謝麗娜，田璐毅，桂媛媛，陶俊恒，李漢廣

（江西農業(yè)大學 生物科學與工程學院/應用微生物研究所，江西 南昌 330045）

【研究意義】隨著全球經(jīng)濟的快速發(fā)展，人類對能源的需求日益增加，由于傳統(tǒng)化石燃料儲量的逐年減少，尋找可再生、清潔環(huán)保型能源十分迫切[1]。生物柴油是目前較為成功的新型清潔能源，其生產原料主要來源于油菜、大豆等植物以及各種動物油脂[2]。與這些動植物原料相比，微藻具有許多較為明顯的優(yōu)勢：光合效率高、生長周期短、油脂含量高及一年四季均可培養(yǎng)等優(yōu)點[3-4]。因此加強微藻生物柴油的研究對加快發(fā)展新型清潔環(huán)保能源，減少人類對化石能源的依賴具有重要的現(xiàn)實意義。【前人研究進展】發(fā)酵動力學可以模擬發(fā)酵過程中的動態(tài)變化，可為提高相應微生物的生長性能提供一定的理論基礎[5]。宋增光等[6]通過構建動力學模型來預測紫紅曲菌發(fā)酵薏米產α-生育酚過程，其結果與實際測定值接近，在通過該動力學模型指導下進行代謝調控發(fā)酵可以縮短生產周期、促進產物α-生育酚的合成。另一方面，為提高微藻生物柴油的競爭性，提高其油脂含量是現(xiàn)實可行的一種方式，傳統(tǒng)發(fā)酵過程中的代謝調控手段常應用于微藻的生產。肌醇廣泛存在于各種動植物和微生物體內，參與生物素的運輸以及細胞壁生物合成等過程，被認為是微藻等光合生物的生長促進劑[7]。Erbil 等[8]研究發(fā)現(xiàn)當向培養(yǎng)體系中添加500 mg/L 的肌醇時，海洋紫球藻的生物量相較于對照組提高了1.28倍?！颈狙芯壳腥朦c】本實驗室前期分離篩選獲得了一株生長性能較為優(yōu)良藻株X6，但其生長特性及如何提高其油脂含量并未進行深入研究，因此本試驗擬通過構建藻株X6在不同培養(yǎng)條件下的動力學模型以及探究外源調控（添加肌醇）提高藻株油脂產量的內在生理機制，以期進一步提高該藻株的應用性?！緮M解決的關鍵問題】通過Logistic、Luedeking-Piret 及Luedeking-Piret 修正方程構建藻株X6不同培養(yǎng)模式下的動力學模型，確定藻株X6最佳培養(yǎng)模式，并在此基礎上探究外源添加肌醇對藻株X6生長及生理影響，以期通過本論文的開展為提高其它類似產油性能方面提供一定的理論及試驗參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗所用藻株X6[小球藻，Chlorellasp.（GenBank：MK951683.1）]是本課題組保藏藻種；肌醇購自索萊寶公司；培養(yǎng)基使用BG-11培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分參考胡文軍等[9]。

1.2 試驗設計

1.2.1 微藻培養(yǎng) 自養(yǎng)培養(yǎng)、異養(yǎng)培養(yǎng)和混養(yǎng)培養(yǎng)的培養(yǎng)方式參照黎秋玲等[10]建立的方法。

1.2.2 藻株X6動力學模型構建 葡萄糖底物消耗速率可以采用Luedeking-Piret修正模型[11]，微藻細胞生長可采用Logistic 模型[12]，產物合成采用Luedeking-Piret 方程[10]。對藻株X6生長過程中的生物量、油脂含量以及底物消耗等的數(shù)據(jù)進行分析，描述其生長過程中細胞生長、油脂合成及基質消耗隨時間變化之間的關系。

1.2.3 不同濃度肌醇對藻株X6生長、油脂產量及生理影響 將藻液通過改良的BG-11培養(yǎng)基（外源添加15 g/L 葡萄糖的BG-11 培養(yǎng)基）培養(yǎng)至穩(wěn)定期，以10%的接種量接種至已滅菌的改良BG-11 培養(yǎng)基中，添加已過濾除菌的肌醇，使得培養(yǎng)基中肌醇的最終濃度為0.5，1.0，1.5，2.5，5.0 mg/L，每組試驗設置3 個重復，于120 r/min、27 ℃條件下?lián)u床中避光培養(yǎng)6 d。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 油脂含量的測定 采用胡文軍等[9]建立的氯仿-甲醇提取法提取微藻細胞中的油脂，計算公式如下：

1.3.2 蒽酮比色法測定總糖含量（total sugar content，TSC）可溶性總糖含量采用蒽酮-硫酸法測定[13]。

1.3.3 葡萄糖含量的測定 培養(yǎng)基中葡萄糖含量采用二硝基酸鑒定法（DNS）測定[14]。

1.3.4 可溶性蛋白質含量的測定 蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法[15]。

1.3.5 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定[16]取藻泥0.5 g 加入5 mL 10%三氯乙酸及少量的石英砂，冰浴研磨成勻漿，4 000 r/min 離心10 min。向試管中加入2 mL 上清液和2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液，混合均勻后沸水浴15 min，用分光光度計測其在450，532，600 nm 處的OD 值。計算公式如下：

式中Vt是提取液的總體積（mL），Vs是加入到反應體系的體積（mL），W是鮮重（g）。

式中V是藻液總體積。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

采用Excel 2019進行數(shù)據(jù)整理，用Origin 9.0作圖以及DPS 7.05進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件下藻株X6生長動力學曲線

為獲得藻株X6最佳培養(yǎng)方式及其對應的生長動力學曲線，對藻株X6進行自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)培養(yǎng)，分析藻株X6生長過程中生物量、底物消耗和油脂產量隨時間變化的關系，其結果如圖1所示。由圖1可知，在整個試驗周期內，自養(yǎng)培養(yǎng)模式下藻株X6的生物量及油脂含量變化幅度小，生長緩慢，油脂含量沒有明顯增加。而異養(yǎng)和混養(yǎng)培養(yǎng)模式下，0～24 h，微藻處于延遲期，生物量和油脂含量沒有顯著增加，底物消耗較少；24～96 h，微藻處于對數(shù)生長期，生物量和油脂含量急速增加；在96 h 后，微藻進入平穩(wěn)期，生物量變化不大，油脂含量繼續(xù)增加，但增幅較對數(shù)生長期平緩，此時葡萄糖含量持續(xù)降低；當培養(yǎng)時間為144 h，混養(yǎng)培養(yǎng)條件下藻株X6的油脂含量達到最大值0.85 g/L；而對于異養(yǎng)培養(yǎng)而言，其油脂含量最大值出現(xiàn)在156 h 時，具體為0.82 g/L；混養(yǎng)培養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)的最大生物量分別出現(xiàn)在168 h 和156 h，此刻它們的最大值分別為14.97 g/L和11.01 g/L。

圖1 不同培養(yǎng)模式下藻株X6的生長特性（a）、油脂合成（b）和葡萄糖消耗（c）Fig.1 Growth（a），lipid content（b），glucose consumption（c）of microalga X6 for three culture modes

在整個微藻培養(yǎng)過程中，混養(yǎng)培養(yǎng)下藻株X6的生物量和油脂含量始終高于異養(yǎng)培養(yǎng)，且油脂合成與微藻生長和底物消耗趨勢一致，表明藻株X6的生長與油脂合成的關系可能屬于生長偶聯(lián)型或部分生長偶聯(lián)型模式[10]，而自養(yǎng)培養(yǎng)條件下的生長特性在三者當中最差，因此后續(xù)僅探討混養(yǎng)與異養(yǎng)模型的構建。

2.2 發(fā)酵動力學模型擬合求解與檢驗

將圖1 的數(shù)據(jù)應用于Logistic、Leudeking-Piret 及Luedeking-Piret 修正模型，采用Origin 9.0 軟件進行非線性擬合，結果如表1所示。由表1可知，不同培養(yǎng)條件下的最大比生長速率（μm）相近，混養(yǎng)培養(yǎng)條件下的μm略大于異養(yǎng)培養(yǎng)，說明混養(yǎng)培養(yǎng)更適應于X6生物量的積累。對不同培養(yǎng)條件下X6生長情況、產物合成以及底物消耗進行擬合時，其擬合相關系數(shù)R2的數(shù)值均在0.9 以上，表明擬合方程能夠較好的描述X6不同培養(yǎng)條件下的生長情況。不同培養(yǎng)條件下的產物生成相關系數(shù)α和非產物生成相關系數(shù)β均不為零，且α遠大于β。在產物合成過程中，異養(yǎng)培養(yǎng)條件下的最大油脂合成速率QPmax大于混養(yǎng)培養(yǎng)，0～84 h期間，異養(yǎng)培養(yǎng)條件下的油脂含量始終高于混養(yǎng)培養(yǎng)；而84～144 h混養(yǎng)培養(yǎng)的油脂含量更高。同時不同培養(yǎng)條件下，混養(yǎng)培養(yǎng)的底物最大比消耗速率QSmax高于異養(yǎng)培養(yǎng)，這一結果與圖1不同培養(yǎng)條件的生長特性相符。

表1 動力學參數(shù)模擬值Tab.1 Simulation values of kinetic parameters

2.3 細胞生長模型

細胞生長動力學用Logistic方程描述:

式（4）中，dX/dt為藻細胞生長速度[g/（L·h）]，μm為微藻最大比生長速率（h-1），X為微藻生物量（g/L），Xm為微藻的最大生物量（g/L），t為發(fā)酵時間（h）。

對Logistic方程積分，得：

用Logistic 方程對試驗數(shù)據(jù)進行非線性擬合，結果見圖2。藻株X6異養(yǎng)培養(yǎng)的擬合相關系數(shù)R2=0.996 14，混養(yǎng)培養(yǎng)的R2=0.981 72，說明該方程的實測值與預測值擬合良好，可以以此作為描述X6生長的模型。藻株X6生物量與發(fā)酵時間函數(shù)為：

圖2 不同培養(yǎng)條件下藻株X6細胞干重實驗值與模型擬合結果的比較Fig.2 Comparison of the experimental cell dry weight of microalga X6with calculated values under different culture conditions

異養(yǎng)X6：X=7.345e0.05965t/(10.03+0.685 6e0.05965t)

混養(yǎng)X6：X=11.04e0.06052t/(13.80+0.758 3e0.06052t)

2.4 油脂合成動力學模型

微生物生長與產物合成的關系可分為生長偶聯(lián)型（α≠0，β=0）、部分生長偶聯(lián)型（α≠0，β≠0）和非生長偶聯(lián)型（α=0，β≠0）。油脂是微藻細胞生長過程中的重要產物，根據(jù)Luedeking-Piret方程可將油脂合成動力學描述為：

式（6）中，P為油脂含量（g/L）。

從圖1 可知，油脂的合成與細胞生長密切相關，當細胞進入對數(shù)生長期，油脂含量也迅速提高；當微藻細胞進入平穩(wěn)期，油脂含量也逐漸趨于平穩(wěn)。利用公式（4）、（5）和（6）建立油脂合成的數(shù)學模型，經(jīng)換算得：

根據(jù)表1的數(shù)據(jù)代入可得：

異養(yǎng)X6：P=0.098 64+[0.197 41e0.05965t/(10.030 31+0.685 61e0.05965t)]+0.043 11 ln(10.030 31+0.685 61 e0.5965t)

混養(yǎng)X6：P=0.030 63+[0.306 08e0.06052t/(13.802 16+0.758 35e0.06052t)]+0.038 49 ln(13.802 16+0.758 35e0.5965t)

藻株X6的油脂產量擬合曲線如圖3 所示，異養(yǎng)培養(yǎng)的擬合相關系數(shù)R2=0.957 72，混養(yǎng)培養(yǎng)的R2=0.940 57，結果表明實際數(shù)據(jù)與預測數(shù)據(jù)擬合良好，該方程可以較好的描述X6在不同培養(yǎng)條件下的產物合成情況。

圖3 不同培養(yǎng)條件下藻株X6油脂產量實驗值與模型擬合結果的比較Fig.3 Comparison of the experimental lipid content of microalga X6 with calculated values under different culture conditions

2.5 基質消耗動力學模型

基質消耗速率可以采用Luedeking-Piret修正模型表示：

對方程進行換算可得：

式（9）中S為葡萄糖濃度（g/L），S0為葡萄糖初始濃度（g/L），k1為微藻生長消耗系數(shù)，k2為產物消耗系數(shù)。

根據(jù)表1的數(shù)據(jù)代入可得：

異養(yǎng)X6：S=0.004 53ln(10.030 31+0.685 61e0.05965t)+(3.057 96e0.05965t-0.000 19)/(10.030 31+0.685 61e0.05965t)+13.587 10

混養(yǎng)X6：S=0.000 81ln(13.802 16+0.758 35e0.05965t)+(9.174 01e0.05965t-0.000 03)/(13.802 16+0.758 35e0.05965t)+14.457 59

藻株X6的底物消耗擬合曲線如圖4 所示，異養(yǎng)培養(yǎng)的擬合相關系數(shù)R2=0.983 11，混養(yǎng)培養(yǎng)的R2=0.991 22，結果表明實際數(shù)據(jù)與預測數(shù)據(jù)擬合良好，可以以此方程描述X6在不同培養(yǎng)模式下的底物消耗情況。

圖4 不同培養(yǎng)條件下藻株X6總糖含量的實驗值與模型擬合結果的比較Fig.4 Comparison of the experimental total sugar content of microalga X6with calculated values under different culture conditions

結合動力學擬合曲線與試驗數(shù)據(jù)可知，無論是異養(yǎng)培養(yǎng)還是混養(yǎng)培養(yǎng)，藻株X6的代謝變化趨勢基本保持一致，混養(yǎng)培養(yǎng)結合了自養(yǎng)培養(yǎng)與異養(yǎng)培養(yǎng)的優(yōu)點，其生物量顯著高于異養(yǎng)和自養(yǎng)，且在混養(yǎng)條件下其油脂含量最高，更有利于微藻脂質的合成。

2.6 肌醇對藻株X6生長及油脂產量的影響

為探究不同濃度肌醇對藻株X6生長及油脂產量的影響，本試驗將0.5，1.0，1.5，2.5，5.0 mg/L 的肌醇添加到改良的BG-11液體培養(yǎng)基（外加葡萄糖）中進行混養(yǎng)培養(yǎng)，發(fā)酵6 d后對藻株X6的生物量及油脂含量進行測定，結果如圖5 所示。由圖5 可知，X6的生物量隨著肌醇濃度的增加而逐漸增長，并在5.0 mg/L時達到最大值12.18 g/L，相對于對照組提高了9.57%；同時，油脂含量也伴隨肌醇濃度的增加而提高，在2.5 mg/L 時達到最大值1.70 g/L（此時油脂含量占藻細胞干重14.09%），相較于對照組提高了10.22%，雖然此時生物量與5.0 mg/L 添加條件下相比略有下降，但其油脂產率在肌醇濃度為2.5 mg/L 時達到最大值，故選擇此濃度為最佳添加量。

圖5 不同濃度的肌醇對藻株X6生物量及油脂產量的影響Fig.5 Effect of different concentrations of inositol on biomass and lipid production of microalga X6

2.7 肌醇對藻株X6生理生化性質的影響

2.7.1 肌醇對藻株X6胞內可溶性總糖含量的影響 肌醇對藻株X6胞內可溶性總糖含量的影響如圖6所示。從圖6 可知，可溶性總糖含量隨著肌醇濃度的增加出現(xiàn)先增加后又降低的趨勢，并在肌醇濃度為2.5 mg/L 時達到最大值140.11 mg/L，相對于對照組提高了87.54%，且外源添加肌醇的處理組胞內可溶性總糖含量始終高于對照組。

圖6 不同濃度的肌醇對藻株X6胞內可溶性總糖含量的影響Fig.6 Effect of different concentrations of inositol on the intracellular total soluble sugar content of microalga X6

2.7.2 肌醇對胞內可溶性蛋白質含量的影響 可溶性蛋白質含量是微藻細胞一個重要的生理生化指標，它既可以反映細胞內部代謝的活躍程度，又能在滲透調節(jié)中起到重要作用，并且與生物體的生長發(fā)育、抗逆性等密切相關，因此其含量的變化可直接反應藻體內代謝情況[18]。由圖7 可知，可溶性蛋白質的含量隨著肌醇濃度的增加而逐漸降低，當肌醇濃度為2.5 mg/L 時，可溶性蛋白質含量最低，為0.58 mg/mL，且蛋白質含量始終低于對照組，以上結果說明，肌醇會降低藻株X6的胞內可溶性蛋白質含量。

圖7 不同濃度的肌醇對藻株X6可溶性蛋白質含量的影響Fig.7 Effect of different concentrations of inositol on soluble protein content of microalga X6

2.7.3 肌醇對胞內丙二醛含量的影響 當微藻細胞受到外界不利因素脅迫時，機體會產生過量的活性氧（ROS），引起或加劇膜脂質過氧化作用，而丙二醛（MDA）是脂質過氧化反應的最終分解產物，因此丙二醛通常用于表示生物體在受到外界刺激后細胞的氧化損傷程度，丙二醛含量越高說明膜受損傷程度越大[19]。由圖8 可知，隨著肌醇濃度的增加，丙二醛的含量呈現(xiàn)先降低后又升高的趨勢，在肌醇濃度為2.5 mg/L 時，丙二醛的含量達到最小值0.16 mmol/mL，與對照組相比較降低了64.85%，另一方面，肌醇的添加使得丙二醛的含量始終低于對照組。以上結果表明，外源肌醇的添加能夠抑制微藻丙二醛的生成，降低微藻細胞膜系統(tǒng)受損傷的程度，對細胞膜有一定的保護作用。

圖8 不同濃度的肌醇對藻株X6丙二醛含量的影響Fig.8 Effect of different concentrations of inositol on malondialdehyde content of microalga X6

2.7.4 肌醇對胞內超氧陰離子自由基含量的影響 超氧陰離子自由基是生物體內活性氧（ROS）的重要組成部分，當微藻細胞受到外界環(huán)境脅迫時，細胞內會產生大量ROS，而當機體自身清除自由基的能力不足時，就會導致氧化應激損傷，最終超氧陰離子自由基的含量也隨之升高[20]。由圖9可知，隨著肌醇濃度的增加，超氧陰離子自由基的含量先降低后又升高，并在肌醇濃度為2.5 mg/L時達到最小值0.07μmol/mL，與對照組相比較降低了40.84%，而且肌醇的添加使得超氧陰離子自由基的含量始終低于對照組，說明肌醇能夠抑制藻株X6胞內超氧陰離子自由基的生成，對微藻細胞具有一定的保護作用。

圖9 不同濃度的肌醇對藻株X6超氧化物陰離子自由基含量的影響Fig.9 Effect of different concentrations of inositol on superoxide anion content of microalga X6

3 結論和討論

微生物發(fā)酵過程中構建發(fā)酵動力學模型是一項成熟的工作，但關于探究不同培養(yǎng)模式下微藻生長、產物合成、基質消耗等動力學的研究不多。本文研究了藻株X6在不同培養(yǎng)條件下的生長動力學，對自養(yǎng)培養(yǎng)、異養(yǎng)培養(yǎng)和混養(yǎng)培養(yǎng)三種培養(yǎng)模式下藻株X6的生長、產物合成和底物消耗進行了實時觀察，同時采用動力學模型（Logistic、Luedeking-Piret以及Luedeking-Piret修正方程）對異養(yǎng)培養(yǎng)和混養(yǎng)培養(yǎng)進行建模,結果表明藻株X6的油脂合成是部分生長偶聯(lián)型且混養(yǎng)培養(yǎng)更有利于其生物量及脂質的積累。藻株X6進行自養(yǎng)培養(yǎng)時，其油脂含量和生物量隨培養(yǎng)時間的延長變化不顯著；而在混養(yǎng)培養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)條件下，藻株X6的油脂含量及生物量急速增加，且混養(yǎng)培養(yǎng)條件下能獲得最高的生物量和油脂含量，分別為14.97 g/L 和0.85 g/L。黎小廷[21]研究了混養(yǎng)培養(yǎng)和自養(yǎng)培養(yǎng)對頓頂螺旋藻生長的影響，結果表明混養(yǎng)培養(yǎng)更有利于藻株的生長與油脂的累積，這與本試驗結果一致，但在該研究中混養(yǎng)培養(yǎng)條件下所獲得的最大生物量為3.87 g/L，僅為本試驗混養(yǎng)培養(yǎng)條件的25.85%，這也表明本論文所獲藻株X6具有較為優(yōu)良的生長特性，有進一步研究的價值。

肌醇化學結構類似葡萄糖，有研究表明其可作為促進微藻生長、提高代謝產物的碳源，在培養(yǎng)過程中加入如肌醇等多元醇可以使微生物在受到環(huán)境脅迫時提高其生長性能[22]。本試驗在探究肌醇對藻株X6生長及生理影響時發(fā)現(xiàn)，當肌醇濃度為2.5 mg/L時，藻株X6的油脂含量最高，占細胞干重的14.09%，且在此條件下其總糖含量達到最大值140.11 mg/L，相對于對照組提高了87.54%，而此時蛋白質含量達到最小值0.58 mg/mL。有研究表明，微藻能夠在光合碳劃分方面發(fā)生程序性變化，因此細胞生化成分，特別是脂質、碳水化合物和蛋白質的含量會隨環(huán)境和培養(yǎng)條件的變化而產生相應改變[23]。Qian等[24]也得到了類似的試驗結果，小球藻添加肌醇后更多的碳和能量將用于碳水化合物和脂質的生物合成，這與試驗結果中蛋白質含量降低而總糖含量與脂質含量提高的情況是一致的。丙二醛與超氧陰離子自由基含量可以作為判斷外源物質對微藻毒害程度的指標，當微藻細胞受到脅迫等不利條件時，其含量會上升。有研究表明[25-26]，外源添加肌醇可以增強抗氧化酶活性，抑制ROS的積累，保護細胞免受氧化應激損傷。而試驗結果表明隨著肌醇濃度的增加，丙二醛含量和超氧陰離子自由基含量逐漸降低，且始終低于對照組，說明肌醇在一定程度上降低了丙二醛及超氧陰離子自由基的含量，對微藻生物膜系統(tǒng)起到了一定的保護作用。

綜上所述，通過不同培養(yǎng)條件下發(fā)酵動力學模型的構建，可知藻株X6是部分生長偶聯(lián)型，在混養(yǎng)培養(yǎng)模式下有助于其生物量及脂質的積累。肌醇對藻株X6的生物量無顯著促進作用，但能提高其油脂生產強度，添加肌醇的處理組與對照組相比較X6的胞內可溶性蛋白質、超氧陰離子自由基和丙二醛含量均出現(xiàn)降低趨勢，且始終低于對照組，總糖含量升高，以上變化表明肌醇對微藻細胞具有一定的保護作用。

致謝：江西省教育廳科學研究項目(GJJ160388)和江西農業(yè)大學博士啟動基金（9232305387）同時對本研究給予了資助，謹致謝意！