李顏利,王麗聰

1(四川輕化工大學 化學工程學院, 四川 自貢，643000)2(江陰職業(yè)技術(shù)學院 環(huán)材系，江蘇 江陰，214405)

玉米加工過程中最主要的副產(chǎn)物就是玉米麩質(zhì)，約占玉米產(chǎn)量的14%～20%，其中含有大量的纖維素、淀粉、半纖維素、多糖、酚酸等物質(zhì)，阿拉伯木聚糖(arabinoxylan, AX)在玉米麩質(zhì)中含量較大[1-2]。AX由主鏈木聚糖、側(cè)鏈阿拉伯呋喃糖連接而成，還有一定量的羥基肉桂酸(hydroxycinnamic acid, HA)，如阿魏酸(ferulic acid, FA)或?qū)ο愣顾?p-coumaric acid,p-CA)通過酯鍵連接在阿拉伯呋喃糖的C(O)-5位上[3-4]。AX的提取方法很多，由于AX的結(jié)構(gòu)特點，易與其他細胞壁物質(zhì)間存在物理交聯(lián)或化學結(jié)合[5]。AX與玉米麩質(zhì)中的纖維素和木素以氫鍵和酯鍵連接，非常緊密，很難溶出，堿液可以破壞細胞壁間與AX的交聯(lián)和結(jié)合，使AX游離出來的同時不降低相對分子質(zhì)量[6-8]。因此，通常采用堿液提取AX。雖然堿提取AX的提取率較高，但是同時會降低FA和p-CA含量。FA和p-CA在AX中含量雖少，但卻是AX的重要組成部分，它們的存在極大地影響了AX的性能，不僅改變AX本身的物化性能，包括黏度、溶解性、氧化凝膠性等，還使AX具有一定的生物活性[9-10]。

HA屬于酚酸類，除了FA、p-CA之外，主要還包括芥子酸(sinapic acid, SA)、咖啡酸(caffeic acid, CA)等。芥子酸廣泛存在于各種植物中[11]。近年來，國內(nèi)外對SA的研究越來越多，研究發(fā)現(xiàn)芥子酸及其衍生物具有多種生物活性，可應用于化妝品、食品、保健品、制藥等多個領域[12]。

有研究報道，芥子酸衍生物的結(jié)構(gòu)和生物活性都比游離的SA高[13-14]，因此芥子酸衍生物的應用前景更為廣闊，開發(fā)芥子酸衍生物更具有實際意義。本文用SA對玉米麩質(zhì)中提取的阿拉伯木聚糖(corn arabinoxylan, CAX)進行化學改性，得到芥子酸衍生物玉米麩質(zhì)阿拉伯木聚糖芥子酸酯(SA-CAX)，從而提高CAX的酚酸含量進而改變CAX的物理化學性質(zhì)和生物活性等。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根據(jù)文獻[15]中的方法從玉米麩質(zhì)中提取并分級出阿拉伯木聚糖(CAX)；6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，trolox)、D2O (AR)，北京百靈威科技有限公司；2,2′-偶氮雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(2,2′-azobis-2-methyl-propanimidamide, dihydrochloride，AAPH) (分析純)，美國Sigma公司；SA、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、NaOH、乙醇、LiCl、吡啶、SOCl2、四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)等 (AR),上海易恩化學技術(shù)有限公司；熒光素鈉鹽(AR)，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

OMNISEC凝膠滲透色譜儀，英國馬爾文儀器有限公司；Frontier Near/Mid-IR Std傅里葉紅外、Varioskan LUX多功能酶標儀、Haake MARS iQ流變儀，美國賽默飛世爾科技公司；LC 1100高效液相色譜，美國安捷倫公司；Bruker DRX 400核磁共振，德國布魯克公司；UV5紫外可見分光光度計，瑞士梅特勒托利多。

1.3 實驗方法

1.3.1 SA-CAX的制備

用50 mL絕干THF溶解0.5 g (2.2 mmol)芥子酸，加入到三口燒瓶中，Ar保護，用10 mL絕干THF稀釋0.32 mL(4.4 mmol) SOCl2，加入到恒壓滴液漏斗中，0～5 ℃下，30 min內(nèi)逐滴滴加SOCl2，70 ℃反應6 h，旋蒸除去THF和過量的SOCl2，得到中間體芥子酸酰氯，無需進一步純化，干燥密封保存待用。

取1 g CAX和30 mL含4%(質(zhì)量分數(shù))LiCl的絕干DMSO溶劑于250 mL三口燒瓶中，N2保護，加熱至80 ℃待CAX溶解后冷卻至室溫，向反應液中加入一定量吡啶(吡啶的用量為芥子酸酰氯摩爾量的1.5倍)，分別將不同量的芥子酸酸酰氯溶解在DMSO中，在冰浴下用恒壓滴液漏斗逐滴滴入反應液，撤除冰浴，緩慢升溫至100 ℃持續(xù)反應14 h，反應結(jié)束，冷卻至室溫，向反應液中緩慢加入4倍量體積的無水乙醇，大量白色絮狀物析出，室溫下靜置24 h，過濾，固體冷凍干燥得到SA-CAX。

1.3.2 SA-CAX的芥子酸取代度測試

精確稱量1 g SA-CAX，加入25 mL 1 mol/L NaOH溶液和30 mg無水Na2SO3，室溫攪拌2 h，用HCl (1 mol/L)調(diào)節(jié)溶液pH使pH=3，過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，定容。用高效液相色譜檢測SA的含量，色譜條件參照文獻[15]進行。將不同濃度的芥子酸標準品繪制出標準曲線，然后按照公式(1)計算取代度(n)，SA-CSX用SA-CAX-n表示。

(1)

式中：m為SA的質(zhì)量，M為SA的分子質(zhì)量，m′為SA-CAX的質(zhì)量，MX為木糖的分子質(zhì)量，MA為阿拉伯糖的分子質(zhì)量，A/X為指阿拉伯糖和木糖的比值。

1.3.3 分子質(zhì)量分布測試

將CAX和SA-CAX-n配制成1.0%(質(zhì)量分數(shù))水溶液，標樣為普魯蘭，測試方法參照文獻[15]。

1.3.4 紅外光譜檢測

測試方法參照文獻[15]進行。

1.3.5 核磁共振

測試方法參照文獻[15]進行。

1.3.6 紫外吸收性能測試

將純化后的CAX和SA-CAX-n配制成1 mg/mL的水溶液，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描。

1.3.7 水溶液流變性能測定

將CAX和SA-CAX-n分別配制為20 mg/mL的溶液，然后在DHR-2型流變儀上測定其水溶液的流變性能。在25 ℃時，測定0～1 000 s-1的剪切速率范圍內(nèi)的黏度；0.1～10 Hz頻率范圍內(nèi)測定儲能模量(G′)和損失模量(G″)。

1.3.8 抗氧化能力指數(shù)(oxygen radical antioxidant capacity，ORAC)的測定

測試方法參考文獻[16]，配制75 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.2)，用緩沖溶液分別配制63 nmol/L的熒光素鈉鹽、20 μmol/L的trolox、153 mmol/L的AAPH溶液以及不同質(zhì)量濃度的CAX和SA-CAX-n(0.25、0.5、1、2 mg/mL)。先向96微孔板中各加入25 μL不同質(zhì)量濃度的待測液體CAX、SA-CAX-n和空白對照樣緩沖液、對照樣trolox，重復3次；再向各孔加入150 μL熒光素鈉溶液，中速振搖1 min，置于37 ℃孵育15 min；再同時向各孔中加入25 μL AAPH溶液啟動反應。將微孔板放入酶標儀中進行測試，測試條件為：激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長538 nm，每2 min測定1次各孔的熒光強度，熒光衰減呈基線后停止。

實驗中各孔不同時間點的絕對熒光強度數(shù)據(jù)與初始時間的熒光強度相比為相對熒光強度f，以相對熒光強度計算熒光衰退曲線下面積(area under curve，AUC)，AUC按公式(2)計算：

AUC=2×(f0+f1+f2+…+fn-1+fn)-f0-fn

(2)

式中：fn為第n個測試點的相對熒光強度。

測試結(jié)果用ORAC值表示，可根據(jù)公式(3)計算：

(3)

式中：Ctrolox是標準品trolox的濃度,μmol/L；C樣品是樣品的質(zhì)量濃度，g/L。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 SA-CAX的制備及表征

本文通過對玉米麩質(zhì)阿拉伯木聚糖進行改性得到SA-CAX，其合成路線如圖1所示。

圖1 SA-CAX的合成路線

多糖的取代度用n表示，不同取代度的SA-CAX可表示為SA-CAX-n。原料CAX中并不含有SA，僅含少量FA。SA用量與CAX的糖苷鍵的摩爾比以及SA-CAX-n的取代度與產(chǎn)率如表1所示。改性后多糖SA-CAX-n的取代度隨SA的用量的增多而增加，合成的產(chǎn)率較高，均在90%以上。多糖支鏈的分子質(zhì)量、極性和分支程度對多糖的物理和化學性質(zhì)影響較大，如黏度、水溶性等[1]，SA本身水溶性差，接枝到CAX使CAX的分支程度增大，會降低在水中的溶解度。因此，本文選SA-CAX-0.27、SA-CAX-0.31和SA-CAX-0.36這3個樣品進行性能研究。

表1 SA-CAX-n合成的產(chǎn)率和取代度

2.2 CAX與SA-CAX-n的分子質(zhì)量分布

CAX的分子質(zhì)量分布如文獻[17]，改性產(chǎn)物SA-CAX-n的分子質(zhì)量的分布如圖2所示，CAX與SA-CAX-n的重均分子質(zhì)量(Mw)、數(shù)均分子質(zhì)量(Mn)如表2所示。顯示CAX與SA-CAX-n的分子質(zhì)量都只有一個峰，表明改性前后的多糖的分子質(zhì)量均一性較好。原料CAX分子質(zhì)量為3.06×105g/mol，分散系數(shù)(Mw/Mn)為3.21；改性后SA-CAX-0.27、SA-CAX-0.31和SA-CAX-0.36的分子質(zhì)量分別為3.37×105、3.59×105和3.85×105g/mol，與此同時分散系數(shù)分別為3.52、3.64和3.52。改性后多糖的取代度的增加，SA-CAX-n的分子質(zhì)量和分散系數(shù)均隨之增大，表明改性后分子質(zhì)量變大，分布也變寬。

圖2 SA-CAX-n的相對分子質(zhì)量分布

表2 CAX和SA-CAX-n的分子質(zhì)量分布

2.3 紅外光譜分析

改性產(chǎn)物SA-CAX-0.27、SA-CAX-0.31和SA-CAX-36的紅外圖譜如圖3所示。原料CAX的紅外如文獻[17]，CAX多糖的特征峰在897、1 191、1 045、1 415、1 634、2 854、3 413 cm-1，圖3中不同取代度的SA-CAX-n都保留CAX的特征峰，在1 760 cm-1處均出現(xiàn)1個新的吸收峰，代表SA苯環(huán)上的酯鍵上的羰基峰，證明SA和CAX以酯鍵形式連接，SA含量越多吸收峰越明顯。

圖3 SA-CAX-n的紅外圖譜

2.4 核磁譜圖分析

改性產(chǎn)物SA-CAX-0.27、SA-CAX-0.31和SA-CAX-36的核磁氫譜如圖4-A所示，核磁碳譜如圖4-B所示。

A-氫譜圖；B-碳譜圖

綜合分子質(zhì)量分布、紅外、核磁氫譜和碳譜，證明芥子酸已成功連接到CAX上。

2.5 CAX和SA-CAX-n的紫外吸收

由CAX和SA-CAX-n的紫外吸收光譜(圖5)可知，CAX在紫外下無吸收峰，表明原料CAX純度較高，無核酸(260 nm)、多肽和蛋白質(zhì)(280 nm)[18]。改性后SA-CAX-n在250～380 nm波段內(nèi)具有吸收，并且在320 nm左右處紫外吸收最強，表明SA-CAX-n對UVB波段的紫外線有一定的屏蔽作用。SA含有肉桂酸基團，具有π-π*電子躍遷，對光具有反應活性，SA連接在CAX上也可以屏蔽紫外光[19-20]，而且同樣濃度下SA的取代度越高，其紫外吸收作用越強。

圖5 CAX和SA-CAX-n的紫外圖譜

2.6 流變性能

25 ℃時，剪切速率不同對SA-CAX-n和CAX水溶液黏度的影響如圖6所示。CAX是以線性結(jié)構(gòu)的形式存在于水溶液中，CAX在水中旋轉(zhuǎn)，分子間彼此碰撞，產(chǎn)生摩擦，因此CAX的黏度較大[21]。由圖6可以看出，相同質(zhì)量濃度(20 mg/mL)和剪切速率下，SA-CAX-n的黏度比CAX的黏度大得多，主鏈結(jié)構(gòu)相同的情況下，支鏈程度越高，SA-CAX-n在水溶液中旋轉(zhuǎn)時所需要的空間更大，分子間碰撞的幾率更高，因此SA-CAX-n水溶液黏度增加，而且隨著取代度增加，SA-CAX-n的支鏈程度提高，因此其水溶液黏度也隨之增大。SA-CAX-0.36的黏度大幅度提高，甚至形成凝膠(圖7)，圖7是質(zhì)量濃度為20 mg/mL的SA-CAX-n和CAX水溶液。

圖6 25 ℃時CAX和SA-CAX-n水溶液黏度隨剪切速率的變化

圖7 CAX 和 SA-CAX-n的水溶液照片

圖8是CAX和SA-CAX-n水溶液的儲能模量(G′)和耗能模量(G″)隨頻率的變化曲線，圖9是SA-CAX-0.36溶液在頻率為1 Hz時的G′和損耗角(tanδ=G′/G″)隨濃度的變化曲線。CAX和所有SA-CAX-0.36水溶液的G′和G″均隨頻率的增加而逐漸增加，在所有頻率范圍內(nèi)，G′>G″，并且tanδ<1；SA-CAX-0.36溶液的G′在1 Hz時隨濃度的增加而增加，tanδ隨濃度的增加而降低，表明SA-CAX-n水溶液具有一定的弱凝膠性質(zhì)；其凝膠性能隨著取代度的增加而增加，和圖7結(jié)果一致，并且SA-CAX-n的黏度和黏彈性結(jié)果相互吻合。

圖8 SA-CAX-0.36水溶液的G′和G″隨頻率的變化曲線

圖9 SA-CAX-0.36的儲能模量G′和損耗角tan δ在1 Hz時隨濃度的變化曲線

2.7 ORAC的測定

ORAC測定方法是AAPH產(chǎn)生過氧自由基，過氧自由基會使熒光素鈉的熒光特性消失，加入抗氧化劑，可以阻止或延緩熒光衰減，因此抗氧化性越強，熒光衰退越慢[22]。本實驗以無抗氧化劑存在時的自由基(Blank)作為對照(圖10-A)，14 min時熒光消退至基線，標準抗氧化物質(zhì)(trolox)的熒光在38 min消失，原料CAX用量在0.25～2 mg/mL熒光在20～25 min消失。加入改性后的多糖SA-CAX-n熒光消失的時間逐漸延長(圖10-B～圖10-D)。相同質(zhì)量濃度下，取代度增加熒光消退時間延長；取代度相同時，熒光消退時間隨質(zhì)量濃度增加而延長。多糖的抗氧化性可以用抗氧化能力指數(shù)(ORAC值)表示[16]。

A-CAX和對照樣品的熒光衰減曲線；B-SA-CAX-0.27的熒光衰減曲線；C-SA-CAX-0.31的熒光衰減曲線；D-SA-CAX-0.36的熒光衰減曲線

由表3可以看出，SA-CAX-n的ORAC值隨質(zhì)量濃度的增大和取代度的增大而增大，即抗氧化性增大。SA連接到CAX可以增強CAX的抗氧化能力，取代度越高抗氧化能力越強。SA屬于羥基肉桂酸，酚羥基是供氫體，與自由基結(jié)合，氧原子上不成對單電子與苯環(huán)上的π電子云作用發(fā)生共軛效應，使成電子部分分布到苯環(huán)上，自由基能力降低，因此自由基不再引發(fā)鏈式反應，因此改性后多糖的抗氧化性主要受SA含量的影響，SA含量越高，改性多糖的抗氧化性越強[23]。

表3 CAX和SA-CAX-n的相對ORAC值

3 結(jié)論

本文從玉米麩質(zhì)中提取出CAX，并與SA進行酯化反應，得到SA-CAX-n，液相分析確定了取代度，綜合了紅外光譜、核磁氫譜和碳譜確定其結(jié)構(gòu)，用高效液相分析確定了改性多糖的取代度，用凝膠滲透色譜測試不同取代度的多糖的分散性和分子質(zhì)量分布。然后對不同取代度多糖(SA-CAX-0.27、SA-CAX-0.31、SA-CAX-0.36)的性能進行了研究，發(fā)現(xiàn)原料CAX無紫外吸收，改性后SA-CAX-n在UVB波段具有紫外吸收，紫外吸收隨著SA取代度的增加而增強；SA-CAX-n水溶液的黏度較CAX有明顯增大，且具有一定的黏彈性，隨取代度增加而增加；SA-CAX-n的抗氧化能力比原料CAX強，并且隨著取代度的增加和質(zhì)量濃度的增加，其抗氧化力隨之增強。因此SA-CAX在化妝品、食品、保健品等領域具有廣闊的應用前景。