姜孝芳 賈宏林 梁曉鷹 張 茹 高 麗 楊 清（新疆醫(yī)科大學中心實驗室，烏魯木齊 830000）

變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是由免疫球蛋白（IgE）介導、鼻黏膜嗜酸性粒細胞（eosinophils，EOS）浸潤和Th2細胞因子分泌增加的鼻黏膜Ⅰ型變應性炎癥性疾病，主要癥狀為鼻癢、鼻塞、流涕、打噴嚏，全球患病率逐年上升，影響了全球10%～40%成年人和2%～25%兒童，是世界范圍內常見的變應性疾病，嚴重影響人們生活質量［1-3］。新疆是多民族聚集地，地處西北，干燥少雨，冷熱變化懸殊，特殊的地理環(huán)境及氣候致使AR成為新疆地區(qū)的常見病和多發(fā)?。?］。本課題組在南、北疆及烏魯木齊調查發(fā)現，烏魯木齊漢族AR患病率（33.36%）高于維吾爾族（19.19%），喀什、伊犁地區(qū)漢族AR患病率（26.1%）高于維吾爾族（12.8%），新疆維、漢民族患病率存在明顯差異［5］。維吾爾族為新疆常住民族，推測可隨環(huán)境壓力改變的基因表觀遺傳學差異與維吾爾族AR患病率較低有關。Th1和Th2細胞間免疫應答失衡是AR的免疫學基礎。正常狀態(tài)下，Th1和Th2細胞均維持免疫穩(wěn)態(tài)，當AR發(fā)作時會出現Th1細胞應答抑制，Th2細胞應答亢進，即“Th2＞Th1免疫應答”。

microRNA（miRNA）是一種小的非編碼單鏈RNA分子，含20～25個核苷酸，在進化過程中高度保守，能夠靶向動植物中的RNA，阻止蛋白翻譯或降解mRNA，參與轉錄后基因表達調控［6-8］。miRNA與變應性疾病的關系密不可分，參與信號轉導、細胞增殖、分化及凋亡等過程［9］。本研究采用RT-PCR檢測AR患者miR-155、miR-326及IL-2、IL-4、IFN-γ mRNA表達，在動物及細胞水平研究甲基化干預對miR-155、miR-326及Th細胞因子的影響，探討其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，為新疆維吾爾族、漢族AR患者提供新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象選取2013年12月至2017年11月在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院和新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院確診為AR發(fā)作期的患者85例（鼻炎組），平均年齡（22.69±3.81）歲，其中維吾爾族32例，漢族53例，男39例，女46例，均在當地居住5年以上，并排除COPD、過敏性皮炎、高血壓、糖尿病、孕婦及60歲以上患者。納入標準：均符合2009年中華醫(yī)學會耳鼻咽喉頭頸外科學分會、鼻科學組武夷山會議變應性鼻炎診治原則和推薦方案［10］；對照組選擇同期在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院及新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院的健康體檢者、新疆醫(yī)科大學健康志愿者97例，平均年齡（21.08±3.88）歲，其中維吾爾族40例，漢族57例，男50例，女47例，既往無哮喘病史、過敏性疾病史及心血管疾病史，體檢均正常。本研究經新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（20170214-185），所有受試者知情同意。

1.1.2 實驗動物SPF級SD雄性大鼠，體質量180～220 g，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供，并在新疆醫(yī)科大學清潔屏障內飼養(yǎng)。隨機分為3組：正常組、模型組、5-Aza組，每組10只。

1.1.3 主要試劑與儀器Jurkat細胞株（人外周血白血病T細胞）購自中科院細胞庫；5-Aza（A2385）、淋巴細胞分離液10771（RNBF2219）購自美國Sigma公司；磁珠抗體（557787）購自BD公司；TRIzol裂解液購自Lifetechnologies公司；逆轉錄試劑盒miScriptⅡRT Kit（218161）、熒光定量試劑盒miScript SYBR Green PCR kit（1046470）購自凱杰公司；Hs-miR-155 miScript Primer Assay（MS00008778）、Hs-miR-326 miScript Primer Assay（MS00003948）、Rn-miR-326 miScript Primer Assay（MS00027342）購 自QIAGEN公司；胎牛血清購自BI公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；IFN-γ抗體（BM4939，1∶500稀釋）購自Affinity公司；GAPDH抗體（ab8245，1∶10 000稀釋）購自Abcam公司；熒光定量RT-PCR儀購自ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及CD4+T細胞分離無菌條件下取外周血4～5 ml，采用淋巴細胞分離液10771進行淋巴細胞分離，分離的淋巴細胞加入500μl RPMI 1640培養(yǎng)液，同時加入45μl磁珠抗體，混勻，分離CD4+T淋巴細胞，封口膜封存，-80℃液氮中凍存。

1.2.2 造模及干預采用經典卵清蛋白致敏法構建動物模型，模型組采用30 mg卵清蛋白作為抗原，氫氧化鋁粉末3 g作為佐劑，加入100 ml生理鹽水制備混懸液，腹腔注射（1 ml/只），隔天1次，共7次，為基礎致敏。基礎致敏次日采用5%卵清蛋白（生理鹽水溶解）攻擊雙側鼻腔，50μl/側，1次/d，共10次?？瞻讓φ战M采用等量生理鹽水代替卵清蛋白及氫氧化鋁腹腔注射和滴鼻攻擊，方法同上。給予5-Aza（5 mg/kg），連續(xù)7 d，每次給藥前30 min進行滴鼻，干預結束后禁食12 h，2%戊巴比妥麻醉，取鼻黏膜。

1.2.3 細胞培養(yǎng)正常培養(yǎng)Jurkat細胞，待細胞達到80%～90%融合時，收集細胞懸液，計數，接種至6孔板，細胞密度為5×105個/孔。待細胞生長至對數生長期時，給予5-Aza干預，繼續(xù)孵育24 h，分別收取RNA及蛋白。

1.2.4 RNA提取TRIzol法提取總RNA，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 miRNA逆轉錄及cDNA合成加入1μg總RNA模板，逆轉錄試劑與總RNA為10μl，嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書操作。

1.2.6 RT-qPCR檢測miR-326、miR-155、IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表達參照熒光定量試劑盒miScript SYBR Green PCR kit說明書，60℃退火，45個循環(huán)，采用熒光定量RT-PCR儀進行RT-qPCR實驗。引物序列：GAPDH正向引物5"-GACCTGACCTGCCGCTA-3"，反向 引 物5"-AGGAGGGGTGTCGCTGT-3"；IL-2正向引物5"-GCAACCCTGTCTTCATTG-3"，反向引物5"-TCTGGTGAGTTGGGATTC-3"；IL-4正向引物5"-AGCAGTCCACAGGCACAAG-3"，反向引物5"-CTGGGTGGCTTCCTTCACAG-3"；IFN-γ正向引物5"-AACTTAAAGATGACAGAGATCC-3"，反向引物5"-TCTGGTGAGTTGGGATTC-3"，以上引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。2-ΔΔCt計算相對表達。

1.2.7 Western blot檢測IFN-γ蛋白表達取蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，5 min/次，加入一抗4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，10 min/次，二抗室溫搖床封閉1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，顯影曝光，Image J軟件進行灰度定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數據以±s表示，采用獨立樣本t檢驗進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鼻炎組與正常組miR-155、miR-326、IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表達RT-qPCR結果顯示，與正常組相比，鼻炎組miR-155、miR-326表達升高（P＜0.05），分別是正常組的1.66、2.69倍；IFN-γ表達下降（P＜0.05），是正常組的0.59倍（表1）。

2.2 維吾爾族、漢族鼻炎組相關基因表達維吾爾 族 與 漢 族miR-155、miR-326、IL-2、IL-4、IFN-γ mRNA基因表達差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但維吾爾族患者Th2細胞因子IL-4表達低于漢族患者，是漢族患者的0.51倍（表2）。

2.3 維吾爾族、漢族正常組相關基因表達正常組維吾爾族miR-326表達是漢族的3.6倍，IL-4是漢族的0.53倍（P＜0.05，表3）。

2.4 鼻炎組miR-326與IFN-γ表達相關性分析Spearman相關性分析顯示，鼻炎患者miR-155、miR-326表 達 與IFN-γ表 達 呈 負 相 關（r=-0.205，r=-0.225，P=0.005，P=0.002）。

2.5 miRNA在動物模型鼻黏膜中的表達AR患者外周血CD4+T淋巴細胞miR-326、miR-155表達存在差異，與IFN-γ表達呈負相關，其中AR患者miR-326表達是正常組的2倍以上，且與IFN-γ表達呈負相關。為研究其在鼻黏膜中的表達及與甲基化的關系，本研究以甲基化酶抑制劑5-Aza干預AR大鼠模型，檢測大鼠鼻黏膜中miR-326、IFN-γ表達，發(fā)現模型組miR-326表達升高，干預后表達下降，但差異無統(tǒng)計學意義，模型組IFN-γ表達顯著下降，甲基化酶抑制劑干預后其表達顯著提高（表4）。

表1 鼻炎組和正常組miR-155、miR-326、IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表達（±s）Tab.1 mRNA expressions of miR-155，miR-326，IL-2，IL-4 and IFN-γin rhinitis group and normal group（±s）

表1 鼻炎組和正常組miR-155、miR-326、IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表達（±s）Tab.1 mRNA expressions of miR-155，miR-326，IL-2，IL-4 and IFN-γin rhinitis group and normal group（±s）

GroupsnmiR-155miR-326IL-2IL-4IFN-γ AR（△CT）856.68±1.285.93±1.079.53±3.3310.79±2.369.01±2.35 Norma（l△CT）977.41±1.987.36±2.319.43±3.8410.69±2.018.25±2.29 AR/Norma（l2-ΔΔCt）1.662.690.930.950.59 t 2.8985.249-0.179-0.288-2.195 P 0.0040.0000.8570.7740.029

表2 維吾爾、漢族鼻炎組miR-155、miR-326、IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表達（±s）Tab.2 mRNA expressions of miR-155，miR-326，IL-2，IL-4 and IFN-γin Uygur and Han rhinitis groups（±s）

表2 維吾爾、漢族鼻炎組miR-155、miR-326、IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表達（±s）Tab.2 mRNA expressions of miR-155，miR-326，IL-2，IL-4 and IFN-γin Uygur and Han rhinitis groups（±s）

GroupsnmiR-155miR-326IL-2IL-4IFN-γ Han（△CT）Uygur（△CT）Uygur/Han（2-ΔΔCt）t P 53 32 6.84±1.31 6.43±1.23 1.33 1.423 0.158 5.95±1.06 5.89±1.10 1.04 0.253 0.798 9.42±3.53 9.70±3.01 0.82-0.382 0.703 10.42±2.30 11.39±2.37 0.51-1.859 0.067 8.97±2.68 9.01±1.72 0.97-0.165 0.870

表3 維、漢民族正常組miR-155、miR-326、IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表達（±s）Tab.3 mRNA expressions of miR-155，miR-326，IL-2，IL-4 and IFN-γin normal group of Uggur and Han nationality（±s）

表3 維、漢民族正常組miR-155、miR-326、IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表達（±s）Tab.3 mRNA expressions of miR-155，miR-326，IL-2，IL-4 and IFN-γin normal group of Uggur and Han nationality（±s）

Groups Han（△CT）Uygur（△CT）Uygur/Han（2-ΔΔCt）t P n 56 41 miR-155 7.63±2.27 7.11±1.46 1.43 1.272 0.206 miR-326 8.14±2.55 6.29±1.36 3.60 4.230 0.000 IL-2 9.65±4.66 9.13±2.33 1.43 0.656 0.513 IL-4 10.31±1.98 11.22±1.96 0.53-2.262 0.026 IFN-γ 7.96±2.56 8.65±1.82 0.61-1.481 0.142

表4 5-Aza干預AR大鼠模型miR-326及IFN-γmRNA表達（±s）Tab.4 mRNA expressions of miR-326 and IFN-γin AR rat model after 5-Aza intervention（±s）

表4 5-Aza干預AR大鼠模型miR-326及IFN-γmRNA表達（±s）Tab.4 mRNA expressions of miR-326 and IFN-γin AR rat model after 5-Aza intervention（±s）

Note：1）P＜0.05 vs normal group.

Groups Normal AR 5-Aza intervention miR-326 1.04±0.42 1.28±0.91 1.06±0.65 IFN-γ 1.02±0.24 0.22±0.061）1.36±0.17

表5 5-Aza干預后Jurkat細胞miR-326、miR-155及IFN-γ mRNA、蛋白表達（±s）Tab.5 mRNA and protein expressions of miR-326，miR-155 and IFN-γin Jurkat cells after 5-Aza intervention（±s）

表5 5-Aza干預后Jurkat細胞miR-326、miR-155及IFN-γ mRNA、蛋白表達（±s）Tab.5 mRNA and protein expressions of miR-326，miR-155 and IFN-γin Jurkat cells after 5-Aza intervention（±s）

Note：1）P＜0.05，2）P＜0.01 vs normal group.

Groups Normal 5-Aza（0.25μm/ml）5-Aza（1μm/ml）miR-326 1.04±0.34 1.96±0.401）1.34±0.33 miR-155 1.05±0.40 4.30±2.012）2.22±0.82 IFN-γ mRNA 1.00±0.11 1.34±0.21 1.55±0.321）IFN-γ protein 1.09±0.16 0.45±0.042）0.89±0.09

2.6 Jurkat細 胞miR-326表 達 為探討miR-326差異表達及甲基化干預在鼻黏膜和T細胞中的作用，本研究以甲基化酶抑制劑5-Aza干預外周血Jurkat細胞，檢測miR-326及IFN-γ表達，發(fā)現甲基化酶抑制劑干預后miR-326表達呈上升趨勢，隨著甲基化酶抑制劑干預濃度上升而下降；IFN-γmRNA表達略有上升，但其蛋白表達下降，這種下降趨勢隨著甲基化酶抑制劑干預濃度上升有所減弱，說明甲基化酶抑制劑干預可上調miR-326及IFN-γmRNA表達，下調IFN-γ蛋白表達。5-Aza（0.25μm/ml）干預組中，miR-326表達上調時，IFN-γ蛋白表達明顯下降，5-Aza（1μm/ml）組，miR-326表達下降時，IFN-γ蛋白表達上升，與課題組在鼻炎患者中發(fā)現miR-326表達與IFN-γ呈負相關結論一致。5-Aza干預后，Jurkat細胞IFN-γmRNA表達略有上升與其蛋白表達下降結論相反，提示5-Aza干預后存在轉錄后修飾（表5、圖1）。

圖1 5-Aza干預后Jurkat細胞miR-326、miR-155及IFN-γ mRNA、蛋白表達Fig.1 Expressions of miR-326，miR-155，IFN-γmRNA and protein in Jurkat cells interfered by 5-Aza

3 討論

AR是特定個體接觸抗原后，在多種炎癥因子趨化作用下，以Th2型免疫應答為基礎的變應性炎癥性疾病，是目前世界上常見的非傳染性慢性上呼吸道疾病之一［11］。T細胞在免疫應答中具有重要作用，按照CD分子表達不同可分為CD3+、CD4+、CD8+T細胞。CD4+T細胞也稱T輔助細胞（T helper cell，Th），可協調免疫應答并參與細胞活化信號傳遞。根據Th0分泌的細胞因子不同，Th細胞可分為Th1、Th2、Th17及調節(jié)性T細胞（Treg）4個亞群。Th1參與細胞免疫，主要分泌IL-2、IL-12及IFN-γ等細胞因子，抑制Th2類細胞特征因子產生；Th2參與體液免疫，主要分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-13等細胞因子，IL-4是特異性細胞因子，誘導IgE生成及嗜酸性細胞、肥大細胞成熟。正常情況下，Th1/Th2類細胞因子互相依存和制約，保持動態(tài)平衡，當機體受到外來異?？乖碳r，上述平衡被打破，Th1、Th2細胞中Th2亞群功能升高，Th1亞群功能降低，引起異常免疫應答。本研究中鼻炎組Th1細胞因子IFN-γ mRNA表達低于對照組（P＜0.05），但Il-2及IL-4表達差異無統(tǒng)計學意義，說明在本研究病例中Th1/Th2細胞平衡失調主要表現為Th1亞群功能降低。鼻炎組及正常組維吾爾族IL-4 mRNA表達是漢族的0.51和0.53倍（P＜0.05），其余各基因表達差異均無統(tǒng)計學意義，提示IL-4在維吾爾族正常人群低表達可能是其AR患病率低的因素之一。

研究表明，差異表達的miRNA及其靶基因功能包括參與氧化應激反應、釋放炎癥遞質、免疫細胞功能和反應調控等［12］。miRNA在AR中表現出特定特征，具有重要調控作用［13］。miR-155目前研究較多，在適應性免疫細胞（包括效應T細胞亞群）發(fā)育和激活中發(fā)揮作用，參與造血細胞分化、免疫、血管重塑以及炎癥信號通路等調控，被認為參與AR發(fā)?。?1，14］。鼻炎組miR-155表 達高于對照組（P＜0.05），與艾宏輝等［15］在鼻炎中的研究結論一致，miR-155影響CD4+T細胞向Th1/Th2細胞分化的平衡，miR-155缺乏將引起Th1細胞分化受阻，Th2細胞誘導增加［16］。本研究也發(fā)現AR組miR-155呈高表達，IFN-γ呈低表達，且二者呈負相關。

miR-326差異表達在AR中的研究較少，但與腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病密切相關［17-18］。鼻炎組外周血CD4+T細胞miR-326表達是對照組的2.69倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與IFN-γmRNA表達呈負相關（P＜0.05）。正常組中維吾爾族miR-326水平是漢族的3.5倍（P＜0.05），提示miR-326在AR發(fā)病機制中可能起重要調控作用。自身免疫性疾病研究發(fā)現，miR-326表達與Treg/Th17有關，可促進Th17細胞分化，導致炎癥發(fā)生［19-20］。鼻炎組CD4+T細胞miR-326高表達，在正常組維吾爾族表達高于漢族，且與IFN-γ呈負相關。為進一步研究這種表達差異與甲基化的關系，本研究以甲基化酶抑制劑5-Aza干預AR模型大鼠，檢測大鼠鼻黏膜miR-326、INF-γ表達，發(fā)現模型組miR-326表達上升，與在人群中研究一致，但這種增高趨勢隨著甲基化酶抑制劑干預后下降，模型組IFN-γ表達顯著下降（P＜0.05），甲基化酶抑制劑干預后其表達顯著提高。甲基化酶抑制劑干預培養(yǎng)的淋巴細胞后，miR-326表達呈上升趨勢，但隨著甲基化酶抑制劑干預濃度上升而下降；IFN-γ蛋白表達下降，這種下降趨勢隨著甲基化酶抑制劑干預濃度上升有所減弱，說明甲基化酶抑制劑干預可上調miR-326及IFN-γmRNA表達，下調IFN-γ蛋白表達。本研究分別在人、動物模型及培養(yǎng)的外周血淋巴細胞中檢測了miR-326表達，分析甲基化酶抑制劑干預對其的影響，結果顯示miR-326在鼻炎患者外周血CD4+T高表達，甲基化酶抑制劑干預Jurkat細胞后miR-326表達呈上升趨勢，AR模型中也發(fā)現miR-326在大鼠鼻黏膜中表達上升，與在患者外周血淋巴細胞中的研究一致。

綜上，新疆維吾爾族鼻炎患病率低于漢族，這種差異可能受長期環(huán)境因素與表觀遺傳學（如miRNA表達及甲基化等改變）有關，表現為維吾爾族人群miR-326高表達與IL-4低表達，病例組IFN-γ呈低表達，甲基化干預可調控T細胞miR-326及IFN-γ表達，但在鼻黏膜差異無統(tǒng)計學意義。miR-326表達與IFN-γmRNA表達呈負相關，提示miR-326可能通過影響Th2細胞因子產生導致Th1/Th2失衡，最終導致AR發(fā)生。AR發(fā)病率逐年升高，新疆漢族鼻炎患病率高于維吾爾族，嚴重影響患者日常生活及學習，本研究顯示新疆維吾爾族和漢族AR患者miR-326高表達主要發(fā)生于CD4+T淋巴細胞，這種高表達的機制有待進一步研究。