祝巍，王立君，沈文生，王思思，李穎，李雨靜，王靜竹，高燕，方聰，趙寒陽，孫秀紅，孫智勇

（1.吉林省婦幼保健院新生兒科，吉林長春 130012；2.吉林大學第一醫(yī)院小兒呼吸科，吉林長春 130061；3.吉林大學第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學院，吉林長春 130061；4.延邊大學醫(yī)學院兒科系，吉林延吉 133002）

新生兒大腦缺氧缺血是兒童死亡和神經(jīng)功能障礙的常見原因，導致長期延遲的認知和行為缺陷[1-2]。使用干細胞或祖細胞來減輕腦損傷或促進再生是一種很有前途的治療方法，已在不同的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和缺血性疾病中進行了嘗試[3-4]。大腦缺氧缺血導致原代細胞喪失，神經(jīng)干細胞可能產(chǎn)生膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元譜系細胞[5-6]。有證據(jù)表明，細胞替代可能是提高學習和記憶能力的最重要機制之一。然而，大腦缺氧缺血后，移植細胞經(jīng)常被微環(huán)境誘導凋亡。治療性亞低溫通過多種機制發(fā)揮強大的神經(jīng)保護作用，如降低代謝率、減少谷氨酸釋放、減少活性氧的形成、防止血腦屏障破壞，以及調(diào)節(jié)炎癥和凋亡因子的表達[7-8]。迄今為止，低溫是最有希望的神經(jīng)保護劑，其具有多方面的神經(jīng)保護作用，包括減少梗塞，減少細胞內(nèi)鈣內(nèi)流，降低細胞內(nèi)酸中毒，抑制氧自由基的形成，預(yù)防血腦屏障破壞和抑制炎癥細胞浸潤。臍帶血中檢測到具有高增殖潛能的未成熟造血干/祖細胞、間充質(zhì)干細胞等，多種干細胞及免疫細胞可以通過多種途徑治療缺氧缺血性腦病，為組織再生建立有利的細胞微環(huán)境，促進腦損傷后恢復(fù)。因此，本研究通過復(fù)制新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage, HIBD）模型，探討亞低溫聯(lián)合人臍帶血間充質(zhì)干細胞（umbilical cord blood mesenchymal stem cells, UCMSCs）移植治療缺氧缺血性腦病的療效及潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物7日齡新生SD清潔級乳鼠330只，體重7～9 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2020-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（吉）2019-0012。將乳鼠飼養(yǎng)在（24±2）℃、12 h 晝/夜循環(huán)照明，相對濕度為40%～70%的環(huán)境中，隨機獲取水和食物。

1.1.2 動物分組及HIBD 模型的復(fù)制將7日齡新生乳鼠330 只，隨機分為11 組，每組30 只。空白對照組（A 組）、HIBD 常溫組（B 組）、HIBD 亞低溫持續(xù)72 h 組（C 組）、HIBD 亞低溫24 h 干細胞移植組（D組）、HIBD 亞低溫48 h 干細胞移植組（E 組）、HIBD亞低溫72 h 移植組（F 組）、HIBD 亞低溫24 h 后持續(xù)3 d 移植干細胞（G 組）、HIBD 24 h 干細胞移植組（H 組）、HIBD 48 h 干細胞移植組（I 組）、HIBD 72 h干細胞移植組（J 組）、HIBD 24 h、48 h、72 h 干細胞移植組（K 組）。復(fù)制HIBD 模型[9]：乳鼠乙醚麻醉1 min 后，解剖顯微鏡下剪開乳鼠頸部正中皮膚，于胸鎖乳突肌深部分離左側(cè)頸總動脈，用6-0 F 絲線結(jié)扎兩端并剪斷血管，術(shù)后恢復(fù)2 h。將乳鼠放入37℃密閉缺氧箱，持續(xù)充入8%氧氣+92%氮氣的混合氣體，氣流量0.5～1.0 L/min，缺氧2 h。A 組：只分離左側(cè)頸總動脈但不結(jié)扎，縫合皮膚后不做缺氧處理。B 組乳鼠維持肛溫36～37℃。C～G 組在HIBD 模型復(fù)制成功后立即置于自制可控溫箱內(nèi)，維持肛溫32～33℃，亞低溫治療期間乳鼠為人工管飼配方乳喂養(yǎng)，亞低溫治療72 h 后放回母鼠身邊，由母鼠喂養(yǎng)。A、B、H～K 組乳鼠均由母乳喂養(yǎng)。干細胞移植為人臍血單核細胞（human cord blood mononuclear cells, hCMNCs）乳鼠鼻腔內(nèi)移植，干細胞移植數(shù)量為：通過微量注射器鼻腔注入2 μL UCMSCs 細胞懸液（1×106個細胞），時間＞5 min，留針5 min。第10 天、第21 天和第35 天各組乳鼠進行稱重[10]。

1.1.3 主要試劑酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（武漢賽維爾生物有限公司），抗CD24（1∶100）、抗CD29（1∶100）（美國Abcam 公司），4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）（美國Vector Laboratories Inc 公司）。

1.1.4 主要儀器Morris 水迷宮（吉林大學第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學院），Epon（英國Agar Scientific 公司），透射電子顯微鏡（型號：JEM-1400 系列120 kV，美國JEOL 公司）,脫水機（型號：JJ-12J）、包埋機（型號：JB-P5）（武漢俊杰電子有限公司），病理切片機（型號：RM2016，上海徠卡儀器有限公司），偏光顯微鏡（型號：BX-51，日本Olympus 公司），低溫恒溫器（型號：CM3050S-3，美國Leica Microsystems公司）。

1.2 方法

1.2.1 早期神經(jīng)反射HIBD 模型復(fù)制成功后，分別觀察各組乳鼠第12 天的懸崖調(diào)轉(zhuǎn)反射、陰性趨地性、步態(tài)反射。①懸崖調(diào)轉(zhuǎn)反射：將長、寬各30 cm的木板放置在水平桌面邊緣，分別將乳鼠的雙側(cè)前爪置于木板邊緣，松開乳鼠后開始記錄乳鼠爬動并掉轉(zhuǎn)頭部與木板邊緣呈90°時所需時間。如果＞60 s乳鼠不能完成反射，則記錄實驗最高值為60 s。②陰性趨地性：將長度為30 cm 的木板置于桌面上，傾斜度為35°。乳鼠頭朝下放置于木板上，雙側(cè)后爪置于木板中央，記錄乳鼠爬動掉轉(zhuǎn)身體并將頭部朝上（180°）所需時間。如果＞60 s 乳鼠仍不能調(diào)轉(zhuǎn)身體則記錄實驗最高值為60 s。③步態(tài)反射：將乳鼠置于直徑為13 cm 的白色圓紙中央，白色圓紙固定于桌面，記錄乳鼠雙側(cè)前爪爬出圓紙邊緣的時間。如果＞60 s 乳鼠前爪不能爬出圓紙邊緣，則記錄實驗最高值為60 s。每天3 種反射各進行3 次，取3 次的平均值，2 次反射評估間隔時間＞5 min，以便乳鼠得到充分休息。

1.2.2 Morris 水迷宮實驗各組HIBD 模型復(fù)制成功后28 d 進行Morris 水迷宮實驗，以逃避潛伏期所需時間來評估乳鼠的學習和記憶能力。Morris 水迷宮由平臺、圓形水池和記錄裝置組成，水池上空通過一個數(shù)字攝像機與計算機相連接。水池直徑120 cm，高60 cm，池壁黑色，將水池分東北、東南、西南和西北4 個象限。每天開始實驗時，在水池里注水30 cm 深，圓柱形平臺由透明有機玻璃做成，置于任一象限中央，平面沒于水面下l cm。為避免乳鼠直接看到平臺，在水中加入白色懸浮聚乙烯顆粒，使水不透明，水溫維持在（22±5）℃左右。水池四周用藍色布簾包圍，布簾上面掛有4 個幾何圖形作為空間參照物，且位置始終保持不變，每天換水。所有乳鼠均進行隱蔽平臺實驗5 d、探索實驗1 d，以評價各組乳鼠學習和記憶能力。每次實驗在隔音的房間內(nèi)進行，水池、光源、鼠籠等實驗室各物件的位置保持不變。隱蔽平臺實驗測試前，讓乳鼠在不含平臺的水池中自由游泳2 d，熟悉迷宮環(huán)境。實驗時平臺置于東北象限中央且位置固定不變。在平臺對側(cè)選取2 個與之距離相等的點作為入水點，將乳鼠面貼壁輕輕放入水中，記錄乳鼠找到平臺的時間（逃避潛伏期）。如果乳鼠90 s 內(nèi)找不到平臺，則潛伏期計為90 s，每天在2 個入水點各進行一次測試，用2 次逃避潛伏期的平均數(shù)進行統(tǒng)計分析。

1.2.3 透射電鏡觀察乳鼠腦組織神經(jīng)元細胞及突觸超微結(jié)構(gòu)取HIBD 模型復(fù)制成功后第8 天乳鼠的腦組織，取1 mm×1 mm×1 mm 海馬組織固定在4%多聚甲醛中，再固定于2%四氧化鋨。用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）洗滌，在30%、50%和70%乙醇中梯度脫水，在95%乙醇、無水乙醇和環(huán)氧丙烷中繼續(xù)脫水。將樣品嵌入Epon，將80 nm 厚的超薄切片安裝在銅網(wǎng)格上，透射電子顯微鏡下進行觀察。

1.2.4 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色觀察乳鼠腦組織病理學變化取HIBD 模型復(fù)制成功后第3 天、第21 天乳鼠的腦組織，浸入4℃、4%甲醛溶液中24 h。腦組織脫水、包埋在石蠟塊中，切成4 μm 厚的冠狀切片。切片脫蠟、水化，行HE 染色。采用由偏光顯微鏡組成的計算機輔助圖像分析系統(tǒng)，用200 和400 放大倍數(shù)拍攝。

1.2.5 ELISA檢測白細胞介素6（Interleukin-6,IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、神經(jīng)上皮干細胞蛋白（Nestin）、β-微管蛋白（βtubulin, TUBB）、甘露糖結(jié)合蛋白（mannose-bindingprotein, MBP）含量收集各組HIBD 模型復(fù)制成功后第3 天、第8 天、第12 天乳鼠的腦組織。腦組織在1 mL 冰冷的PBS（pH=7.2）中通過超聲處理均質(zhì)化，4℃、12 000 r/min 離心20 min，收集上清液，采用ELISA 試劑盒測定蛋白含量。

1.2.6 免疫熒光染色檢測乳鼠腦組織中移植的人臍帶血CD24 和CD29 陽性表達率取HIBD 模型復(fù)制成功后第21 天乳鼠的腦組織，置于10%甲醛中固定過夜。腦組織在20%蔗糖溶液中浸泡2 d，轉(zhuǎn)移到30%蔗糖溶液中2 d，最后將大腦嵌入OCT 化合物置于-80℃條件下冷凍。在低溫恒溫器內(nèi)-20℃條件下將冷凍腦組織切成10 μm 厚的冠狀切片。將切片的組織固定在載玻片上用于免疫熒光染色。PBS 清洗3 次，5～10 min/次，0.3% Triton X-100 室溫孵育15 min。PBS 清洗3 次，5 min/次，5%驢血清室溫封閉1 h，在4℃條件下與一抗CD24（1∶100）、CD29（1∶100）孵育過夜，PBS 洗滌后，室溫下與二抗CD24（1∶200）、CD29（1∶200）孵育2 h。用PBS 洗滌載玻片3 次，10 min/次。最后用DAPI 覆蓋，采用熒光顯微鏡Leica DMi8 對載玻片進行可視化，并通過Leica Application Suite 軟件進行分析。為評估CD24（綠色熒光）和CD29（紅色熒光）細胞的數(shù)量，對各組腦組織3 個不同切片中的每個視野進行計數(shù)，以平均數(shù)表示每平方毫米的陽性細胞占比。

1.2.7 熒光顯微鏡測量線粒體膜電位HIBD 模型復(fù)制成功第21 天，將乳鼠安樂死，灌注冰冷的PBS，從腦組織中分離出線粒體。將神經(jīng)元與JC-1 染色溶液在37℃條件下孵育20 min，用JC-1 染色緩沖液洗滌，浸入神經(jīng)元培養(yǎng)基中。使用熒光顯微鏡拍攝陽性染色細胞圖像。正常線粒體產(chǎn)生紅色熒光，去極化或失活的線粒體產(chǎn)生綠色熒光。線粒體膜電位為紅色與綠色熒光的比率。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組乳鼠的行為學變化

實驗前各組乳鼠行為能力正常，B 組乳鼠在行左側(cè)頸總動脈剪斷時先出現(xiàn)躁動、持續(xù)顫抖，繼而出現(xiàn)精神萎靡，嗜睡少動，出箱后少數(shù)出現(xiàn)抽搐、全身僵直、角弓反張表現(xiàn)。所有HIBD 模型乳鼠在缺氧缺血過程中相繼出現(xiàn)煩躁不安、氣促、發(fā)紺、肌肉顫動、全身抖動、站立不穩(wěn)、不能翻身，行走時右后肢拖步、夾尾右旋，復(fù)氧后1 h 表現(xiàn)為固定向左側(cè)旋轉(zhuǎn)運動。

2.2 各組乳鼠體重變化

A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K 組乳鼠生長第10 天、第21 天和第35 天體重比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點乳鼠體重有差異（F=13.285，P=0.000），各組乳鼠第21 天與第35 天體重比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；②各組乳鼠體重有差異（F=20.097，P=0.000），B 組乳鼠體重較A 組降低（P＜0.05），C～K 組乳鼠體重較B 組升高（P＜0.05），G、I 組乳鼠體重較B、C、D、E、F、H、J、K組均升高（P＜0.05），且G 組與I 組乳鼠體重比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；③各組乳鼠體重變化趨勢有差異（F=28.712，P=0.000）。見表1。

表1 各組乳鼠不同時間點體重比較 （n=30，g，±s）

表1 各組乳鼠不同時間點體重比較 （n=30，g，±s）

組別A組B組C組D組E組F組G組H組I組J組K組第10天24.47±3.28 22.71±2.38 24.15±3.33 23.09±3.12 24.62±2.12 24.46±4.05 25.39±3.22 23.17±2.26 25.52±3.13 22.68±2.21 23.47±3.22第21天70.53±3.52 27.38±2.39 31.56±3.28 36.38±2.66 45.25±2.18 40.62±2.44 64.54±3.11 54.21±3.18 65.51±377 59.31±3.50 48.46±2.17第35天134.62±6.49 55.29±5.24 63.17±3.61 69.29±4.15 83.25±3.26 75.24±3.14 121.54±5.33 96.24±3.18 125.48±3.29 102.47±5.33 89.36±4.22

2.3 各組乳鼠早期行為反射比較

A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K 組HIBD 模型復(fù)制成功第12 天乳鼠的懸崖調(diào)轉(zhuǎn)反射、陰性趨地性、步態(tài)反射比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：C～F 組3 種反射時間較A 組延長（P＜0.05），但較B 組縮短（P＜0.05）；C 組3 種反射時間較A、D～J 組延長（P＜0.05）；G～K 組3 種反射時間與A 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；C～F 組3 種反射時間較G～K 組延長（P＜0.05）。見表2。

表2 各組乳鼠早期行為反射比較（n=30，s，±s）

表2 各組乳鼠早期行為反射比較（n=30，s，±s）

組別A組B組C組D組E組F組G組H組I組J組K組F 值P 值懸崖調(diào)轉(zhuǎn)反射23.17±4.48 52.26±5.26 46.37±4.18 34.26±3.11 37.00±4.05 39.00±3.26 26.49±3.44 25.24±4.18 27.36±3.11 24.35±5.25 27.51±3.86 23.044 0.001陰性趨地性20.52±3.17 54.51±4.39 48.32±3.15 33.38±4.30 35.14±5.38 36.27±4.12 22.51±4.26 24.71±3.23 25.67±4.29 26.33±6.20 28.52±6.33 19.586 0.001步態(tài)反射30.54±3.22 51.38±4.72 46.25±5.38 37.49±3.86 35.22±3.16 37.37±4.26 32.86±3.25 34.56±3.77 36.41±4.32 36.51±6.74 36.21±5.44 31.321 0.001

2.4 各組乳鼠腦組織病理學變化

HE 染色結(jié)果顯示，與A 組比較，B～K 組乳鼠HIBD 模型復(fù)制成功后第3 天，腦間質(zhì)水腫，小血管間隙增寬，左側(cè)大腦出現(xiàn)大片壞死，細胞溶解、破壞、消失；皮質(zhì)海馬神經(jīng)元排列紊亂，核固縮、崩解，細胞濃染，并見小膠質(zhì)細胞。第21 天，B～K 組與A組有差異，B～K 組腦組織見不同程度的損傷，其中B 組可見大的梗塞灶及液化空洞形成，表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)模糊，炎癥細胞增多，神經(jīng)元壞死，神經(jīng)細胞表型為空泡，細胞質(zhì)淡染，細胞核固縮，染色呈藍褐色，部分細胞發(fā)生裂解、溶解。C～K 組表現(xiàn)為部分炎癥細胞；B 組與C～K 組比較，腦損傷程度較大。其中G、J、K 組腦損傷及炎癥程度較C～F、H、I 組小。見圖1。

圖1 各組乳鼠腦組織病理切片檢查 （HE染色）

2.5 各組乳鼠逃避潛伏期比較

A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K 組乳鼠逃避潛伏期分別為（16.36±4.27）s、（102.56±18.44）s、（73.29±8.27）s、（68.34±6.59）s、（63.31±5.02）s、（69.44±5.68）s、（39.62±5.18）s、（74.51±6.37）s、（66.29±5.15）s、（42.55±6.43）s和（45.64±5.18）s，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=10.772，P=0.003）。進一步兩兩比較結(jié)果：B～K 組逃避潛伏期較A 組延長（P＜0.05），G、J、K 組逃避潛伏期較B～F、H 組縮短（P＜0.05）。

2.6 各組乳鼠腦組織神經(jīng)元細胞及突觸超微結(jié)構(gòu)變化

超微電鏡觀察結(jié)果顯示，A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K 組HIBD 模型復(fù)制成功第8 天乳鼠神經(jīng)元致密區(qū)長度、致密區(qū)厚度、突觸間隙寬度比較，經(jīng)單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：B～K 組神經(jīng)元致密區(qū)長度較A 組變短（P＜0.05），厚度較A 組變?。≒＜0.05），而突觸間隙寬度較A 組變厚（P＜0.05）。C～K 組乳鼠神經(jīng)元致密區(qū)長度較B 組變長（P＜0.05），厚度較B 組變厚（P＜0.05），突觸間隙寬度較B 組變?。≒＜0.05）。G～J 組乳鼠神經(jīng)元致密區(qū)長度較D～F、K 組變長（P＜0.05），厚度較D～F、K 組變厚（P＜0.05），突觸間隙寬度較D～F、K 組變?。≒＜0.05）。見表3 和圖2。

圖2 各組乳鼠神經(jīng)元細胞（透射電子顯微鏡）

表3 各組乳鼠神經(jīng)元細胞及突觸超微結(jié)構(gòu)比較（n=30，nm，±s）

表3 各組乳鼠神經(jīng)元細胞及突觸超微結(jié)構(gòu)比較（n=30，nm，±s）

組別A組B組C組D組E組F組G組H組I組J組K組F 值P 值致密區(qū)長度532.47±43.26 288.10±14.95 301.34±18.43 336.30±22.42 353.62±21.53 347.45±23.74 420.20±26.76 398.35±29.54 449.32±29.44 407.54±28.55 387.30±25.44 11.645 0.013致密區(qū)厚度39.35±5.39 22.69±4.30 29.63±5.78 31.40±5.81 33.20±4.64 32.73±4.25 37.69±6.35 34.11±6.33 38.20±5.77 36.35±5.41 33.63±4.54 9.006 0.021突觸間隙寬度18.31±3.72 25.20±2.14 23.29±2.88 22.62±3.96 21.95±2.22 22.20±2.56 20.97±2.28 21.04±1.25 20.04±2.30 20.62±1.93 22.43±1.98 13.732 0.009

2.7 各組乳鼠腦組織炎癥因子和干細胞分化標記蛋白比較

A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K 組HIBD 模型復(fù)制成功后第3 天、第8 天、第12 天乳鼠腦組織TNF-α、IL-6、Nestin、TUBB、MBP 比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點TNF-α、IL-6、Nestin、TUBB、MBP 有差異（F=39.451、19.754、36.957、16.794和16.958，均P=0.000）；②各組乳鼠TNF-α、IL-6、Nestin、TUBB、MBP 有差異（F=10.719、10.159、43.271、5.947 和11.217，P=0.000、0.000、0.000、0.012和0.000）；B～K 組TNF-α、IL-6 在HIBD 模型復(fù)制成功第3 天、第8 天和第12 天較A 組升高（P＜0.05），C～K 組TNF-α、IL-6 較B 組降低（P＜0.05）。C～K組Nestin、TUBB 和MBP 較B 組升高（P＜0.05）。③各組乳鼠TNF-α、IL-6、Nestin、TUBB、MBP 變化趨勢有差異（F=22.678、25.483、6.597、20.159 和20.154，P=0.000、0.000、0.003、0.000 和0.000）。見表4。

表4 各組乳鼠不同時間點TNF-α、IL-6、Nestin、TUBB、MBP比較（n=30，pg/mL，±s）

表4 各組乳鼠不同時間點TNF-α、IL-6、Nestin、TUBB、MBP比較（n=30，pg/mL，±s）

組別TNF-α IL-6 Nestin第3天0.35±0.06 0.24±0.03 0.41±0.10 0.42±0.09 0.44±0.10 0.37±0.07 0.45±0.10 0.44±0.09 0.37±0.08 0.35±0.08 0.41±0.12第3天3.15±0.26 12.79±2.36 8.48±0.77 6.64±0.47 5.40±1.02 7.43±1.16 11.51±1.94 9.48±1.22 6.63±0.58 9.99±1.25 14.03±2.51第8天3.39±0.29 13.52±2.41 8.55±0.98 6.88±0.63 5.96±1.13 7.59±1.25 11.81±2.03 9.62±1.35 6.71±0.75 10.21±1.39 15.10±2.98第12天3.98±0.51 13.62±3.01 9.12±1.02 7.32±0.69 5.99±1.35 8.68±1.25 12.55±2.20 10.12±1.59 7.71±0.87 10.36±1.58 15.51±2.87第3天3.56±0.44 21.84±3.53 13.86±1.32 13.76±1.24 1031±1.06 11.78±1.24 9.54±1.00 10.70±1.15 7.05±0.95 9.38±1.01 12.71±1.47第8天3.72±0.52 23.01±3.82 14.15±1.63 14.52±1.71 11.12±1.06 12.55±1.63 9.87±1.21 11.32±1.31 7.95±1.02 9.95±1.19 13.32±1.78第12天3.92±0.55 23.65±4.26 15.62±2.31 16.01±2.37 12.98±1.57 13.15±2.20 10.89±1.52 11.66±1.71 8.68±1.16 9.96±1.27 14.05±2.26 A組B組C組D組E組F組G組H組I組J組K組第8天0.39±0.08 0.27±0.05 0.50±0.16 0.49±0.11 0.52±0.13 0.41±0.10 0.49±0.11 0.53±0.12 0.39±0.09 0.38±0.07 0.46±0.15第12天0.40±0.08 0.29±0.06 0.59±0.15 0.63±0.12 0.64±0.16 0.45±0.09 0.51±0.11 0.54±0.12 0.42±0.09 0.46±0.09 0.49±0.17組別TUBB MBP A組B組C組D組E組F組G組H組I組J組K組第3天0.32±0.04 0.23±0.02 0.29±0.02 0.27±0.02 0.25±0.01 0.27±0.02 0.39±0.05 0.31±0.07 0.47±0.09 0.36±0.06 0.36±0.05第8天0.38±0.06 0.27±0.05 0.31±0.04 0.30±0.03 0.26±0.03 0.30±0.04 0.42±0.06 0.35±0.08 0.48±0.10 0.38±0.07 0.42±0.04第12天0.36±0.05 0.29±0.03 0.36±0.06 0.38±0.05 0.29±0.02 0.31±0.03 0.42±0.06 0.36±0.09 0.49±0.12 0.39±0.07 0.38±0.06第3天0.57±0.13 0.38±0.08 0.46±0.08 0.47±0.08 0.48±0.08 0.44±0.05 0.54±0.09 0.51±0.10 0.65±0.10 0.55±0.09 0.43±0.04第8天0.60±0.21 0.40±0.09 0.51±0.10 0.49±0.09 0.53±0.11 0.47±0.06 0.57±0.12 0.53±0.11 0.66±0.12 0.59±0.10 0.45±0.06第12天0.63±0.14 0.428±0.10 0.49±0.10 0.52±0.11 0.53±0.15 0.54±0.09 0.57±0.11 0.58±0.16 0.76±0.19 0.63±0.11 0.51±0.09

2.8 各組乳鼠腦組織CD24 和CD29 陽性表達率比較

A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K 組乳鼠腦組織CD24 和CD29 陽性表達率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：A～C 組CD24 和CD29 陽性表達率較E～K 組降低（P＜0.05），G、I 組較H、J、K 組CD24 和CD29 陽性表達率升高（P＜0.05）。見表5 和圖3。

圖3 各組乳鼠腦組織CD24和CD29的陽性表達（免疫熒光染色×100）

表5 各組乳鼠腦組織CD24和CD29陽性表達率比較（n=30，%，±s）

表5 各組乳鼠腦組織CD24和CD29陽性表達率比較（n=30，%，±s）

組別A組B組C組D組E組F組G組H組I組J組K組F 值P 值CD24陽性表達率1.03±0.36 1.77±0.41 1.53±0.24 5.26±1.33 19.35±3.55 8.61±1.47 40.27±5.33 30.57±3.26 44.25±6.33 35.47±4.22 23.51±3.56 13.775 0.003 CD29陽性表達率0.71±0.18 0.58±0.17 0.36±0.21 1.21±0.55 3.41±1.26 2.15±0.44 5.73±2.44 4.51±2.49 5.89±1.77 4.97±1.05 4.41±1.36 11.203 0.026

2.9 各組乳鼠腦組織線粒體膜電位比較

A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K 組乳鼠腦組織線粒體膜電位分別為（1.96±0.28）AU、（0.75±0.04）AU、（0.85±0.03）AU、（1.10±0.11）AU、（1.27±0.13）AU、（1.31±0.15）AU、（1.64±0.23）AU、（1.52±0.18）AU、（1.71±0.20）AU、（1.43±0.16）AU 和（1.48±0.18）AU，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=13.527，P=0.0014）。進一步兩兩比較結(jié)果：B～K 組線粒體膜電位較A 組降低（P＜0.05），C～K 組線粒體膜電位較B 組升高（P＜0.05），G～J 組線粒體膜電位較C～F 組升高（P ＜0.05）。

3 討論

新生兒腦缺氧缺血可在12～24 h 內(nèi)導致死亡或神經(jīng)功能缺損（包括癲癇發(fā)作、反射改變、意識水平扭曲、發(fā)育遲緩、癲癇、智力低下和腦癱）[11-12]。目前，人們越來越關(guān)注將干細胞移植作為以神經(jīng)細胞死亡為特征的神經(jīng)退行性疾病的恢復(fù)性方法。干細胞具有分裂和分化為成熟神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的能力，但在發(fā)育和成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中不存在[13-14]。干細胞優(yōu)先遷移到損傷區(qū)域，并在移植到缺氧缺血性腦后第14～21 天表達神經(jīng)元標志物，證明大腦影響這些細胞以誘導神經(jīng)元分化。UCMSCs是一種源于新生兒臍帶組織中的多功能的成體干細胞（已經(jīng)分化組織中的未分化細胞），具有干細胞特有的多向分化潛能。有研究證實，UCMSCs 在特定條件下可分化為脂肪、骨、軟骨、神經(jīng)、心肌、內(nèi)皮等多種組織細胞，并且具有免疫調(diào)節(jié)特性，可用于多種病變引起的組織器官損傷修復(fù)和再生[15-16]。然而，在后期形成的神經(jīng)元數(shù)量較少，可能只有5%移植細胞分化成神經(jīng)元。此外，移植后細胞能力差是臨床應(yīng)用的嚴重問題。盡管＞90%細胞在移植時是存活的，但只有5%～10%細胞在移植后存活。另一項研究發(fā)現(xiàn)，移植后2 周內(nèi)，＜50%移植神經(jīng)干細胞繼續(xù)在小鼠腦組織中存活。提高移植物存活率是提高細胞療法臨床價值的基本策略。在植入過程中，細胞受到缺氧缺血性損傷。調(diào)整缺氧缺血性大腦的微環(huán)境可以促進移植干細胞的分化和提高存活率，從而改善缺氧缺血性損傷小鼠的神經(jīng)功能。亞低溫可以減少缺氧缺血后損傷和縮小短暫局灶性缺血中的梗塞體積。低溫為有意控制地將正常體溫降至30～35℃（輕度）、28～32℃（中度）和20～28℃（深度）范圍內(nèi)的溫度。輕度低溫又稱亞低溫，是最有前途的神經(jīng)保護劑，具有多方面的神經(jīng)保護作用，并且中至深度低溫同樣具有保護作用。已知亞低溫通過多種機制發(fā)揮強大的神經(jīng)保護作用，包括降低代謝率、減少谷氨酸釋放、減少活性氧的形成、防止血腦屏障破壞，以及調(diào)節(jié)炎癥和凋亡因子的表達[17-20]。迄今為止，有多種冷卻方法，包括冷卻毯和侵入性血管內(nèi)冷卻裝置，在臨床上廣泛應(yīng)用。實驗中，通常在動物周圍放置冰袋、冰毯或施用藥物來誘導亞低溫。亞低溫可顯著降低重度顱腦創(chuàng)傷后患者的病死率并改善預(yù)后。有研究表明，亞低溫可減少內(nèi)在和外在的凋亡途徑，并防止腦組織在缺血缺氧后發(fā)生繼發(fā)性損傷[21-23]。本研究結(jié)果表明，亞低溫聯(lián)合UCMSCs 移植治療比單一治療更有效。HIBD 模型乳鼠表現(xiàn)為行為遲鈍、少動，體重增長緩慢。經(jīng)過低溫、干細胞移植后，HIBD 模型乳鼠的神經(jīng)反射行為得到明顯改善，體重增加。HIBD 模型乳鼠腦組織均見不同程度的損傷，經(jīng)過單一低溫或干細胞移植治療后海馬神經(jīng)元損傷降低，并改善神經(jīng)元細胞及突觸超微結(jié)構(gòu)。神經(jīng)炎癥反應(yīng)是未成熟大腦發(fā)育的關(guān)鍵病理生理因素。缺氧缺血性損傷的初始炎癥反應(yīng)導致繼發(fā)性神經(jīng)元損傷。缺氧缺血會激活小膠質(zhì)細胞，即大腦中的常駐免疫細胞，破壞血腦屏障，導致外周白細胞浸潤，從而進一步加劇炎癥和腦損傷[24-26]。本研究中，亞低溫、干細胞移植或聯(lián)合治療都顯著降低了HIBD 模型乳鼠腦組織炎癥因子TNF-α 和IL-6 水平，并發(fā)現(xiàn)低溫下更能促進干細胞分化。HIBD 后大量活性氧的產(chǎn)生會導致氧化應(yīng)激，線粒體是主要靶點之一[27-28]。線粒體損傷最初的特征是膜電位降低。將JC-1 熒光探針用于指示膜電位的變化，當線粒體膜電位正常時，JC-1 會在線粒體基質(zhì)中積累并發(fā)出紅色熒光，而當線粒體膜電位降低或塌陷時，JC-1 不能積累并發(fā)出綠色熒光。本研究中，A 組乳鼠神經(jīng)元發(fā)出紅色熒光，很少觀察到綠色熒光；然而HIBD 乳鼠腦神經(jīng)元紅色熒光強度大大降低，綠色熒光明顯增強。HIBD 乳鼠在經(jīng)過亞低溫或者干細胞治療后線粒體膜電位損失恢復(fù)，這說明亞低溫和干細胞治療逆轉(zhuǎn)了HIBD 乳鼠的能量衰竭。盡管亞低溫聯(lián)合干細胞移植對HIBD 發(fā)揮了保護作用，但亞低溫24 h 后持續(xù)3 d 干細胞移植效果最好，因為研究中發(fā)現(xiàn)亞低溫降低炎癥反應(yīng)，同時降低干細胞活性，但因持續(xù)補充干細胞，數(shù)量增多，故效果顯著。本研究中，亞低溫48 h 移植干細胞效果和單純48 h 移植干細胞效果次之。其原因是24 h 炎癥爆發(fā)期，炎癥消耗干細胞；48 h 炎癥穩(wěn)定期，刺激干細胞分泌抗炎外泌體，定向分化；72 h 腦損傷期，腦神經(jīng)元損傷重，干細胞大量消耗[29]。無論亞低溫加干細胞移植還是單純干細胞移植效果均優(yōu)于單純亞低溫治療。

綜上所述，臍帶血干細胞具有來源豐富，采集方便，對供者無傷害，干細胞增殖分化能力更強，免疫原性更低等諸多優(yōu)點。亞低溫聯(lián)合UCMSCs 能改善HIBD 乳鼠認知障礙和能量衰竭，對腦神經(jīng)有保護作用。此外，接受持續(xù)亞低溫干細胞移植治療的乳鼠在長期行為測試和組織病理變化中表現(xiàn)更好。