宋崢 喻艷 汪瑞清

摘要：

以中油雜11號(hào)（Brassica napus L.）為材料，采用不同時(shí)間低溫處理油菜幼苗，不同濃度5-氮胞苷（5-azaC）藥液處理油菜萌動(dòng)種子，通過(guò)觀察莖尖花芽分化進(jìn)程并測(cè)定莖尖DNA甲基化水平，研究了低溫和5-azaC對(duì)油菜花芽分化和莖尖DNA甲基化的影響。結(jié)果表明，6℃低溫處理幼苗6、12、18d能促進(jìn)油菜花芽分化;50μmol/L 5-azaC處理萌動(dòng)種子促進(jìn)油菜花芽分化，且與低溫促進(jìn)花芽分化的作用具有加成作用;250、500μmol/L[JP] 5-azaC處理萌動(dòng)種子抑制油菜花芽分化;低溫和5-azaC處理均能降低莖尖DNA甲基化水平。說(shuō)明低溫降低油菜植株莖尖DNA甲基化水平并促進(jìn)花芽分化;低濃度5-azaC具有代替低溫促進(jìn)油菜花芽分化的作用;甘藍(lán)型油菜為種子春化植物;幼苗比萌動(dòng)種子更容易受到低溫處理的影響。

關(guān)鍵詞：

油菜;5-氮胞苷;低溫;花芽分化;DNA甲基化

中圖分類號(hào)：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：1019754/jnyyjs20190315011

油菜生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中需要經(jīng)歷低溫春化才能從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變到生殖生長(zhǎng)階段[1]，花芽分化是生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變完成的標(biāo)志。近年來(lái)，植物生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變研究的熱點(diǎn)之一是轉(zhuǎn)變過(guò)程中DNA甲基化水平的變化及其影響因素[2-5]。5-氮胞苷（5-azaC）是一種去甲基化試劑，在DNA復(fù)制過(guò)程中能取代胞嘧啶核苷加入到DNA新鏈中，由于嘧啶環(huán)上甲基結(jié)合部位被氮原子占據(jù)，導(dǎo)致DNA鏈不能被甲基修飾而去甲基化。對(duì)模式植物擬南芥開(kāi)花研究的結(jié)果表明，低溫、5-azaC和赤霉素都可促進(jìn)其開(kāi)花[6]。油菜生長(zhǎng)發(fā)育與DNA甲基化的研究還很少。本文研究5-azaC和低溫對(duì)油菜花芽分化和莖尖DNA甲基化的影響，以期能為油菜生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

11材料

采用甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）中油雜11號(hào)為試驗(yàn)材料（中國(guó)農(nóng)科院油料作物研究所選育并提供）。5-azaC購(gòu)自Sigma公司。試驗(yàn)于2007[CD1]2008年度在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田進(jìn)行。

12幼苗低溫處理

10月17日大田直播。11月13日將幼苗移栽于4個(gè)苗盆（40cm×30cm×25cm）置于室內(nèi)，其中3盆分別于0（當(dāng)日）、6、12d后置于6℃光照培養(yǎng)箱，室內(nèi)光照條件與培養(yǎng)箱中相同。18d后將全部幼苗移栽回大田，即低溫處理時(shí)間分別為18、12、6、0d（CK），記為T3、T2、T1、CK1。每處理種植1小區(qū)，順序排列，小區(qū)面積14m2，密度11000株/667m2。

處理結(jié)束當(dāng)日每處理取10株幼苗莖尖于-80℃冰箱保存，用于測(cè)定DNA甲基化水平。DAT（移栽后天數(shù)，days after transplanted）12開(kāi)始，每4d每小區(qū)取7株莖尖，解剖鏡下觀察花芽分化。

13萌動(dòng)種子5-azaC處理

10月21日將種子均等置于室內(nèi)4個(gè)鋪有濾紙的發(fā)芽盒（12cm×12cm×5cm）中清水催芽。3d后將萌發(fā)種子置于20℃光照培養(yǎng)箱中，每2d添加1次5-azaC藥液，濃度分別為0（CK）、50、250、500μmol/L，記為CK2、C1、C2、C3。10d后用清水替代5-azaC藥液。15d后將子葉期幼苗移栽入大田。每處理種植1小區(qū)，順序排列，小區(qū)面積及移栽密度同12。

處理結(jié)束當(dāng)日每處理取10株子葉期幼苗莖尖于-80℃冰箱中保存，用于測(cè)定DNA甲基化水平。DAT35開(kāi)始每4d每小區(qū)取7株莖尖，解剖鏡下觀察花芽分化。[JP]

14萌動(dòng)種子5-azaC加低溫處理

10月21日將種子均等置于室內(nèi)4個(gè)鋪有濾紙的發(fā)芽盒（12cm×12cm×5cm）中清水催芽。3d后將萌發(fā)種子置于6℃光照培養(yǎng)箱中，每2d添加1次5-azaC藥液，濃度分別為0（CK）、50、250、500μmol/L，記為CK3、C4、C5、C6。10d后將發(fā)芽盒轉(zhuǎn)移至20℃光照培養(yǎng)箱，用清水替代5-azaC藥液。15d后將子葉期幼苗移栽入大田。每處理種植1小區(qū)，順序排列，小區(qū)面積及移栽密度同12。

取樣方法同13。

15花芽分化進(jìn)程

通過(guò)解剖鏡觀察并參照劉后利[7]油菜花芽分化的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)確定花芽分化級(jí)別。采用公式1計(jì)算花芽分化指數(shù)以確定花芽分化進(jìn)程。

花芽分化指數(shù)=∑cfn公式1

注：c-分化級(jí)別（1級(jí)：生長(zhǎng)點(diǎn)膨大，無(wú)花原基;2級(jí)：具1-5個(gè)花原基;3級(jí)：花原基進(jìn)一步增多;4級(jí)：花原基伸長(zhǎng);5級(jí)：花萼原基分化）;f-每級(jí)別分化株數(shù);n-觀察總株數(shù)

16莖尖DNA甲基化水平測(cè)定

DNA提取：參照李合生[8]CTAB法提取莖尖DNA。

DNA濃度和純度檢測(cè)：采用紫外分光光度法比色檢測(cè)DNA的濃度和純度。

DNA水解：參照吳筱丹[9]的方法水解DNA。

DNA甲基化水平測(cè)定：參照吳筱丹[9]高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定DNA甲基化水平，并作部分修改。色譜柱：Varian C18柱;流動(dòng)相：甲醇-5mmol/L庚烷磺酸鈉-三乙胺（10∶90∶02，v/v），pH=40，流速為07ml/min;檢測(cè)器波長(zhǎng)：273nm。

2結(jié)果與分析

21低溫處理幼苗對(duì)油菜花芽分化的影響

DAT12所有處理花芽分化指數(shù)均為100，花芽分化未開(kāi)始（圖1）。DAT16 T3花芽分化開(kāi)始。DAT20 T2花芽分化開(kāi)始。DAT24所有處理都已經(jīng)開(kāi)始花芽分化，此時(shí)花芽分化指數(shù)T3>T2>T1>CK1。DAT28各處理花芽分化指數(shù)比較結(jié)果同DAT24。

各處理中T3分化進(jìn)程最快，其次是T2、T1，CK1分化進(jìn)程最慢。說(shuō)明本試驗(yàn)范圍內(nèi)，低溫處理油菜幼苗能促進(jìn)莖尖花芽分化，且低溫處理時(shí)間越長(zhǎng)，促進(jìn)效果越好。

22 5-azaC處理萌動(dòng)種子對(duì)油菜花芽分化的影響

DAT35所有處理花芽分化均未開(kāi)始（圖2）。DAT39 C1花芽分化開(kāi)始。DAT43所有處理都已經(jīng)開(kāi)始花芽分化，此時(shí)花芽分化指數(shù)C1>CK2>C2>C3。DAT47、DAT51各處理花芽分化指數(shù)比較結(jié)果同DAT43。

各處理中C1分化進(jìn)程最快，其次是CK2、C2，C3分化進(jìn)程最慢。說(shuō)明本試驗(yàn)范圍內(nèi)，低濃度5-azaC處理油菜萌動(dòng)種子能促進(jìn)莖尖花芽分化，而中高濃度5-azaC處理則抑制了莖尖花芽分化，且濃度越高，抑制效果越明顯。

23 5-azaC加低溫處理萌動(dòng)種子對(duì)油菜花芽分化的影響

DAT35所有處理花芽分化均未開(kāi)始（圖3）。DAT39所有處理都已經(jīng)開(kāi)始花芽分化，此時(shí)花芽分化指數(shù)C4>CK3>C5>C6。DAT43、DAT47各處理花芽分化指數(shù)比較結(jié)果同DAT39。

各處理中C4分化進(jìn)程最快，其次是CK3、C5，C6分化進(jìn)程最慢。說(shuō)明本試驗(yàn)范圍內(nèi)，低濃度5-azaC加低溫處理油菜萌動(dòng)種子能促進(jìn)莖尖花芽分化，而中高濃度5-azaC加低溫處理則抑制了莖尖花芽分化，且濃度越高，抑制效果越明顯。

對(duì)比DAT39～DAT51期間C1和C4處理結(jié)果，C4處理花芽分化指數(shù)均高于同一時(shí)期C1處理。說(shuō)明本試驗(yàn)范圍內(nèi)，低濃度5-azaC與低溫處理對(duì)促進(jìn)莖尖花芽分化有加成作用。

對(duì)比39～51 DAT期間CK2和CK3處理結(jié)果，CK3處理花芽分化指數(shù)均高于同一時(shí)期CK2處理。說(shuō)明本試驗(yàn)范圍內(nèi)，低溫處理油菜萌動(dòng)種子也能促進(jìn)莖尖花芽分化。

24低溫處理幼苗對(duì)莖尖DNA甲基化的影響

油菜幼苗經(jīng)不同時(shí)間低溫處理后，莖尖DNA甲基化水平均低于未處理的對(duì)照（表1），T1、T2、T3較對(duì)照分別下降了1868%、2173%和2668%。各處理與對(duì)照差異顯著，其中T3與對(duì)照差異極顯著。說(shuō)明本試驗(yàn)范圍內(nèi)，低溫處理油菜幼苗能降低莖尖DNA甲基化水平，且處理時(shí)間越長(zhǎng)，下降幅度越大。

25 5-azaC處理萌動(dòng)種子對(duì)莖尖DNA甲基化的影響

DNA甲基化水平均低于未處理的對(duì)照（表1），C1、C2、C3較對(duì)照分別下降了3094%、2818%和2405%。C1、C2與對(duì)照差異顯著，C3與對(duì)照差異不顯著。說(shuō)明本試驗(yàn)范圍內(nèi)，5-azaC處理油菜萌動(dòng)種子能降低莖尖DNA甲基化水平，低濃度處理下降幅度大于中高濃度處理。

[BT（2+1]265-azaC加低溫處理萌動(dòng)種子對(duì)莖尖DNA甲基化的影響[BT）]

油菜萌動(dòng)種子經(jīng)不同濃度5-azaC加低溫處理后，莖尖DNA甲基化水平均低于未處理的對(duì)照（表1），C4、C5、C6較對(duì)照分別下降了4038%、3492%和3129%。各處理與對(duì)照差異顯著。處理之間差異不顯著。說(shuō)明本試驗(yàn)范圍內(nèi)，5-azaC加低溫處理油菜萌動(dòng)種子能降低莖尖DNA甲基化水平，低濃度處理下降幅度大于中高濃度處理。

對(duì)比C1～C6同濃度處理結(jié)果，莖尖DNA甲基化水平C4

對(duì)比CK2和CK3處理結(jié)果，莖尖DNA甲基化水平CK3

對(duì)比T1和CK3處理結(jié)果，油菜幼苗經(jīng)過(guò)6d低溫處理后莖尖DNA甲基化水平為3425%，萌動(dòng)種子經(jīng)過(guò)10d低溫處理后甲基化水平為3773%。說(shuō)明油菜幼苗比萌動(dòng)種子更容易受到低溫處理的影響。

3小結(jié)與討論

31低溫降低DNA甲基化水平

本試驗(yàn)表明低溫處理萌動(dòng)種子或莖尖降低油菜植株莖尖DNA甲基化水平并促進(jìn)花芽分化，與李梅蘭等[10]在白菜上研究結(jié)果相同。低溫降低DNA甲基化水平致使花芽分化控制基因去甲基化后得到表達(dá)，促進(jìn)花芽分化，或者通過(guò)提高植株內(nèi)源赤霉素含量誘導(dǎo)植株提前抽薹，花芽分化提前[11]，也可能低溫與赤霉素對(duì)花芽分化調(diào)控是兩條獨(dú)立途徑[12]。

32花芽分化與DNA甲基化水平

本試驗(yàn)表明低濃度5-azaC能代替低溫促進(jìn)油菜花芽分化，且與低溫處理有加成作用。與李梅蘭等[6]、汪炳良等[13]在白菜、蘿卜上研究結(jié)果相同。5-azaC降低植株DNA甲基化水平進(jìn)而促進(jìn)花芽分化，與低溫處理的加成作用可能正是因?yàn)閮烧呔哂邢嗤淖饔猛緩?。甲基化水平下降可以促進(jìn)花芽分化，但也會(huì)對(duì)植株產(chǎn)生其它影響，中高濃度5-azaC對(duì)植株產(chǎn)生了一定的毒害作用，造成植株體內(nèi)代謝紊亂，從而抑制了花芽分化。

33甘藍(lán)型油菜春化類型

本試驗(yàn)表明6℃低溫處理中油雜11號(hào)萌動(dòng)種子10d后植株花芽分化進(jìn)程較未經(jīng)低溫處理的植株提前，說(shuō)明萌動(dòng)種子也能接受低溫誘導(dǎo)從而導(dǎo)致植株提前花芽分化，證明甘藍(lán)型油菜為種子春化植物，與冬小麥、蘿卜、白菜等[14]相同，與綠體春花植物甘藍(lán)[14]不同。

34低溫處理與植株大小

本試驗(yàn)表明油菜幼苗經(jīng)過(guò)6℃低溫處理6d后DNA甲基化水平相比萌動(dòng)種子經(jīng)過(guò)6℃低溫處理10d后更低。說(shuō)明油菜幼苗比萌動(dòng)種子更容易受到低溫處理的影響。植株幼苗各種生理代謝活動(dòng)比萌動(dòng)種子活躍，接受外界刺激的應(yīng)激反應(yīng)也更強(qiáng)烈，因而更容易受低溫處理影響。

參考文獻(xiàn)

[1]

丁秀綺.白菜型春油菜花芽分化研究[J].作物學(xué)報(bào)，1990，16（1）：83-90.

[2] Finnegan E J， Peacock W J， Dennis E. DNA methylation， a key regulation of plant development and other processes[J]. Cur Opion in Genet and Develop， 2000（10）： 217-223.