朱盼盼，孫海新，李兆新，邢麗紅，孫曉杰，鄭旭穎，張夢婷，王繼耀，周朝生，孫德祥

(1.青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島266100；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室，山東青島 266071；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室，山東青島 266237；4.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江溫州 325005；5.浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點實驗室和溫州市海洋生物遺傳育種重點實驗室，浙江溫州 325005；6.安徽省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，合肥 230601)

呋喃西林屬于硝基呋喃類藥物，因抗菌譜廣，耐藥性好，曾經(jīng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用。研究發(fā)現(xiàn)氨基脲主要以蛋白結(jié)合態(tài)形式長期穩(wěn)定存在，并通過食物鏈傳遞給消費(fèi)者。結(jié)合態(tài)氨基脲在酸性條件下解離被人體吸收，進(jìn)而危害健康。氨基脲對人體具有致誘變性和潛在的致癌性。游離態(tài)氨基脲存在周期短，對人體產(chǎn)生的危害低。1995年歐盟規(guī)定在動物源食品中不得檢出呋喃類殘留物，2003年歐盟規(guī)定氨基脲最大殘留限量值為1 μg/kg，對于蝦類規(guī)定在使用呋喃西林時，可食性組織中氨基脲最大殘留限量為0.5 μg/kg。1993年美國禁止在動物源食品中使用呋喃唑酮藥物，2004年美國食品和藥品管理局(FDA)公布了進(jìn)口動物源性食品中包括呋喃西林和呋喃唑酮等禁用藥物名單。日本在2006年起規(guī)定禁止使用呋喃西林，氨基脲在蝦肌肉中檢測限為0.5 μg/kg。中國2002年頒布禁止使用呋喃西林，2005年將呋喃西林藥物列入廢止獸藥目錄。2019年我國規(guī)定蝦肌肉中氨基脲最大殘留限量為1 μg/kg。

研究表明在蝦類水產(chǎn)品中氨基脲含量較高，尤以日本沼蝦()和羅氏沼蝦()最為突出。根據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖過程中并未使用呋喃西林藥物，因此探明蝦類水產(chǎn)品中氨基脲本底含量問題對正確認(rèn)識蝦的食用安全性十分必要，對蝦類養(yǎng)殖業(yè)意義重大。已有研究證明氨基脲來源廣泛，除了使用呋喃西林藥物代謝產(chǎn)生外，在食品加工過程中會產(chǎn)生氨基脲。使用偶氮二甲酰胺或者次氯酸均會產(chǎn)生氨基脲。蝦類生物攝食的天然食物在體內(nèi)可能轉(zhuǎn)化為氨基脲，溫度也是導(dǎo)致氨基脲產(chǎn)生的一個因素。氨基脲作為內(nèi)源性物質(zhì)普遍存在于蝦類水產(chǎn)品中。

研究表明氨基脲在蝦組織中存在結(jié)合態(tài)和游離態(tài)2種形態(tài)。研究表明，新鮮北海地區(qū)蝦的甲殼組織中存在結(jié)合態(tài)的氨基脲，羅氏沼蝦甲殼組織中結(jié)合態(tài)氨基脲占總氨基脲比例大于65%，日本沼蝦甲殼中結(jié)合態(tài)氨基脲占總氨基脲比例為84.37%。在凡納濱對蝦肌肉組織中游離態(tài)氨基脲所占比例為95%，羅氏沼蝦肌肉組織中游離態(tài)氨基脲占比為100%，日本沼蝦肌肉組織中游離態(tài)氨基脲占總氨基脲比例為51.7%～69.11%。在日本沼蝦的足、肝胰腺團(tuán)、眼柄和鰓中游離態(tài)氨基脲占總氨基脲比例分別為20.99%、94.90%、54.70%、19.87%。蝦類品種繁多，不同品種、不同地域、不同養(yǎng)殖條件下蝦中氨基脲的存在形態(tài)和分布特征尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究詳細(xì)探討了氨基脲在蝦中的組織分布、存在形態(tài)、海水和淡水品種差異，以及湖泊和池塘生長環(huán)境的差異，為正確認(rèn)識蝦中氨基脲殘留提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

人工養(yǎng)殖蝦樣品分別采自安徽省和青島市的人工養(yǎng)殖池塘；野生蝦樣品分別采集于安徽省內(nèi)的天然湖泊和青島沿海海域。每個地點采集3個蝦樣本(=3)，每個樣本按蝦的大小體重不同采集不同的數(shù)量，日本沼蝦()、羅氏沼蝦()、克氏原螯蝦()、秀麗白蝦()、凡納濱對蝦()、脊尾白蝦()、日本對蝦()每150尾為一個樣本。中國對蝦()、鷹爪蝦()、口蝦蛄()每30尾為1個樣本。采集的日本沼蝦迅速放入液氮罐，并運(yùn)到實驗室。所有樣品均未使用藥物。樣品信息見表1。

表1 蝦樣品品種、樣品量及來源(n=3)Tab.1 Variety,sample quantity and source of shrimp

1.2 化學(xué)試劑

氨基脲鹽酸鹽(德國Dr.Ehrenstorfer公司)，內(nèi)標(biāo)物C,N-SEM(上海泰坦科技股份有限公司)；鹽酸和磷酸氫二鉀(優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、醋酸銨(色譜純，北京伊諾凱科技有限公司)、2-硝基苯甲醛(色譜純，生工生物工程股份有限公司)、甲酸(色譜純，青島海沃森生物科技有限公司)；甲醇(色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、乙酸乙酯(色譜純，青島騰岳海邦化工有限公司)。

1.3 設(shè)備

QTRAP?5500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配ESI離子源，美國AB SCIEX公司)；分析天平(感量0.01 g，德國賽多利斯集團(tuán))；Vortex 2渦旋混合器(德國IKA公司)；IS-RDS3恒溫振蕩器(美國精騏有限公司)；Himac GR22G高速離心機(jī)(日本日立公司)；N-EVAP 112氮氣吹干儀(美國Organomation 公司)；微量高速離心機(jī)(德國Sigma公司)；Gradient A10 Mill-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.4.1 氨基脲標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確稱取14.9 mg氨基脲鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，-18 ℃冷藏保存。使用時用甲醇逐級稀釋，配制成1 μg/mL、100 ng/mL和10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.2 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確稱取適量內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品C,N-SEM，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，配制成1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。使用時用甲醇逐級稀釋，配制成100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.5 樣品前處理方法

1.5.1 樣品制備

取蝦類樣品的甲殼、肌肉、鰓、肝胰腺、頭胸部、眼柄組織，用均質(zhì)機(jī)混勻，每個樣本組織大于20 g，-80 ℃保存。

1.5.2 氨基脲總量的測定

樣品組織中殘留的硝基呋喃代謝物直接經(jīng)酸解、衍生化后，LC-MS/MS測試蝦中氨基脲總量。

(1)水解和衍生化

準(zhǔn)確稱取1 g樣品于50 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液100 μL，渦旋混合1 min，再加入0.5 mol/L鹽酸溶液5 mL和0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛150 μL，渦旋混合震蕩90 s，置于恒溫振蕩器中37 ℃避光振蕩16 h。

(2)提取和凈化

取出離心管冷卻至室溫，加入1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液5 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，加入8 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩90 s，4 000 r/min離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至10 mL試管中于40 ℃下氮氣吹干。準(zhǔn)確加入5%甲醇水溶液渦旋振蕩溶解殘留物，過0.22 μm濾膜，待測。

1.5.3 結(jié)合態(tài)氨基脲含量的測定

采用甲醇以及不同濃度的甲醇水溶液洗滌樣品去除樣品中游離態(tài)氨基脲。分別稱取適量均質(zhì)后的蝦組織樣品(甲殼、肌肉、鰓、眼柄、肝胰腺、頭胸部)于50 mL離心管中，分別加入5 mL 50%甲醇/水溶液，渦旋混合50 s，超聲提取5 min，4 000 r/min離心10 min，棄去上清液。再依次加入5 mL75%甲醇/水溶液重復(fù)上述操作。洗滌后的樣品采用1.5.2的方法進(jìn)行處理，經(jīng)LC-MS/MS測試，測得結(jié)合態(tài)氨基脲含量。

1.5.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作

分別準(zhǔn)確移取10 ng/mL氨基脲標(biāo)準(zhǔn)工作溶液50、100、200μL，100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液50、100、200 μL和1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液50 μL于7個50 mL離心管中。除不加樣品外，按照1.5.2的測定操作，進(jìn)LC-MS/MS分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.5 色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Waters Xbridge C柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流動相A為0.002 mol/L醋酸銨溶液，流動相B為100%甲醇溶液，流動相梯度洗脫條件：0～0.5 min，90% A；0.5～4.0 min，90%～5% A；4.0～5.5 min，5% A；5.5～6.0 min，5%～90% A；6.0～7.0 min，90% A ；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源為ESI源，正離子掃描；離子源溫度為550 ℃，去溶劑溫度為380 ℃，噴霧電壓5 500 V，碰撞氣壓力：中等；氣簾氣：206.85 kPa；霧化氣：241.33 kPa；去簇電壓：80 V；輔助加熱氣：241.33 kPa；錐形氣流：344.75 kPa。數(shù)據(jù)采集采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。所監(jiān)測的目標(biāo)離子分別為氨基脲209.0>166.0(碰撞能量11 eV)和C,N-氨基脲212.0>168.0(碰撞能量13 eV)。數(shù)據(jù)處理采用MultiQuant軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法適用性評價

2.1.1 方法的準(zhǔn)確度和精密度

實驗對方法的適用性進(jìn)行了驗證，氨基脲平均回收率為74.3%～113.5%，精密度小于6.3%。

2.1.2 方法的線性范圍與檢測限

按1.4的方法配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測后，以濃度為橫坐標(biāo)，氨基脲峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，氨基脲在0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為=-0001 075-0033 7，=0.999。

2.2 蝦類產(chǎn)品中氨基脲總量、結(jié)合態(tài)氨基脲含量及其所占比例

蝦類產(chǎn)品不同組織中氨基脲總量、結(jié)合態(tài)氨基脲含量及結(jié)合態(tài)氨基脲占氨基脲總量的比例見表2。

表2 蝦產(chǎn)品不同組織中氨基脲總量和結(jié)合態(tài)氨基脲含量Tab.2 The contents of total semicarbazide and bound semicarbazide in different tissues of shrimp products μg/kg

表2結(jié)果顯示，在淡水蝦(日本沼蝦、羅氏沼蝦、克氏原螯蝦和秀麗白蝦)和海水蝦(中國對蝦、凡納濱對蝦、口蝦蛄、鷹爪蝦、脊尾白蝦和日本對蝦)的甲殼、眼柄、鰓組織中均檢出氨基脲，氨基脲含量范圍分別為(1.05±0.11)～(855.39±10.55) μg/kg、ND～(106.3±21.47) μg/kg、ND～(32.15±4.14) μg/kg?？傮w而言，不同組織中氨基脲濃度從高到低依次為：甲殼>眼柄>鰓>肌肉>頭胸部>肝胰腺。

生長在湖泊和池塘淡水環(huán)境中的日本沼蝦、羅氏沼蝦、克氏原螯蝦和秀麗白蝦等的甲殼、眼柄和鰓中氨基脲范圍分別為(9.13±1.07)～(855.39±10.55) μg/kg、(12.61±2.09)～(106.3±21.47) μg/kg、(3.24±0.06)～(32.15±4.14) μg/kg，海水環(huán)境中的中國對蝦、凡納濱對蝦、口蝦蛄、鷹爪蝦、脊尾白蝦和日本對蝦等甲殼、眼柄和鰓中氨基脲范圍分別為(1.05±0.11)～(9.90±1.09) μg/kg、ND～(2.83±0.16) μg/kg、ND～(4.78±1.33) μg/kg。本研究發(fā)現(xiàn)，淡水蝦中甲殼、眼柄和鰓組織中氨基脲含量比海水蝦相應(yīng)組織中氨基脲含量高。

淡水蝦可食組織肌肉中濃度范圍為(1.88±0.90)～(16.94±0.14) μg/kg，均大于殘留限量1.0 μg/kg，其中肌肉組織中結(jié)合態(tài)氨基脲濃度范圍為ND～(4.89±0.15) μg/kg，結(jié)合態(tài)氨基脲占氨基脲總量的12.7～28.9%，而在海水蝦肌肉中普遍未檢出氨基脲(<0.1 μg/kg)。

結(jié)果表明，蝦甲殼組織和眼柄組織中氨基脲主要以結(jié)合態(tài)形式存在，其結(jié)合態(tài)氨基脲所占比例超過50%，而肌肉、鰓、肝胰腺、頭胸部組織中氨基脲主要以游離態(tài)形式存在，其結(jié)合態(tài)氨基脲所占比例均低于50%。

2.3 湖泊野生與池塘養(yǎng)殖的日本沼蝦氨基脲含量特征

2.3.1 養(yǎng)殖和野生日本沼蝦氨基脲總量對比分析

分別對養(yǎng)殖和野生日本沼蝦不同組織中氨基脲的含量進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果見圖1。

養(yǎng)殖池塘采集的日本沼蝦甲殼、眼柄、鰓、頭胸部、肝胰腺、肌肉組織氨基脲含量范圍分別為(521.61±10.43)～(855.39±10.55) μg/kg、(67.85±10.67)～(95.03±21.79) μg/kg、(11.45±2.27)～(32.15±4.14) μg/kg、(14.01±0.55)～(19.37±1.34) μg/kg、(7.66±0.79)～(15.56±3.13) μg/kg、(8.53±0.17)～(16.94±0.14) μg/kg，湖泊采集的日本沼蝦甲殼、眼柄、鰓、頭胸部、肝胰腺、肌肉組織氨基脲含量范圍分別為(312.97±21.28)～(404.08±12.43) μg/kg、(87.58±10.32)～(106.3±21.47) μg/kg、(7.60±0.89)～(18.77±1.14) μg/kg、(5.48±1.16)～(7.62±1.12) μg/kg、(11.19±1.13)～(14.32±3.15) μg/kg、(6.27±0.23)～(13.94±0.15) μg/kg。圖1結(jié)果顯示養(yǎng)殖池塘采集的日本沼蝦甲殼、鰓、頭胸部、肌肉組織氨基脲含量均高于湖泊采集的日本沼蝦氨基脲含量。

圖1 野生和養(yǎng)殖日本沼蝦甲殼、眼柄、鰓、頭胸部、肝胰腺、肌肉組織中氨基脲含量Fig.1 Content of total semicarbazide in shell,eyestalk,gill,cephalothorax,hepatopancreas and muscle of wild and cultured M.nipponense

2.3.2 日本沼蝦結(jié)合態(tài)氨基脲含量分析

分別對養(yǎng)殖和野生日本沼蝦不同組織中結(jié)合態(tài)氨基脲的含量進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果見圖2。

養(yǎng)殖池塘采集的日本沼蝦甲殼、眼柄、鰓、頭胸部、肝胰腺、肌肉組織結(jié)合態(tài)氨基脲含量范圍分別為(427.23±1.98)～(510.01±3.14) μg/kg、(53.75±4.13)～(81.02±11.89) μg/kg、ND～(1.01±0.02) μg/kg、ND～(3.58±0.14) μg/kg、未檢出～(1.37±0.09) μg/kg、(1.71±0.06)～(4.89±0.15) μg/kg，湖泊采集的日本沼蝦甲殼、眼柄、鰓、頭胸部、肝胰腺、肌肉組織結(jié)合態(tài)氨基脲含量范圍分別為(256.67±10.16)～(340.8±4.57) μg/kg、(76.38±7.56)～(93.79±11.10) μg/kg、(0.74±0.09)～(6.88±1.08) μg/kg、(0.67±0.04)～(2.14±0.06) μg/kg、(0.36±0.13)～(2.93±0.64) μg/kg、(1.38±0.12)～(3.64±0.93) μg/kg。圖2結(jié)果顯示，養(yǎng)殖日本沼蝦甲殼、頭胸部、肝胰腺、肌肉組織結(jié)合態(tài)氨基脲含量均高于野生日本沼蝦結(jié)合態(tài)氨基脲含量，在甲殼、眼柄組織中氨基脲主要是結(jié)合態(tài)形式存在，其它組織中氨基脲以游離態(tài)形式存在。

圖2 野生和養(yǎng)殖日本沼蝦甲殼、眼柄、鰓、頭胸部、肝胰腺、肌肉組織中結(jié)合態(tài)氨基脲含量Fig.2 Content of bound semicarbazide in shell,eyestalk,gill,cephalothorax,hepatopancreas and muscle tissue of wild and cultured M. nipponense

3 討論

本研究結(jié)果表明，在人工養(yǎng)殖環(huán)境和野生環(huán)境下蝦中氨基脲含量存在一定差異，但其組織分布呈現(xiàn)相似的規(guī)律，不同組織中氨基脲含量從高到低依次為：甲殼>眼柄>鰓>肌肉>頭胸部>肝胰腺。由于采樣時間、地點等因素的差異，不同品種蝦的不同組織氨基脲含量存在差異。另有研究表明，在蜂等昆蟲的殼中存在氨基脲，氨基脲是昆蟲殼組織的成分基團(tuán)。以上研究均表明，氨基脲作為內(nèi)源性物質(zhì)在不同品種蝦的甲殼組織中普遍存在，且含量最高。

氨基脲在蝦不同組織中的存在形態(tài)也各不相同。宋蓓等研究日本沼蝦不同組織中氨基脲存在形態(tài)，發(fā)現(xiàn)殼中氨基脲以結(jié)合態(tài)形式存在且所占比例大于50%，與本研究結(jié)果一致。甲殼、眼柄、鰓等蝦的角質(zhì)化組織中結(jié)合態(tài)氨基脲所占比例大于肌肉組織中結(jié)合態(tài)氨基脲的比例。由于甲殼類生物生長過程中具有脫殼行為，因此氨基脲在不同組織中的相關(guān)關(guān)系及轉(zhuǎn)化、平衡機(jī)制有待深入研究。

來源于不同生長環(huán)境的蝦組織中氨基脲含量存在差異。本研究通過對淡水蝦和海水蝦中氨基脲含量進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn)，氨基脲在中國對蝦、凡納濱對蝦、口蝦蛄、鷹爪蝦、脊尾白蝦和日本對蝦等海水蝦肌肉組織中小于0.1 μg/kg，在日本沼蝦、羅氏沼蝦、克氏原螯蝦和秀麗白蝦等淡水蝦的可食性肌肉中含量較高，在日本沼蝦、羅氏沼蝦肌肉組織中平均含量均大于1.0 μg/kg，表明氨基脲主要存在于淡水環(huán)境生長的蝦中。其它研究也表明在淡水中生長的蝦肌肉組織中存在氨基脲，如來源于不同地區(qū)的克氏原螯蝦肌肉組織中氨基脲含量分別為(0.52±0.03) μg/kg和4.2～12 μg/kg，說明不同生長環(huán)境下淡水蝦中氨基脲含量也存在一定差異。上述研究表明，日本沼蝦在不同環(huán)境條件下，其不同組織中氨基脲含量存在差異，這種差異可能與日本沼蝦的養(yǎng)殖環(huán)境或飼料的影響的有關(guān)。水體、底泥或飼料中含有的氨基脲或氨基脲基團(tuán)，亦或其它腐殖質(zhì)對蝦體內(nèi)氨基脲含量的影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。