王延輝， 何豪， 戴金洪， 敬凱

(云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生物能源持續(xù)開(kāi)發(fā)利用教育部工程研究中心，云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

人類活動(dòng)所致棲息地破壞和水環(huán)境變化是兩棲動(dòng)物種群數(shù)量降低甚至物種滅絕的主要因素之一[1].工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及人類生活產(chǎn)生大量的水體污染物，其種類復(fù)雜，既有農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)帶來(lái)的農(nóng)藥或化肥殘留以及生活污水，也有現(xiàn)代工業(yè)產(chǎn)生的新型污染物.兩棲動(dòng)物對(duì)這些物質(zhì)極為敏感，其半致死濃度(LC50)通常較低，而水體中殘留污染物的濃度卻往往超過(guò)其數(shù)倍[2]，因而水環(huán)境對(duì)兩棲動(dòng)物的生存和繁殖具有重要影響.

細(xì)胞微核率通常作為生物遺傳毒性的一個(gè)指示性變量，可反映環(huán)境污染物對(duì)生物的綜合性危害[3].兩棲動(dòng)物對(duì)陸地生活適應(yīng)不完善，皮膚薄且通透性高，皮膚的高通透性致使水環(huán)境中污染物容易穿透皮膚，進(jìn)入血液，造成細(xì)胞DNA損傷，形成微核.如苯胺[4]和阿維菌素[5]均可導(dǎo)致兩棲類微核的出現(xiàn)，并與其DNA損傷率表現(xiàn)出線性關(guān)系.水體污染物對(duì)蝌蚪的微核率還具有時(shí)間累積效應(yīng)[6]，許多研究都表明無(wú)尾兩棲動(dòng)物微核率與水體環(huán)境因子具有直接聯(lián)系.

黑色素巨噬細(xì)胞中心(melano-macrophage centers MMCs)是水生動(dòng)物脾臟、腎臟和肝臟等的黑色素細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及抗體生成細(xì)胞等組成的復(fù)合體[7].蛙類MMCs在肝組織內(nèi)呈現(xiàn)出不規(guī)則的黑色團(tuán)塊[8]，在脾臟中也有大量分布[9].MMCs是蛙類對(duì)內(nèi)源和外源有害物質(zhì)做出的反應(yīng)，與動(dòng)物的免疫應(yīng)答過(guò)程密切相關(guān).具有參與免疫、清除內(nèi)源和外源異物、抗自由基或有毒物質(zhì)、螯合重金屬、抗病毒和抗菌等作用[10-11].其數(shù)量和大小反映了蛙類對(duì)不同水環(huán)境的免疫響應(yīng)，也是動(dòng)物對(duì)水環(huán)境適應(yīng)的重要表現(xiàn).

滇蛙(Nidiranapleuraden)是云貴高原常見(jiàn)的蛙類，隸屬于無(wú)尾目(Anura)，叉舌蛙科(Dicroglossidae)，琴蛙屬(Nidirana).滇蛙棲息地與人類活動(dòng)區(qū)域高度重疊，為主要棲息于農(nóng)田、溝渠和庫(kù)塘等靜水水域，偏水生的蛙類.目前對(duì)滇蛙的形態(tài)結(jié)構(gòu)[12]、皮膚分泌物[13]、棲息地環(huán)境[14]和微核率[15]等都有一定認(rèn)識(shí)，但對(duì)人類活動(dòng)強(qiáng)度不同棲息地中的滇蛙的生存狀況以及蛙類的遺傳和生理響應(yīng)仍缺乏相應(yīng)了解.人類活動(dòng)所致的棲息地水環(huán)境變化怎樣影響滇蛙的遺傳結(jié)構(gòu)以及滇蛙如何在免疫上響應(yīng)水環(huán)境變化的研究有助于揭示蛙類對(duì)不斷變化的水環(huán)境的適應(yīng)性.

為了解水環(huán)境對(duì)兩棲動(dòng)物的遺傳毒理效應(yīng)以及蛙類免疫的水環(huán)境適應(yīng)性，選擇云南省陸良縣小百戶鎮(zhèn)和三岔河鎮(zhèn)人類活動(dòng)強(qiáng)度不同的兩個(gè)棲息地對(duì)滇蛙血細(xì)胞微核率、肝臟和脾臟的黑色素巨噬細(xì)胞中心進(jìn)行了研究.通過(guò)測(cè)定兩個(gè)種群棲息地水環(huán)境，分析血細(xì)胞微核率以及肝臟和脾臟MMCs的數(shù)量及面積差異，了解滇蛙受到的遺傳毒性壓力和對(duì)不同水質(zhì)環(huán)境的免疫響應(yīng)，從而揭示滇蛙在人類活動(dòng)強(qiáng)度不同的棲息地如何維持其種群的生存.

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)

云南省陸良縣屬北亞熱帶高原氣候，年均氣溫14.8 ℃，降雨量850～1 250 mm，年均降雨量941.9 mm，年均蒸發(fā)量2 244.3 mm，無(wú)霜期246 d.陸良縣是云南省重要的農(nóng)業(yè)大縣，人類生產(chǎn)和生活對(duì)當(dāng)?shù)厮h(huán)境影響嚴(yán)重.壩區(qū)部分河流，如老盤江、護(hù)城河及閻芳河等水質(zhì)均在Ⅳ-Ⅴ類之間[16].兩個(gè)滇蛙種群所在的小百戶鎮(zhèn)和三岔河鎮(zhèn)直線距離約20.1 km，小百戶鎮(zhèn)為山區(qū)半山區(qū)丘陵地區(qū)，人口密度為112人/km2，稻田及旱地為滇蛙的繁殖棲息地.三岔河鎮(zhèn)大部分屬于壩區(qū)，人口密度為1 223人/km2，是陸良縣人口最多且人類活動(dòng)強(qiáng)度最大的鄉(xiāng)鎮(zhèn)，壩區(qū)的溝渠和水田等是滇蛙主要的棲息地.前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)小百戶鎮(zhèn)棲息地內(nèi)有9種蛙類，而三岔河鎮(zhèn)僅滇蛙1種蛙類.

1.2 樣本采集

2021年5月至11月于云南省陸良縣小百戶鎮(zhèn)及三岔河鎮(zhèn)采集滇蛙成體及蝌蚪.采集地涵蓋小百戶鎮(zhèn)的農(nóng)田、河流、水庫(kù)周邊和永久性水塘，三岔河鎮(zhèn)則為靠近村莊的荷塘及其溝渠.樣本采集在夜間進(jìn)行，使用強(qiáng)光手電尋找并捕獲滇蛙成體，D型抄網(wǎng)捕捉滇蛙蝌蚪，獲得滇蛙成體樣本42只.使用水質(zhì)分析儀測(cè)量采集地水體的pH值、水體溶氧量(OD)、水溫(T)和電導(dǎo)率(σ).使用兩步路戶外助手(v7.0.0.0)記錄采集地位置和海拔(A).

1.3 血液涂片及肝脾切片

于成體滇蛙心臟處取血，蝌蚪斷尾后取血1.5 mL放于離心管中，按照血清∶血液=9∶1的比例混合，制作細(xì)胞懸浮液，800 r/min的速度離心5 min，采用Gimsa染色法[17]制作微核試驗(yàn)血液涂片.取蛙肝臟和脾臟在Bouins 固定液中固定，采用石蠟切片及HE染色法[18]制作肝臟和脾臟切片.

1.4 數(shù)據(jù)采集

在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察血細(xì)胞涂片及肝臟切片并拍攝照片.觀察記錄血細(xì)胞中出現(xiàn)的微核情況，計(jì)數(shù)滇蛙血細(xì)胞涂片上單位面積的血細(xì)胞總數(shù)以及具有微核的血細(xì)胞數(shù)目以分析不同水環(huán)境中滇蛙血細(xì)胞的DNA損傷情況.每個(gè)個(gè)體制作兩張涂片，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)每張涂片計(jì)數(shù)血細(xì)胞2 000個(gè)左右，微核率以千分率(‰)表示.

為分析不同滇蛙種群的免疫反應(yīng)，觀察肝臟和脾臟切片，記錄滇蛙肝臟和脾臟的結(jié)構(gòu)特征.使用Phmias軟件，在肝臟及脾臟切片上隨機(jī)選取1 mm2面積，統(tǒng)計(jì)黑色素巨噬細(xì)胞中心(MMCs)的數(shù)量，以每個(gè)細(xì)胞邊界為準(zhǔn)，測(cè)定每個(gè)MMCs的面積，取每張切片的平均值為MMCs面積.

選擇能夠清晰觀測(cè)到細(xì)胞結(jié)構(gòu)的血涂片計(jì)數(shù)血細(xì)胞微核率，對(duì)組織結(jié)構(gòu)清晰而完整的切片進(jìn)行肝臟和脾臟的MMCs統(tǒng)計(jì).由于制片和切片原因?qū)е碌臒o(wú)法清晰識(shí)別或識(shí)別困難的樣本不納入分析，因而微核率和MMCs分析樣本數(shù)有差異.

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 棲息地環(huán)境

兩個(gè)種群滇蛙的棲息地具有相似的氣候環(huán)境，水體的水溫、溶氧量以及水體可見(jiàn)度差異均不顯著.但水體的電導(dǎo)率(P=0.033)及棲息地海拔(P=0.002)差異顯著(表1)，三岔河鎮(zhèn)海拔顯著低于小百戶鎮(zhèn)，而水體電導(dǎo)率卻顯著高于小百戶鎮(zhèn).

表1 滇蛙兩個(gè)種群棲息地的海拔和水環(huán)境因子比較

2.2 血細(xì)胞微核率

血涂片的結(jié)果顯示，兩個(gè)種群滇蛙的血液中均有不同數(shù)量血細(xì)胞出現(xiàn)微核.三岔河種群滇蛙無(wú)論是成體還是蝌蚪，其血細(xì)胞的微核率均極顯著大于小百戶種群(表2)，說(shuō)明三岔河滇蛙種群DNA受到的損傷要大于小百戶種群.

表2 滇蛙兩個(gè)種群成體和幼體血細(xì)胞微核率比較

2.3 肝臟和脾臟黑色素巨噬細(xì)胞中心

肝臟和脾臟的切片顯示，滇蛙正常肝臟(圖1a)和脾臟(圖1c)組織中均有不同數(shù)量的MMCs.兩個(gè)種群中，三岔河種群滇蛙部分個(gè)體(約1/3)肝組織內(nèi)出現(xiàn)空泡化(圖1b).空泡區(qū)肝組織內(nèi)，肝細(xì)胞數(shù)量減少，邊界模糊，組織內(nèi)出現(xiàn)較大空隙，顯示肝組織受到損傷.

MMCs:黑色素巨噬細(xì)胞中心;LC：肝細(xì)胞; KC:肝巨噬細(xì)胞;V：空泡; WP:白髓;RP：紅髓;CA:被膜.

對(duì)滇蛙兩個(gè)種群肝臟和脾臟的MMCs數(shù)量和面積的分析顯示(表3)，三岔河種群滇蛙的肝臟MMCs數(shù)量要極顯著多于小百戶種群，但MMCs面積并無(wú)顯著差異.同樣，三岔河種群的脾臟MMCs數(shù)量也顯著多于小百戶種群，面積無(wú)顯著差異.以上結(jié)果表明三岔河種群滇蛙的MMCs雖然在大小上沒(méi)有變化，但在數(shù)量上卻有顯著的上升.

表3 兩個(gè)種群滇蛙肝臟和脾臟黑色素巨噬細(xì)胞中心(MMCs)數(shù)量和大小的比較

2.4 環(huán)境因子的影響

將滇蛙成體(圖2a)及蝌蚪(圖2b)的血細(xì)胞微核率與水環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)分析顯示，水體水溫和電導(dǎo)率與成體和蝌蚪的血細(xì)胞微核率均呈顯著正相關(guān)關(guān)系；此外蝌蚪的血細(xì)胞微核率與水體pH值及溶氧呈顯著負(fù)相關(guān)，成體的血細(xì)胞微核率與水體pH及溶氧則無(wú)顯著相關(guān)性.這表明蝌蚪相較成體受環(huán)境因子的影響更大.

MR:微核率；A:海拔；pH:酸堿度；T:水溫；OD:溶氧；σ:電導(dǎo)率；*P<0.05.

滇蛙肝臟MMCs數(shù)量與棲息地水體的水溫及電導(dǎo)率呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)關(guān)系，與海拔和水體溶氧則是顯著的負(fù)相關(guān)；而肝臟MMCs面積則僅與pH呈顯著負(fù)相關(guān)(圖3).脾臟MMCs數(shù)量與滇蛙棲息地水體pH和電導(dǎo)率呈顯著正相關(guān),與海拔呈顯著負(fù)相關(guān);脾臟MMCs面積僅與電導(dǎo)率呈顯著正相關(guān)，與溶氧呈顯著負(fù)相關(guān).MMCs的數(shù)量與水環(huán)境的電導(dǎo)率關(guān)系密切，表明水體溶解物影響滇蛙的免疫結(jié)構(gòu)數(shù)量，其中肝臟MMCs受到環(huán)境因子的影響更大.

a：肝臟黑色素巨噬細(xì)胞中心數(shù)量；b：脾臟黑色素巨噬細(xì)胞中心數(shù)量；c：肝臟黑色素巨噬細(xì)胞中心面積；d：脾臟黑色素巨噬細(xì)胞中心面積；A：海拔；pH:酸堿度；T:水溫；OD：溶氧；σ：電導(dǎo)率；* 表示P<0.05.

3 討論

兩棲動(dòng)物細(xì)胞微核的出現(xiàn)是遺傳結(jié)構(gòu)對(duì)水環(huán)境中的外源物質(zhì)做出的反應(yīng)[6，19].小百戶和三岔河兩個(gè)滇蛙種群的血細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了微核.無(wú)論是在成體還是蝌蚪中，三岔河種群的血細(xì)胞微核率均比小百戶種群高.血細(xì)胞微核率與水體環(huán)境因子的相關(guān)分析顯示，微核率與水體電導(dǎo)率和水溫呈顯著的正相關(guān)，此外蝌蚪的血細(xì)胞微核率與水體pH和溶氧呈負(fù)相關(guān).血細(xì)胞微核率與電導(dǎo)率成正比，表明三岔河種群水體更高的離子濃度可能導(dǎo)致了滇蛙更大的DNA損傷.人類活動(dòng)對(duì)水質(zhì)的影響隨土地利用方式的不同出現(xiàn)差異[20-21].農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)對(duì)水質(zhì)的影響較為嚴(yán)重，三岔河鎮(zhèn)作為農(nóng)業(yè)大鎮(zhèn)，農(nóng)藥經(jīng)水循環(huán)后容易進(jìn)入滇蛙棲息地，而農(nóng)藥是引起兩棲類微核率升高的重要因素[22]，因此高強(qiáng)度的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可能是導(dǎo)致三岔河種群微核率較高的原因之一，這與李貞[23]和Borges[24]等的研究結(jié)果相似.微核可能也是滇蛙所產(chǎn)生的適應(yīng)性變異之一，微核產(chǎn)生后細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response，DDR)，對(duì)微核進(jìn)行修復(fù).微核多數(shù)情況下并不會(huì)影響細(xì)胞的正常分裂[25]，但微核細(xì)胞會(huì)被優(yōu)先清除[26]，滇蛙種群可能通過(guò)對(duì)生態(tài)遺傳毒理抗性能力的增強(qiáng)來(lái)維持種群的生存，這在非洲爪蟾上已經(jīng)被證實(shí)[27].

肝臟和脾臟都是水生動(dòng)物體內(nèi)主要的免疫器官.肝臟是蛙類體內(nèi)重要的解毒器官之一，其結(jié)構(gòu)受環(huán)境因子影響較大.三岔河種群部分個(gè)體的肝組織出現(xiàn)空泡化，空泡區(qū)內(nèi)部細(xì)胞少，表明肝臟組織損傷嚴(yán)重，肝功能受到影響，這可能與人類高強(qiáng)度活動(dòng)所致的水體嚴(yán)重污染有關(guān).

MMCs是兩棲類免疫系統(tǒng)的重要功能結(jié)構(gòu)，能對(duì)外源有害物質(zhì)做出免疫反應(yīng)，還可改變黑色素形態(tài)及分布范圍[28].MMCs對(duì)外源有害物質(zhì)和受損細(xì)胞具有吞噬作用，且可與重金屬離子進(jìn)行螯合以降低對(duì)個(gè)體的損傷.三岔河種群MMCs數(shù)量顯著多于小百戶種群，而MMCs數(shù)量與電導(dǎo)率呈正相關(guān)，與溶氧呈負(fù)相關(guān)，這可能是滇蛙適應(yīng)三岔河鎮(zhèn)人類高強(qiáng)度農(nóng)業(yè)活動(dòng)所致水環(huán)境變化的方式之一.MMCs數(shù)量增加可使滇蛙增加對(duì)微核細(xì)胞的吞噬，提高自身免疫力，維持種群在人類棲息地中的生存.對(duì)泰國(guó)稻田澤陸蛙(Fejervaryalimnocharis)的研究也得到了類似的結(jié)果，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)會(huì)使蛙類MMCs分布范圍擴(kuò)大以適應(yīng)環(huán)境[29].

脾臟中MMCs數(shù)量與環(huán)境因子的相關(guān)性與肝臟MMCs有所不同，可能脾臟MMCs與肝臟MMCs的生物學(xué)功能有一定差異[30]，需進(jìn)一步探索.