劉雪蓮 程文博 朱俊義

(通化師范學(xué)院，通化，134002)

側(cè)金盞花(AdonisamurensisRegel et Radde)為毛茛科多年生草本植物，又名冰涼花、福壽草、頂冰花等，分布于東北地區(qū)山坡或山腳的灌木叢間、闊葉林下以及林緣地上[1]。側(cè)金盞花能在雪融之時(shí)迅速開花、展葉并結(jié)實(shí)，林冠層郁閉時(shí)地上植株迅速枯萎死亡，而地下部分隨即進(jìn)入休眠，屬于典型的早春類短命植物類型[2]。雖然側(cè)金盞花生育期極短僅40～60 d左右，但花期相對較長，可達(dá)20 d以上，且花大，色彩艷麗，花期可填補(bǔ)早春時(shí)節(jié)的空白，具有很好的觀賞價(jià)值，是春季園林美化的理想材料。因此，很多學(xué)者就側(cè)金盞花的生物學(xué)特性[3-8]、繁殖特性[9-12]、分子生物學(xué)[13-15]以及藥學(xué)[16-18]等方面開展了大量研究，梁宇等[19]研究了側(cè)金盞花花芽分化與地溫的關(guān)系，而關(guān)于側(cè)金盞花花芽分化形態(tài)特征、進(jìn)程及相關(guān)生理生化變化目前相關(guān)報(bào)道極少。本試驗(yàn)通過對側(cè)金盞花地下芽不同時(shí)間取樣，解剖觀察花芽分化形態(tài)，測定芽和根中相關(guān)代謝物質(zhì)含量和酶活性的變化，揭示側(cè)金盞花地下芽花芽分化過程及生理基礎(chǔ)，對了解花芽分化過程生理生化變化及制定栽培管理措施具有重要意義。

1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)用側(cè)金盞花生長于長白山脈通化段天然林下(125°55′45″～125°55′59″E，41°37′55″～41°37′59″N，海拔700～750 m)，2019年5月中下旬地上植株枯萎后將地下根莖移植于通化師范學(xué)院實(shí)踐栽培基地(125°58′49.63″E，41°44′47.04″N，海拔429 m)。該區(qū)位于吉林省東南部長白山脈通化段老嶺山脈和龍崗山脈之間，屬于北溫帶大陸性季風(fēng)氣候，冬季嚴(yán)寒而干燥，低溫時(shí)間長達(dá)5個月，夏季炎熱且高溫時(shí)間短促，年平均氣溫5.8 ℃，平均無霜期155 d，年降水量893～1 083.8 mm，主要集中在7—8月[20]。

2 材料與方法

從5月19日移植開始，每隔3 d取樣1次，將根莖上生長一致的小芽取下，用FAA固定液(V(70%乙醇)∶V(甲醛)∶V(冰乙酸)=90∶5∶5)固定48 h以上，通過石蠟切片和掃描電子顯微鏡(SEM)觀察確定花芽分化時(shí)期。

石蠟切片方法：取出經(jīng)FAA固定液固定的芽體，進(jìn)行芽整體染色(70%、50%乙醇各4～6 h后轉(zhuǎn)入愛氏蘇木精稀釋液整染4 d)；水洗返藍(lán)；然后進(jìn)行乙醇梯度脫水；1%伊紅溶液復(fù)染，無水乙醇脫水；氯仿逐級透明、石蠟滲透與包埋；Leica切片機(jī)切片，Olympus數(shù)碼生物顯微鏡(BX-51)觀察攝影[21]。

掃描電子顯微鏡(SEM)觀察的材料樣本的處理過程包括：取出經(jīng)FAA固定液固定的芽體，體視顯微鏡(ZEISS Stemi 508)下剝?nèi)パ亏[，暴露需要觀察的部分，將材料用乙醇、丙酮、乙酸異戊酯梯度脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥(Hitachi HCP-2)，粘臺，真空噴金鍍膜(KYKY SBC-2)，在HITACHI S-3000N型掃描電子顯微鏡下觀察與照相[22]。

芽及根中相關(guān)代謝產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)及酶活性的測定：根據(jù)解剖觀察的花芽分化進(jìn)程，將每一分化階段的芽和根用液氮速凍、超低溫冰箱-80 ℃保存，用于酶活和可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定，另取一部分于80 ℃烘干用于營養(yǎng)代謝產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定。淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、可溶性總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用蒽酮比色法；可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑光化還原法；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚比色法；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法[23]。

數(shù)據(jù)處理：采用Excel2013、Statistics V 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行誤差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 側(cè)金盞花花芽分化的形態(tài)進(jìn)程

經(jīng)解剖、掃描電子顯微鏡觀察和石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，側(cè)金盞花花芽分化可劃分為未分化期、花芽分化始期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期、雌蕊分化期6個時(shí)期，整個分化過程約經(jīng)歷60 d左右，其分化進(jìn)程及形態(tài)特點(diǎn)如圖1、圖2所示。

未分化期：側(cè)金盞花盛花期時(shí)根莖處便萌生地下芽，直到地上部枯萎一直進(jìn)行營養(yǎng)生長。5月中旬解剖觀察發(fā)現(xiàn)，地下芽莖尖分生組織扁平，寬度大于高度，體積小，周邊螺旋式分化出多個芽鱗原基，尚未進(jìn)行花芽分化(圖1：1；圖2：1)。

花芽分化始期：5月下旬，側(cè)金盞花的大部分地下芽由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L，莖尖分生組織體積增大，逐漸向上隆起成球形，高度與寬度相當(dāng)，可見花原基形成(圖1：2；圖2：2)。

萼片分化期：6月上旬，在花原基形成后，其基部分化出半月形的凸起，為萼片原基，基部較寬、先端平截，順時(shí)針向心式分化，萼片分化時(shí)間較短，大約8 d左右萼片原基分化完成，可見8～9枚萼片原基呈兩輪排列于花原基的基部(圖1：3；圖2：3～5)。

花瓣分化期：6月中旬，花瓣原基順著萼片原基的序列開始向心式分化，外形與萼片原基相似，共12～13枚，分3輪排列。約10～12 d分化完畢(圖1：4～7；圖2：6～7)

雄蕊分化期：6月下旬至7月上旬，花被原基形成后，在其內(nèi)側(cè)基部順時(shí)針向心方向順次形成突起，該突起組織內(nèi)細(xì)胞經(jīng)快速分裂、分化形成雄蕊原基，雄蕊原基半球形，與花瓣原基非常相似，共3～4輪(圖1：8～9；圖2：8)。

雌蕊分化期：雄蕊原基全部發(fā)生后，花托向上隆起，頂端變得平坦，雌蕊原基仍以順時(shí)針螺旋狀向心發(fā)生將整個花托充滿，無剩余空隙(圖1：10～12；圖2：9)，全部雌蕊原基分化完成約需10 d左右。

3.2 側(cè)金盞花花芽分化過程中營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

淀粉作為側(cè)金盞花根部的主要貯藏物質(zhì)，在生殖生長時(shí)會被大量消耗來維持正常的生理代謝活動。從表1可以看出，根中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨花芽分化的進(jìn)程呈快速下降趨勢，芽中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先升高后下降的趨勢。在未分化期淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大達(dá)96.29 mg·g-1，花芽分化始期開始明顯下降，在萼片分化期下降幅度最大，此時(shí)根中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28.35 mg·g-1，與未分化期相比，下降了70.56%。而后花器官各部分分化期時(shí)，根中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著。芽中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在未分化期時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，而在花芽分化始期質(zhì)量分?jǐn)?shù)陡然升高，隨后在萼片分化期又顯著降低(P<0.05)，而在后面的幾個分化階段質(zhì)量分?jǐn)?shù)趨于穩(wěn)定，這說明花芽分化消耗了根中大量的淀粉。

1.花芽未分化期，生長點(diǎn)分化出芽鱗；2.分化始期，花原基形成；3.萼片分化期，萼片原基以順時(shí)針向心式發(fā)生，兩輪；4～6.花瓣分化期，花瓣原基沿萼片的序列螺旋發(fā)生，3輪排列；7.花瓣原基發(fā)生后正面觀；8.雄蕊分化期，雄蕊原基發(fā)生；9.雄蕊原基發(fā)生正面觀，雄蕊原基3-4輪；10～12.雌蕊分化期，雌蕊原基發(fā)生，花托頂端平坦。BS.芽鱗;FP.花原基;Se.萼片;Pe.花瓣;St.雄蕊;Pi.雌蕊。比例尺:2=100 μm;3～5,7=200 μm;1,6,8～10,12=300 μm;11=500 μm。

表1 側(cè)金盞花花芽分化進(jìn)程中根、芽營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶活性變化

可溶性糖由淀粉降解產(chǎn)生，是側(cè)金盞花花芽分化過程中可直接運(yùn)輸與利用的養(yǎng)分形式。由表1可以看出，芽中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在花芽分化始期陡然升高，而后逐漸下降。而根中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化呈先下降后上升的趨勢，在雌蕊分化期顯著升高(P<0.05)，各階段根中可溶性總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于芽中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，說明側(cè)金盞花花芽分化需要消耗大量的糖類，根中大量的可溶性糖轉(zhuǎn)移到芽中用于完成花芽分化。

蛋白質(zhì)是細(xì)胞分裂和分化的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化與成花有密切關(guān)系。從表1可看出，芽和根中的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)在側(cè)金盞花花芽分化進(jìn)程中變化趨勢較為一致，均在花芽未分化期處于一個較低的水平，隨著花芽分化的啟動，蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提高，在花瓣分化期達(dá)到峰值，在雄蕊分化期時(shí)大幅度下降，而在雌蕊分化期又快速回升。

3.3 側(cè)金盞花花芽分化過程中抗氧化酶活性變化

如表1所示，側(cè)金盞花花芽分化期芽中超氧化物歧化酶(SOD)活性呈先升高后下降趨勢，在萼片分化期活性最強(qiáng)，為1 443.35 U·g-1·h-1，與未分化期活性相比提高了67.15%。萼片分化期后開始逐漸下降，到雌蕊分化期時(shí)芽中SOD活性為1 134.46 U·g-1·h-1，與未分化期活性相比仍提高了31.38%。根中SOD活性變化整體呈先升高后下降再升高的趨勢，雌蕊分化期活性最高為1 220.60 U·g-1·h-1，比未分化期活性提高了61.71%。除雌蕊分化期外，其他各時(shí)期芽中SOD活性均高于根中SOD活性。

芽中過氧化物酶(POD)活性在花芽分化期間呈先升高后降低再升高的趨勢變化，在萼片分化期時(shí)活性最高為3 730.83 U·g-1·min-1，隨后快速下降，雖在雌蕊分化期有提高，但花瓣分化期、雄蕊分化期、雌蕊分化期3個時(shí)期差異不顯著，與未分化期相比差異顯著(P<0.05)。根中POD活性呈波動變化，以花瓣分化期活性最低，雄蕊分化期活性最高。芽中POD活性在分化始期開始各時(shí)期均明顯高于根中。

側(cè)金盞花芽中過氧化氫酶(CAT)活性在花芽分化期間呈先升高后下降趨勢，前期活性提高緩慢，雄蕊分化期以前，各階段活性增加幅度較小，差異不顯著，而在雄蕊分化期活性陡然提高，達(dá)4 752.88 U·g-1·min-1，與未分化期相比提高了108.30%。根中CAT活性的變化趨勢與芽中的活性變化趨勢相近，雄蕊分化期前的各分化階段活性變化不大，活性基于平穩(wěn)，而在雄蕊分化期活性顯著增加，隨后又少量下降。說明CAT參與側(cè)金盞花花芽分化的調(diào)控，尤其對雄蕊和雌蕊原基的調(diào)控作用更強(qiáng)。

4 討論

4.1 側(cè)金盞花花芽分化形態(tài)發(fā)育特點(diǎn)

花芽分化是復(fù)雜的形態(tài)分化和生理生化過程，明確花芽分化的日期，了解側(cè)金盞花花芽分化的全過程及相關(guān)代謝產(chǎn)物含量及酶活性的變化，不僅可為掌握側(cè)金盞花生物學(xué)特性提供基礎(chǔ)資料，也為側(cè)金盞花引種栽培及管理提供理論依據(jù)。本研究采用石蠟切片方法和掃描電子顯微鏡觀察，明確了側(cè)金盞花花芽分化進(jìn)程及形態(tài)特點(diǎn)。側(cè)金盞花為早春類短命植物，5月中下旬地上部分枯萎死亡后，地下芽不進(jìn)行休眠，而是直接進(jìn)行花芽的形態(tài)分化，到7月中旬分化結(jié)束，大約需60 d左右。根據(jù)側(cè)金盞花花芽的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化將花芽分化劃分為花芽未分化期、分化始期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期、雌蕊分化期6個時(shí)期?；ㄑ糠只瓿珊筮M(jìn)一步發(fā)育至土壤上凍形成花蕾進(jìn)行越冬休眠。因此，側(cè)金盞花不存在夏季休眠，而是進(jìn)行著非常活躍的生理生化活動，完成了生活史中的全部形態(tài)建成。這一結(jié)果與萬清林[24]認(rèn)為側(cè)金盞花在春末夏初地上部分枯萎死亡后，地下貯藏器官要進(jìn)行夏季休眠以躲避高溫，而在秋季恢復(fù)地下的緩慢生長，形成充分分化的混合芽進(jìn)入冬季休眠不同。

4.2 營養(yǎng)物質(zhì)代謝對側(cè)金盞花花芽分化的影響

碳水化合物是重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一，作為機(jī)體代謝的主要能源、結(jié)構(gòu)物質(zhì)以及參與花發(fā)生調(diào)節(jié)因子的重要組分，它與植物的成花過程密切相關(guān)[25-26]。張?jiān)娖G等[27]研究表明海南蒲桃花芽形態(tài)分化初期和雄蕊雌蕊形成期，花芽可溶性糖和淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。汪曉謙等[28]研究發(fā)現(xiàn)郁金香在進(jìn)入花芽形態(tài)分化期后，鱗莖可溶性總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯升高。歐陽芬等[29]認(rèn)為錐栗完全混合花芽、不完全混合花芽及葉芽中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢相似，峰值均出現(xiàn)在冬后花序原基分化期；李志娟等[30]研究表明，萱草莖尖可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在花序原基形成期瞬時(shí)升高。根中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在芽生理分化期出現(xiàn)高峰，在花序原基分化期根內(nèi)淀粉顯著下降，至花原基分化期質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，側(cè)金盞花花芽分化過程中，地下芽和根中活躍的生理代謝為花芽分化和發(fā)育提供了營養(yǎng)保障。側(cè)金盞花在花芽未分化期根中淀粉大量積累達(dá)到峰值，在分化始期，根中淀粉和可溶性總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所下降，而芽中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和可溶性總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)積累達(dá)到峰值，且芽中可溶性總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于根中；此后隨著花芽分化進(jìn)程的推進(jìn)，根中和芽中可溶性糖和淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅降低。由此可以初步認(rèn)為，花芽分化期間，根作為營養(yǎng)庫需不斷向芽體輸送營養(yǎng)物質(zhì)。芽體中較高含量的淀粉和可溶性糖有利于花芽分化的進(jìn)行，而此后的含量減少是由于側(cè)金盞花花芽形態(tài)分化需要大量的能源供給造成的。芽中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在花芽分化始期瞬時(shí)升高，可作為側(cè)金盞花花芽形態(tài)分化的顯著生理標(biāo)志。

可溶性蛋白既是成花轉(zhuǎn)化的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，又是不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，是植物花芽分化的物質(zhì)基礎(chǔ)。臧紗紗研究表明[31]，線辣椒葉片內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)在芽生理分化期達(dá)到峰值，此后逐漸下降，從萼片分化期到花芽分化結(jié)束保持平穩(wěn)狀態(tài)。郭金麗[32]認(rèn)為，蘋果梨生理分化期花芽和花枝中蛋白質(zhì)大量積累，形態(tài)分化期由于各花器原基形態(tài)分化需大量蛋白質(zhì)用于器官建成，造成花枝中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)持續(xù)下降。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，花芽未分化期根中和芽中可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)處于一個較低的水平，而在花瓣分化期質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到峰值。說明較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的可溶性蛋白質(zhì)有利于花芽形態(tài)分化的起始，而較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的可溶性蛋白質(zhì)則促進(jìn)花瓣和雌蕊的分化。與汪曉謙等[28]在郁金香花芽分化的研究結(jié)果相一致。

4.3 抗氧化酶活性對側(cè)金盞花花芽分化的影響

除了營養(yǎng)物質(zhì)外，花芽分化還需要一系列的酶類參與調(diào)控。SOD、POD、CAT作為植物細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化酶類，具有重要的生理功能，可更好地維持細(xì)胞內(nèi)氧自由基濃度的平衡，保護(hù)花芽頂端分生組織免受活性氧的毒害作用，使花芽分化得以有序進(jìn)行[33-34]。大量研究表明，花芽分化伴隨的抗氧化酶類活性的增強(qiáng)。SOD、POD、CAT活性增強(qiáng)有利于花芽分化[35]，本試驗(yàn)研究結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)。在側(cè)金盞花的花芽分化過程中，芽中抗氧化酶活性均明顯高于根中；芽中SOD、POD活性在萼片分化期達(dá)到峰值后逐漸下降，CAT活性在雄蕊分化期達(dá)到峰值。說明不同的酶對花芽分化調(diào)控作用的時(shí)期不同。這與胡靜等[33]在西紅花花芽分化研究結(jié)果一致。

5 結(jié)論

側(cè)金盞花在夏眠期完成花芽分化，其形態(tài)分化進(jìn)程可分為未分化期、分化始期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期、雌蕊分化期6個時(shí)期。淀粉、可溶性糖、可溶性蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)及SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性的變化，對側(cè)金盞花花芽分化具有明顯的調(diào)控作用?；ㄑ糠只案械矸酆涂扇苄钥偺琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著花芽分化進(jìn)程逐漸被消耗，芽中淀粉和可溶性總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在花芽分化始期快速積累，隨后由于花芽分化消耗而逐漸減少。根和芽中可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體呈先升高后降低趨勢，在花瓣分化期達(dá)到最大值。花芽分化期間芽中抗氧化酶活性均明顯高于根中，芽中高濃度的可溶性糖、可溶性蛋白以及高活性的SOD、POD、CAT有利于促進(jìn)側(cè)金盞花的花芽分化。有關(guān)側(cè)金盞花花芽分化過程中激素的調(diào)控作用及分子生物學(xué)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。