李佳,陶小榮

(南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病理學系/教育部農(nóng)作物生物災害綜合治理重點實驗室/作物免疫學重點實驗室,江蘇 南京 210095)

真菌、病毒、細菌等病原生物采取多種策略侵染植物影響植物生長發(fā)育,植物則逐漸進化出一套復雜的免疫系統(tǒng)來抵御病原生物的侵染。NLR(nucleotide binding leucine-rich repeat)蛋白是植物免疫系統(tǒng)中的一個免疫受體大家族,能夠準確識別病原生物分泌到細胞內(nèi)的效應蛋白,激活由效應蛋白觸發(fā)的免疫反應(effector-triggered immunity,ETI)。植物ETI的激活通常伴隨著過敏性反應(hypersensitive response,HR),通過誘導侵染位點的細胞死亡來限制病原生物增殖,同時引起植物激素水楊酸(salicylic acid,SA)的積累,進一步誘導鄰近細胞產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)[1-2]。

植物進化產(chǎn)生了數(shù)量龐大的NLR免疫受體用于監(jiān)測病原生物的侵染,但是NLR蛋白的數(shù)量在不同植物中存在較大差異?；谏镄畔W分析,發(fā)現(xiàn)蘋果、水稻、擬南芥中分別含有737、 438、151個 NLR蛋白,陸地植物苔蘚中含有49個,藻類植物中只在少數(shù)類群中出現(xiàn),大部分則沒有NLR[5,8]。1994年,科學家第1次克隆到植物NLR免疫受體基因,分別是煙草(Nicotianatabacum)的N基因和擬南芥(Arabidopsisthaliana)的RPS2基因[9-11]。20多年來,科學家們付出了巨大的努力,迄今已經(jīng)成功克隆了200個左右的NLR抗病基因,并且被廣泛地應用于作物抗病育種[12]。近年來,隨著蛋白質(zhì)晶體學和低溫冷凍電鏡技術的高速發(fā)展,植物NLR蛋白的結構生物學研究取得了一系列重要進展[13-14],尤其是2019年第1個植物完整NLR 受體——ZAR1激活前后結構的解析,首次發(fā)現(xiàn)了植物“抗病小體”的存在,為NLR免疫受體激活植物免疫的作用機制研究提供了全新的思路[15-19]。

1 植物NLR不同結構域的結構生物學研究

1.1 N端結構域

2011年,Bernoux等[20]解析第1個植物NLR蛋白L6的TIR結構域晶體結構。表1列舉了目前為止已報道三維結構的所有TIR結構域,包括擬南芥RPS4 TIR、RRSI TIR、SNC1 TIR、RPP1 TIR,圓葉葡萄RPV1 TIR、RUN1 TIR以及本氏煙草ROQ1 TIR[21-27]。除了RPP1和ROQ1的TIR是在免疫受體完整蛋白激活狀態(tài)下的構象外,其余免疫受體的TIR均是單獨表達TIR結構域獲取的晶體結構。如圖1-A所示,所有的TIR都呈現(xiàn)出相似的結構特征,即5 個α螺旋三維環(huán)繞4～5個平行β折疊片構象。TIR結構域具有自我聚集形成二聚體或者多聚體的能力,RPS4和RRS1的TIR結構域還能夠形成異源二聚體,破壞TIR結構域的寡聚會中斷全長免疫受體蛋白激活后的下游信號轉導[20-21,23-24]。此外,TIR結構域還具有NAD+切割活性,這一活性對于免疫受體蛋白激活后誘導的細胞死亡是必需的。研究發(fā)現(xiàn),TIR結構域自我寡聚缺陷的突變體喪失了NAD酶活性以及誘導細胞死亡的能力,但是TIR結構域NAD酶活性中心突變體卻不影響其自身寡聚[25,28]。TIR的自我寡聚化會促進TIR的NAD酶活性,進一步促進下游免疫信號的轉導[26]。RPS4的TIR結構域能夠直接誘導細胞死亡,而 RRS1的TIR單獨不能直接引發(fā)細胞死亡,反而抑制RPS4 TIR結構域誘導的細胞死亡。RRS1 TIR結構域在誘導細胞死亡方面的功能差異可能與其三維結構的獨特性有關,RRS1 TIR在4號螺旋區(qū)域(橙色區(qū)域)的短螺旋僅有1個(其他TIR有3個),且該螺旋方向與其他TIR的4號螺旋區(qū)域幾乎垂直。在RPP1抗病小體結構中,4號螺旋區(qū)域在NAD酶活性中心的形成中發(fā)揮重要作用,因此,RRS1 TIR自身雖然能夠形成同源二聚體,可能無法形成有效的NAD酶活性中心,所以不能直接引發(fā)細胞死亡。

表1 文章涉及的植物免疫受體結構Table 1 Structures of plant immune receptors covered in this review

與TIR結構域類似,植物NLR蛋白N端CC結構域也具有較為保守的三維結構特征,除大麥MLA10 CC是由2個螺旋-環(huán)-螺旋結構組成的二體以外,Rx、Sr33以及失活態(tài)/中間態(tài)ZAR1的CC結構域均為具4螺旋束卷曲結構的單體形式[15-16,29-31](圖1-B)。Casey等[30]利用體積排阻色譜耦合多角度光散射技術發(fā)現(xiàn)MLA10 CC在溶液中表現(xiàn)出單體的性質(zhì),并認為MLA10 CC特殊的二體形式可能是由于其特殊的結晶條件(高鹽和低pH值)導致的。NRG1.1是在TNL下游發(fā)揮作用的輔助NLR,其N端CC結構域與RPW8類似,因此其CC結構域也被歸為CCR。如圖1-B所示,NRG1.1 CC也呈現(xiàn)出與其他類型CC相似的三維結構特征。最新的研究表明,NRG1.1 CC的三維構象與真菌膜穿孔HeLo/HELL結構域和哺乳動物混合譜系激酶結構域樣蛋白(mixed-linage kinase domain-like,MLKL)N端的4螺旋束結構域類似,且具有相對保守的功能位點[41-42]。與擬南芥失活態(tài)ZAR1的CC結構域相比,激活態(tài)ZAR1 CC結構域的構象發(fā)生了明顯變化,其N末端第1個螺旋α1單獨暴露出來[15-16](圖1-B)。單獨的CC結構域也具有誘導細胞死亡的能力,但是目前的研究表明,CC結構域能否表現(xiàn)出誘導細胞死亡的特性似乎跟CC片段的截取長度有關,通過Pfam分析預測Sr33的CC結構域為6～134位氨基酸,但功能試驗卻顯示1～142位氨基酸是Sr33 CC誘導細胞死亡表型所必需的[43-44]。圖1-B中解析的Sr33 CC結構域覆蓋了6～120位氨基酸,結合CC的功能研究和ZAR1 CC激活態(tài)的三維結構構象,推測目前解析的Sr33、Rx以及NRG1.1 CC的三維結構可能都處于失活狀態(tài)時的構象。

圖1 植物NLR免疫受體TIR(A)和CC(B)結構域的三維結構特征Fig.1 Structural features of TIR(A)and CC(B)domain of plant NLR immune receptor

1.2 NB-ARC結構域

NB-ARC結構域屬于信號傳導腺苷三磷酸ATP酶(signal transduction ATPases with numerous domains,STAND)超家族成員,具有結合和水解核苷酸的功能,通常被認為具有“分子開關”的作用[45]。NLR免疫受體的激活與否往往伴隨著NB-ARC結構域結合ADP或者ATP狀態(tài)的切換[46-50]。目前,關于NB-ARC結構域三維結構的報道并不多,單獨表達NB-ARC結構域并獲得結構信息的只有NRC1的NB-ARC結構域[40],在最近報道的多個植物抗病小體中揭示了更多關于NB-ARC結構域的三維結構信息[15-16,26-27]。NRC1是一個在番茄抗病蛋白Cf-4下游發(fā)揮作用的輔助CNL,NRC1 NB-ARC與失活態(tài)ZAR1 NB-ARC的三維結構特征相似,ADP結合在由NB、ARC1和ARC2共同形成的空腔位置(圖2),推測NRC1 NB-ARC結構域可能處于失活態(tài)的構象。與失活態(tài)ZAR1 NB-ARC相比,中間態(tài)ZAR1 NB-ARC的空間構象發(fā)生了明顯變化,NB結構域向外旋轉約60°,這種開放的空間構象可能有利于ADP的釋放以及ATP的進入(圖2)。在激活態(tài)ZAR1 NB-ARC中,ARC2結構域較失活態(tài)和中間態(tài)時有較大的旋轉幅度,此時處于結合ATP的狀態(tài)。激活態(tài)RPP1和ROQ1 NB-ARC的三維結構特征均與激活態(tài)ZAR1相似,唯一不同的是RPP1激活態(tài)時的NB-ARC結合的是ADP,而不是ATP。

圖2 植物NLR免疫受體NB-ARC結構域的三維結構特征Fig.2 Structural features of NB-ARC domain of plant NLR immune receptor

1.3 非典型結構域

除了具有非常保守的典型結構域,有些NLR免疫受體蛋白上還包含額外的非典型結構域。這些非典型結構域整合在受體蛋白N末端、C末端或者嵌入到典型結構域之間的位置,在植物免疫過程發(fā)揮重要作用[51]。多項研究表明,非典型結構域主要功能之一是參與免疫受體對病原生物效應蛋白的識別過程[52-53]。目前有三維結構信息報道的非典型結構域有重金屬結合結構域[32-35,38-39,54](heavy metal-associated domain,HMA)、WRKY結構域(WRKY protein domain)[36-37],以及茄科抗病基因特有SD(Solanaceaedomain)結構域[55],其中以HMA結構域的結構生物學研究最為深入。HMA結構域又被稱作RATX1結構域(related to yeast copper transporter ATX1,RATX1),水稻NLR免疫受體RGA5、Pik系列等位基因中均含有HMA結構域。RGA5中的HMA融合在其C末端[56],Pik中的HMA則嵌合在其CC和NB-ARC典型結構域之間[32]。目前認為HMA結構域作為一個整合型誘餌蛋白發(fā)揮監(jiān)測識別稻瘟病菌效應蛋白的作用,可能是由于水稻中存在一個含有HMA結構域的隱性抗病基因Pi21,Pi21功能缺陷的水稻更有利于稻瘟病菌的侵染[5,12]。RGA5能夠識別稻瘟病菌效應蛋白AVR-Pia和AVR1-CO39,激活RGA4介導的免疫反應;Pik能夠識別稻瘟病菌效應蛋白AVR-PikA、AVR-PikD以及AVR-PikE,目前還沒有Pik類免疫受體能夠識別AVR-PikC[35]。

Pik多個HMA結構域及其與稻瘟病菌效應蛋白復合物的晶體結構展示了各自的結構特征以及互作界面,所有HMA結構域的三維結構表征為由4股反平行β片和2股α螺旋組成的α/β三明治,AVR-Pik、AVR-Pia以及AVR1-CO39等效應蛋白都包含一個由6股β片構成的三明治保守結構,破壞HMA和效應蛋白的互作均會干擾全長免疫受體蛋白對病原生物正常的識別過程,阻斷免疫反應的激活。HMA跟不同效應蛋白的互作界面存在差異,如AVR1-CO39和AVR-PikD與HMA互作的界面處于HMA上2個完全相反的側面[38]。最近的研究發(fā)現(xiàn),Pikp在一定程度上也能識別“錯配的”AVR-Pia(AVR-Pia原本被RGA5識別),并在本氏煙草上誘導微弱的細胞壞死反應。對比Pikp HMA/AVR-PikD和Pikp HMA/AVR-Pia復合物的晶體結構,發(fā)現(xiàn)AVR-PikD和AVR-Pia也結合在HMA不同的空間位置[35]。這些關于HMA結構域及其與效應蛋白復合物的結構生物學研究,揭示了結構相似的HMA結構域如何特異性識別序列差異明顯但結構相似的稻瘟病菌效應蛋白的結構基礎。此外,多項結構數(shù)據(jù)表明,在缺乏病原生物效應蛋白的情況下,HMA結構域以二體形式存在[32,38]。有些效應蛋白如AVR1-CO39存在時,HMA無法形成二體[38]。分析結構發(fā)現(xiàn),AVR1-CO39與HMA的互作界面和HMA二體形成界面存在明顯重疊,這一競爭關系可能是干擾HMA二體形成的原因。但是這一現(xiàn)象的生物學意義尚不清楚,仍需進一步研究。

2 植物“抗病小體”的發(fā)現(xiàn)

2.1 ZAR1抗病小體

NLR免疫受體完整蛋白的三維結構解析一直是免疫學領域的重點和難點課題。2013年,清華大學柴繼杰教授研究團隊報道了第一個近乎全長的小鼠NLR免疫受體蛋白——NLRC4自抑制狀態(tài)的晶體結構,揭示了NLRC4蛋白通過各個結構域分子間相互作用維持自抑制狀態(tài)的分子機制[57]。隨后,柴繼杰教授課題組和隋森芳院士課題組進一步合作解析了NAIP-NLRC4復合物炎癥小體的冷凍電鏡結構,揭示了NLR免疫受體NAIP識別病原生物效應蛋白后如何激活處于自抑制狀態(tài)的NLRC4,以及NLRC4進一步發(fā)生自身多聚化形成包含1個NAIP和10個NLRC4盤狀結構的過程[58]。植物NLR免疫受體激活是否也形成類似動物NLR炎癥小體的結構?2019年,清華大學柴繼杰教授課題組、王宏偉教授課題組聯(lián)合中科院遺傳與發(fā)育生物學研究所周儉民研究員課題組,率先解析了第一個植物完整NLR免疫受體ZAR1激活前、后的結構,填補了植物NLR免疫受體全長蛋白結構的空白[15-16,59-60]。

如圖3所示,ZAR1與受體樣胞質(zhì)激酶(receptor-like cytoplasmic kinase,RLCK)家族成員RKS1形成復合物,并結合ADP,以單體的形式處于失活態(tài);當病原細菌效應蛋白對PBL2激酶進行尿苷酸修飾形成PBL2UMP后,PBL2UMP上的UMP基團會與ZAR1-RKS1復合體中的RKS1發(fā)生相互作用,并導致ZAR1 的NB結構域向外發(fā)生約60°的旋轉。ZAR1-RKS1-PBL2UMP中間態(tài)有利于ADP的釋放以及后續(xù)dATP/ATP的結合;當ZAR1-RKS1-PBL2UMP復合物中加入dATP/ATP后,ZAR1-RKS1-PBL2UMP復合物發(fā)生顯著的構象變化,由中間態(tài)轉換為激活態(tài):CC結構域第1個螺旋α1單獨暴露出來,NB、ARC1、ARC2以及LRR結構域都向有利于發(fā)生寡聚化的構象發(fā)生變化。完全激活的ZAR1通過各個結構域之間的相互作用,最終形成輪狀結構的ZAR1五聚體,并結合dATP/ATP。RKS1和PBL2UMP并不直接參與ZAR1五聚體的形成。激活態(tài)ZAR1五聚輪狀結構雖然與NLRC4炎癥小體有較大差異,但是仍具有激活后形成寡聚化復合體的共同特征,被命名為“抗病小體(resistosome)”。5個ZAR1單體CC結構域的第1個螺旋α1組成了一個突出的漏斗狀結構。生化與功能試驗數(shù)據(jù)表明,這一結構與抗病小體是否定位于質(zhì)膜以及是否誘導細胞死亡密切相關,暗示ZAR1抗病小體可能在質(zhì)膜上穿孔并形成離子通道。2021年,周儉民研究員及其合作者發(fā)現(xiàn)ZAR1抗病小體在體外試驗中能夠直接插入脂膜,發(fā)揮Ca2+離子通道作用,并通過單分子成像技術證實ZAR1在質(zhì)膜上組裝成五聚體復合物[61]。Jacob等[41]也發(fā)現(xiàn)另一類位于TNL免疫受體下游的植物免疫受體——輔助NLR蛋白NRG1和ADR1,可以作為一個鈣離子通透性的陽離子通道發(fā)揮作用。

圖3 植物ZAR1抗病小體的形成Fig.3 The formation of ZAR1 resistosome

2.2 RPP1 和ROQ1抗病小體

作為植物NLR免疫受體蛋白的另一大類型,TNL免疫受體N端TIR結構域具有NAD+水解酶活性(NADase),TNL全長蛋白激活后是否也形成類似CNL的抗病小體成為亟待回答的問題。2020年12月,Science雜志同期發(fā)表了2篇報道植物TNL識別病原生物效應蛋白后形成抗病小體的研究論文:柴繼杰教授團隊成功解析了RPP1結合卵菌效應蛋白ATR1后形成四聚體激活狀態(tài)的三維冷凍電鏡結構(圖4-A),并與德國馬克斯-普朗克植物育種研究所的2位合作者一起利用生物化學和遺傳學手段,揭示了RPP1抗病小體具有NAD酶全酶活性及其進一步激活下游免疫信號的分子機制[26];美國加州大學伯克利分校Brian J. Staskawicz教授和Eva Nogales教授團隊則解析了另外一種TNL類免疫受體ROQ1識別黃單胞細菌效應蛋白XopQ后形成四聚化抗病小體的冷凍電鏡結構[27](圖4-B)。RPP1和ROQ1 LRR結構域的C端都包含一個新的額外結構域,這一結構與專門結合抗原的免疫球蛋白結構類似,故被命名為C-JID結構域(C-terminal jell roll and Ig-like domain)。序列分析發(fā)現(xiàn),幾乎所有TNL免疫受體蛋白C末端都含有C-JID結構域,暗示其可能是一個具有廣譜功能的保守結構域。C-JID與LRR結構域共同介導了對病原生物效應蛋白的直接互作過程(圖4)。與ZAR1抗病小體由CC結構域形成一層突出的漏斗狀結構(圖3)不同,2個TNL抗病小體形成了3層環(huán)狀結構,分別是由TIR結構域組成的頂部環(huán)形結構,由 NB-ARC結構域組成的中間環(huán)形結構,以及由LRR-C-JID及病原生物效應蛋白組成的底部環(huán)形結構。

圖4 植物RPP1(A)和ROQ1(B)抗病小體的結構特征Fig.4 Structural characteristics of RPP1(A)and ROQ1(B)resistosome

在RPP1抗病小體中(圖4-A),2個TIR結構域通過頭尾互作形成二聚體,2個TIR二聚體進一步通過C2對稱形成四聚體。2個ATP分子結合在2個TIR二聚體的頭尾互作界面,該結合位置與TIR NAD酶水解底物NADP+的結合位點重疊。TIR二聚體的形成穩(wěn)定了兩者頭尾互作界面處其中一個TIR的BB環(huán)構象,該環(huán)上的一些關鍵氨基酸對于維持RPP1 的NAD酶活性非常重要。此外,單獨的RPP1蛋白幾乎沒有NAD酶活性,只有RPP1和ATR1形成的四聚抗病小體才表現(xiàn)出依賴于金屬離子的NAD酶活性[26]。這些發(fā)現(xiàn)表明,RPP1識別ATR1激活后形成了四聚化的抗病小體,其中2個頭對尾的二聚體TIR形成了完整的NAD酶活性中心,促使RPP1抗病小體作為一個NAD酶全酶催化NAD+水解。ROQ1具有與RPP1抗病小體類似的結構特征(圖4-B),較為明顯的區(qū)別在于兩者NB-ARC結構域結合ADP/ATP的狀態(tài):ROQ1激活態(tài)結合著ATP,而RPP1激活態(tài)結合著ADP。分析蛋白序列與結構發(fā)現(xiàn),ROQ1和ZAR1都具有結合ATP分子的保守“TTR”基序,而RPP1上該基序突變?yōu)椤癟TE”,導致其喪失結合ATP的活性。目前學術界普遍認為NLR激活態(tài)時結合ATP分子,尚不清楚這一特殊現(xiàn)象的生物學意義。

3 基于蛋白質(zhì)三維結構的植物NLR免疫受體設計與改造

相對于病原生物的龐大數(shù)目,植物中NLR蛋白的數(shù)量非常有限[12]。近年來,科學家們開始嘗試對NLR免疫受體進行人工設計以擴大或改良其識別病原物特異性,并取得了顯著成效。主要策略是通過在免疫受體上隨機引入氨基酸突變位點,進而直接對免疫受體進行分子設計以增強或者擴寬其識別病原生物的特異性。運用這一策略已獲得較多成功的示例,如在馬鈴薯免疫受體Rx的LRR功能域進行突變不僅可以增強其識別病原物特異性,同時在其NB功能域進行突變可以增強其激活敏感性[62-63];番茄免疫受體蛋白Sw-5b經(jīng)過人工隨機突變篩選,獲得了對番茄斑萎病毒野生型及其田間抗性突破變異株系的抗病性[64]。由于隨機突變產(chǎn)生的突變體數(shù)量龐大,前期篩選以及功能鑒定任務較為繁重。植物NLR免疫受體識別病原生物效應蛋白分子的新理論機制,為優(yōu)質(zhì)抗病資源的分子設計和改造提供了新的思路和方向。目前一種新的有益嘗試是對植物體內(nèi)的誘餌蛋白進行人工改造,使NLR能夠識別其他病原生物的效應蛋白,丁香假單胞菌效應蛋白AvrPphB具有蛋白酶活性,能夠切割擬南芥中被免疫受體RPS5監(jiān)測的誘餌蛋白PBS1,RPS5一旦感知到PBS1被切割,就會啟動植物的先天免疫系統(tǒng)來抵抗病原物侵染。研究人員將PBS1蛋白的切割位點替換成能夠被蕪菁花葉病毒NIa蛋白酶切割的識別位點,成功賦予了RPS5對植物病毒的新抗性[65]。

植物NLR免疫受體與病原生物效應蛋白復合物高分辨率三維結構的解析為科研人員開展NLR的精準設計和改造提供了可能。水稻Pikm能夠識別稻瘟病菌效應蛋白AVR-PikA、AVR-PikD和AVR-PikE,但是Pikp只能識別AVR-PikD,而不能識別AVR-PikA和AVR-PikE。英國結構生物學家Mark J. Banfield教授的研究小組解析了多個Pik HMA結構域與AVR-Pik的復合物晶體結構,包括Pikp HMA&AVR-PikD、Pikp HMA&AVR-PikE、Pikm HMA&AVR-PikA、Pikm HMA&AVR-PikD、Pikm HMA&AVR-PikE[32-35]。系統(tǒng)比較分析這些復合物結構中HMA和效應蛋白互作界面的關鍵氨基酸殘基,研究人員將Pikp HMA第261位天門冬酰胺(N)和第262位賴氨酸(K)分別突變成賴氨酸(K)和谷氨酸(E),產(chǎn)生了PikpNK-KE突變體。PikpNK-KE不僅保留了對AVR-PikD的識別能力,同時也能識別AVR-PikA和AVR-PikE并觸發(fā)細胞死亡反應[34]。采用類似的設計思路,研究人員通過對關鍵氨基酸的精準突變,相繼獲得了多個水稻RGA5HMA突變體,不僅能夠識別AVR-Pia和AVR1-CO39,也能夠識別AVR-PikD、AVR-Pib等新的稻瘟病菌效應蛋白[39,54]。由此說明,基于蛋白質(zhì)三維結構對直接整合到免疫受體上的誘餌蛋白結構域進行人工分子設計可能具有廣泛的應用前景。

4 展望

近年來,“植物NLR免疫受體及其介導的抗病機制”已成為農(nóng)業(yè)科學和植物學領域的前沿熱點。植物抗病小體的發(fā)現(xiàn)是植物免疫研究領域25年來里程碑式的進展,引領了領域的發(fā)展方向。全長NLR蛋白的結構解析雖然已取得突破,但是其他NLR蛋白的完整結構解析仍然存在挑戰(zhàn)。柴繼杰教授課題組花費了將近10年的時間才從數(shù)量眾多的植物NLR蛋白中篩選到了理想的研究對象——ZAR1,全長NLR蛋白的大量表達和純化并非易事。直接利用植物細胞瞬時表達具生物學功能的NLR全長蛋白及其與病原生物效應蛋白復合物可能是一種可行的策略。

目前,植物NLR蛋白經(jīng)典保守結構域的三維結構特征基本明確,但是非典型結構域的結構解析數(shù)量仍然有限。相對于經(jīng)典結構域而言,結構生物學家未來可能會更多關注非典型結構域及其與病原生物效應蛋白復合物的結構解析,兩者互作界面的直觀展示可以為免疫受體的精準改造和人工設計提供豐富的結構信息。除了目前已知的識別功能,非典型結構域是否還具有其他功能?三維結構的解析可為進一步揭示非典型結構域的新功能與新特性提供有價值的線索。

此外,當前關于植物NLR抗病小體的結構生物學研究仍然存在的不少問題值得進一步研究。部分NLR用于直接監(jiān)測病原生物效應蛋白,被稱為sNLR(sensor NLR),需要下游輔助hNLR(helper NLR)才能激活ETI。這類通過sNLR-hNLR工作模式的NLR是否會形成類似NAIP-NLRC4炎癥小體的sNLR-hNLR復合物抗病小體?對于TNL來說,下游還依賴于EDS1/PAD4和EDS1/SAG101發(fā)揮作用,sNLR-EDS1-hNLR三者是否形成復合物?RGA5/RGA4這類成對發(fā)揮功能的NLR激活時是否形成抗病小體?結構生物學將是未來回答這些問題最重要的手段之一。