楊雪飛,李 達(dá),黃 挺,張志娣，葉知鋒,劉 冰

(1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院腫瘤科·浙江 杭州 310007;2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院·浙江 杭州 310007；3浙江省中醫(yī)藥研究院·浙江 杭州 310007)

益氣養(yǎng)陰散結(jié)方系全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室指導(dǎo)老師、浙江省級(jí)名中醫(yī)、杭州市中醫(yī)院張志娣主任中醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)方，由黃芪、南北沙參、天麥冬、制首烏、枸杞、生牡蠣等組成，前期臨床觀察結(jié)果表明，本方聯(lián)合EGFR-TKIs可延長(zhǎng)生存期(中位OS)，提高疾病控制率，改善臨床證候，提高生活質(zhì)量[1]。此外，動(dòng)物預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，益氣養(yǎng)陰散結(jié)方具有顯著抑瘤效果。本研究在前期臨床與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用BALB/c荷A549裸小鼠為研究對(duì)象，探討益氣養(yǎng)陰散結(jié)方對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、瘤內(nèi)脂肪沉積及血清瘦素、脂聯(lián)素的影響，為今后臨床與實(shí)驗(yàn)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株 SPF級(jí)BALB/c雄性裸鼠30只，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(浙)2015-0008，分籠飼養(yǎng)，相對(duì)濕度 40%～50%，室溫 20～25℃。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。人肺腺癌A549細(xì)胞株購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑與儀器 益氣養(yǎng)陰散結(jié)方藥劑制備：依處方稱取黃芪、南沙參、北沙參、天冬、麥冬、制首烏等9味藥材，水煎2次，合并濾液，濃縮至生藥濃度2 g/mL，備用。順鉑注射液：江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20040813，批號(hào)：180804，規(guī)格：30 mg∶6mL。Mouse Leptin ELISA Kit、Mouse Adiponectin ELISA Kit：杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；油紅O染液：美國(guó)Sigma-Aldrich公司。BX43型顯微鏡：OLYMPUS公司；DW-86L388型超低溫冰箱：青島海爾集團(tuán)；CM1860UV型冰凍切片機(jī)：德國(guó)LEICA公司；SpectraMax Plus 384型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)MD公司。

2 方法

2.1 模型制備與分組給藥 取BALB/c小鼠，常規(guī)皮下接種A549單細(xì)胞懸液以復(fù)制模型，隨機(jī)分為5組，每組6只，即：模型組、順鉑組和益氣養(yǎng)陰散結(jié)方低、中、高劑量組。 接種24 h 后，各組動(dòng)物按如下劑量給予相應(yīng)藥物：模型組予等量生理鹽水，順鉑組予順鉑4 mg/kg，益氣養(yǎng)陰散結(jié)方低中高劑量組予5、10、20 g/kg益氣養(yǎng)陰散結(jié)方。模型組及益氣養(yǎng)陰散結(jié)方各組灌胃給藥，每日1次；順鉑組腹腔注射給藥，每周2次。連續(xù)給藥8 周。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 腫瘤體積及腫瘤生長(zhǎng)曲線 從用藥第1天開(kāi)始，隔日以游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)徑(a)與垂直徑(b)，計(jì)算腫瘤體積(V)，直至第8周觀察結(jié)束。V=ab2/2，取各組平均值，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。

2.2.2 血清瘦素、脂聯(lián)素含量測(cè)定 末次給藥后12 h，眼眶取血，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)(ELISA法)檢測(cè)血清瘦素、脂聯(lián)素含量。

2.2.3 抑瘤率 末次給藥后12 h,眼眶取血后處死動(dòng)物，剝離腫瘤塊，稱重，按以下公式計(jì)算抑瘤率：抑瘤率=(模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%

2.2.4 瘤內(nèi)脂肪沉積觀察 取瘤組織，制備冰凍切片，置于油紅O染色劑中染色15 min；用60%乙醇分色，水洗；置于蘇木素中染色30 s，用水沖洗至變藍(lán)；甘油PBS封固，光鏡下觀察并攝片。

3 結(jié)果

3.1 成瘤及裸鼠一般情況 30只裸鼠均成瘤，成瘤率100 %，成瘤時(shí)間為細(xì)胞種植后第5～12天，集中于第9～11天。腫瘤細(xì)胞種植后第15天，平均腫瘤直徑為3.7 mm。成瘤早期，裸鼠體質(zhì)量及活動(dòng)情況無(wú)明顯改變，隨著腫瘤形成、增大，裸鼠逐漸消瘦，活動(dòng)量減少。各實(shí)驗(yàn)組之間裸鼠體質(zhì)量無(wú)明顯差異，實(shí)驗(yàn)前后裸鼠的體質(zhì)量亦無(wú)明顯差異。在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，模型組與中藥中劑量組各死亡1只裸鼠。

3.2 各組小鼠腫瘤體積變化 與模型組比較，順鉑組腫瘤體積在D22～D52顯著減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，D54時(shí)極顯著減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；中藥低、中劑量組腫瘤體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中藥高劑量組腫瘤體積在D24～D54顯著減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中在D48、D50、D52時(shí)極顯著減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線

3.3 各組小鼠瘤重、抑瘤率比較 見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠瘤重、抑瘤率比較

3.4 各組小鼠血清瘦素、脂聯(lián)素含量與脂聯(lián)素/瘦素比較 見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清瘦素、脂聯(lián)素含量與脂聯(lián)素/瘦素比較

3.5 各組小鼠瘤內(nèi)脂肪沉積比較 與模型組比較，順鉑組、中藥低、中、高劑量組瘤內(nèi)脂肪沉積均顯著減少。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠瘤內(nèi)脂肪沉積比較

4 討論

肺癌屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)“肺積”“喘咳”“肺脹”等范疇。本病總的病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，虛則氣陰虧虛，實(shí)則痰濕、癌毒壅積肺臟；蓋因煙氣薰炙，或因久病致虛，耗散肺臟陰氣，因虛致實(shí)；或因放化療之邪毒侵襲，灼傷肺津，熱傷肺絡(luò)，痰濁阻于肺絡(luò)；痰熱內(nèi)蘊(yùn)日久，余熱留戀，耗傷正氣，久熱傷陰。諸般證候紛至沓來(lái)， 終致氣陰兩虛而邪毒壅塞。肺為嬌臟，喜潤(rùn)而惡燥，邪毒壅塞則愈發(fā)失于宣發(fā)肅降，從而加重咳喘、痰飲諸癥[2-3]。

上世紀(jì)七十年代，楊少山名老中醫(yī)創(chuàng)立“養(yǎng)肺陰益中氣”為主的肺癌治療法則。張志娣主任醫(yī)師受業(yè)于楊老中醫(yī)，張師根據(jù)多年侍診心得，結(jié)合自身臨床經(jīng)驗(yàn)及非小細(xì)胞肺癌病因病機(jī)，擬定益氣養(yǎng)陰散結(jié)方。方中黃芪補(bǔ)益脾肺之氣，是為君藥；南北沙參、天麥冬、制首烏、枸杞助君藥滋陰潤(rùn)肺生津，俱為臣藥；復(fù)以生牡蠣、浙貝化痰祛濕散結(jié)，桑白皮清熱化痰，均系佐使。攻補(bǔ)兼施，抑邪扶正[1]。

前期臨床觀察結(jié)果表明，在EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌中，益氣養(yǎng)陰散結(jié)方聯(lián)合EGFR-TKIs能延長(zhǎng)EGFR-TKIs繼發(fā)耐藥的晚期非小細(xì)胞肺癌生存期；與化療組(多西他賽/培美曲塞+順鉑/卡鉑)及EGFR-TKIs組比較，疾病控制率顯著提高，臨床證候顯著改善；與EGFR-TKIs組比較，生活質(zhì)量顯著提高。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，益氣養(yǎng)陰散結(jié)方具有顯著抑瘤效果[4]。

脂肪沉積、脂代謝異常與腫瘤發(fā)生及侵襲性成正相關(guān)性。脂肪促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移，并與其轉(zhuǎn)歸與預(yù)后關(guān)系密切。在腫瘤組織主導(dǎo)下，白色脂肪發(fā)生棕化，形成了與腫瘤生長(zhǎng)相適應(yīng)的微環(huán)境。即使在有氧條件下，腫瘤組織也展現(xiàn)出特有的代謝異常，如葡萄糖有氧酵解、氧化磷酸化減弱、脂肪酸從頭合成、β-氧化反應(yīng)活躍；籍此營(yíng)造的乏氧微酸微環(huán)境，對(duì)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。此外，脂肪沉積也為腫瘤細(xì)胞維持其高速增殖提供充足能量。作為重要的脂肪細(xì)胞因子，瘦素/脂聯(lián)素與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展成正相關(guān)/負(fù)相關(guān)關(guān)系，在腫瘤發(fā)病與治療方面發(fā)揮重要作用[5-11]。本研究結(jié)果顯示，益氣養(yǎng)陰散結(jié)方可顯著降低血清瘦素水平，顯著提高血清脂聯(lián)素水平，顯著提高脂聯(lián)素/瘦素比值。

綜上所述，益氣養(yǎng)陰散結(jié)方可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，顯著減少瘤內(nèi)脂肪沉積，顯著降低血清瘦素水平，顯著提高血清脂聯(lián)素水平，顯著提高脂聯(lián)素/瘦素比值，從而發(fā)揮抗癌作用。以上研究結(jié)果為本方進(jìn)一步臨床與實(shí)驗(yàn)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。