹黃中含有PC、PE和SM 3種磷脂，其磷脂總量和海膽黃相近；鱘魚子醬中只檢出PC，且含量為4種性腺樣品中最高；海參性腺樣品主要含有PE和PC 2種磷脂，但含量較少，均低于1.00 mg/g。

表7 不同水產(chǎn)品性腺中磷脂含量Tab.7 Phospholipid content in gonads of different aquatic products

3 結(jié)論

磷脂的分析檢測由于儀器、樣品來源、計算原理、方法不一致等給結(jié)果對比帶來困難，因此，建立一種統(tǒng)一可用的檢測方法是十分必要的。本研究建立了HPLC-ELSD測定水產(chǎn)品中5種磷脂的定性和定量分析方法，并對方法的回收率及精密度進行了驗證。樣品分析結(jié)果表明，牡蠣、虹鱒、刺參、磷蝦粉等不同水產(chǎn)品中磷脂含量豐富，但組成和含量存在差異，其中含量最高的磷脂均為磷脂酰膽堿，其次為磷脂酰乙醇胺，其他3種磷脂即溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇和鞘磷脂僅在部分樣品中檢出，且含量較少。