徐 冉，劉海容，崔婧媛

（1. 同濟大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092；2. 上海污染控制與生態(tài)安全研究院，上海 200092）

近年來，我國農(nóng)業(yè)發(fā)展逐漸從傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)向現(xiàn)代農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)型，一方面提升農(nóng)業(yè)科技水平，加大農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化經(jīng)營力度，一方面兼顧農(nóng)業(yè)生態(tài)和農(nóng)業(yè)環(huán)境保護機制，推進實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展［1］?；屎娃r(nóng)藥在農(nóng)業(yè)發(fā)展的路途中一直發(fā)揮著不可或缺的作用，但同時也對糧食安全和農(nóng)業(yè)生態(tài)造成了巨大的影響。隨著新技術(shù)的出現(xiàn)和材料科學(xué)的進步，學(xué)者和企業(yè)研發(fā)出了環(huán)境安全、生態(tài)友好的農(nóng)藥控釋制劑，以達到精準釋放、減少農(nóng)藥濫用現(xiàn)象的目的。微膠囊即是近年逐步興起的一種控釋技術(shù)，通過利用殼核結(jié)構(gòu)將目標物質(zhì)封裝，以屏蔽外界環(huán)境因素變化影響的技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對芯材的有效保護，控制芯材的緩慢釋放，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品［2］、醫(yī)藥［3］、個護［4］和紡織［5-6］領(lǐng)域。

二氧化硅是廣泛應(yīng)用于玻璃、光導(dǎo)纖維、耐火材料、涂料、陶瓷等生產(chǎn)制造領(lǐng)域的重要無機固體材料，具有穩(wěn)定、耐高溫、耐酸（除HF外）的特性，是兼具穩(wěn)定性和低成本的良好無機壁材。二氧化硅在化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性的優(yōu)越表現(xiàn)，使得其在封裝領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。Butstraen 等［7］以正硅酸乙酯（TEOS）為硅前驅(qū)體，通過溶膠-凝膠法制備二氧化硅包覆的蓖麻油的微膠囊，并評價了微膠囊產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)其熱失重率減少27%。

天然除蟲菊酯作為一種來自于天然植物的神經(jīng)毒劑，相較于化學(xué)農(nóng)藥而言，具有高效、廣譜［8］、低毒、低抗［9］和環(huán)境友好［10-11］的突出優(yōu)點，其發(fā)展受限于光熱易分解所導(dǎo)致的實際應(yīng)用成本高。本研究旨在使用溶膠凝膠法，以TEOS為硅前驅(qū)體，制備天然除蟲菊酯的二氧化硅微膠囊，解決其光熱易分解的特性，增強天然除蟲菊酯在農(nóng)藥施用領(lǐng)域的適用性，從而推廣其作為農(nóng)田農(nóng)藥和衛(wèi)生農(nóng)藥的使用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

實驗材料：天然除蟲菊酯原液，紅河森菊生物有限責任公司；正硅酸四乙酯、曲拉通X-100、冰醋酸、氫氧化鈉均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

實驗儀器：FA2004 型電子分析天平，上海精科天平廠；85-2 型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器廠；DZF-6020型真空干燥箱，上海精宏試驗設(shè)備有限公司；SY-300 超聲細胞破碎儀，上海寧商超聲儀器有限公司；SCIENTZ-12N 型冷凍干燥箱，寧波新芝生物科技有限公司；PHS-3C型精密pH計，上海雷磁有限公司；XL-30E掃描電子顯微鏡，荷蘭Philips公司；Q600SDT 綜合熱分析儀，美國TA 公司；BRUER VECTOR22傅里葉變換紅外光譜儀，瑞士Bruker公司；Agilent 1200 HPLC-DAD高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；Mastersizer 3000 型馬爾文激光粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司等。

1.2 微膠囊的制備與優(yōu)化

1.2.1 微膠囊的制備

根據(jù)徐冉等［12］的方法制備以二氧化硅為壁材的天然除蟲菊酯微膠囊，稱取一定質(zhì)量乳化劑曲拉通X-100 于純水中，在設(shè)定溫度下水浴攪拌溶解，轉(zhuǎn)速700 r·min-1。向分散均勻的溶液中加入一定量天然除蟲菊酯原藥后，轉(zhuǎn)速不變，恒溫攪拌1 h，形成穩(wěn)定的水包油（O/W）乳液。配置1 mol·L-1的NaOH 溶液，調(diào)節(jié)乳液pH 值。稱取一定質(zhì)量的TEOS，用注射器逐滴滴入上述調(diào)節(jié)pH值后的乳液中，繼續(xù)反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束關(guān)閉攪拌，保持溫度不變陳化3～5 h，得到微膠囊懸浮液。將所得微膠囊乳液靜置、分液、過濾后冷凍干燥，即得所需乳白色微膠囊粉末。反應(yīng)機理如圖1所示。

圖1 二氧化硅微膠囊反應(yīng)機理Fig.1 Mechanism of synthesis of microcapsules with silicon dioxide

1.2.2 微膠囊的制備條件優(yōu)化

采用響應(yīng)曲面法對溶膠-凝膠法制備除蟲菊酯微膠囊的制備條件進行優(yōu)化。選擇pH、TEOS投加量（固定芯材投加量為0.50 g）、反應(yīng)溫度3 個因素，每個因素選3 個水平，以微膠囊中除蟲菊酯的載藥率為響應(yīng)值，影響因素及水平列于表1 中。使用軟件Design-Expert V8.0.5.0 進行Box-Behnken 實驗設(shè)計和結(jié)果分析，共需進行17次實驗得到響應(yīng)曲面擬合方程并得到最優(yōu)制備條件。方差分析（ANOVA）表生成線性項、平方項和二次交互作用項的影響和回歸系數(shù)。用p值（概率）檢驗各個系數(shù)的顯著性，p＜0.05表示模擬方程項顯著。回歸系數(shù)做統(tǒng)計計算生成回歸模型和等值線圖。

表1 響應(yīng)面各影響因子及水平設(shè)置Tab.1 Settings of response surface impact factors and level

1.3 微膠囊的性能表征

1.3.1 天然除蟲菊酯成分及載藥率測定

天然除蟲菊酯成分測定：采用液相色譜法對微膠囊中天然除蟲菊酯的總含量及游離含量進行測定分析。液相色譜的條件經(jīng)篩選如下：使用DiKMA C18 液相色譜柱（150×4.6 mm，5 μm），進樣量為20 μl，流速為1.000 ml·min-1，流動相A 為超純水，B為乙腈，柱溫40℃，檢測波長230 nm。采用梯度洗脫法，58%B 相平衡5 min 后，至35 min 提升B 相比例至75%，1 min后提升B為100%，保持10 min。最后調(diào)回B 相至初始比例58%，平衡10 min。根據(jù)天然除蟲菊酯特征峰的保留時間進行定性，根據(jù)特征峰的峰面積進行定量分析。

微膠囊載藥率測定：稱取50 mg 微膠囊粉末加入具塞離心管內(nèi)，加入一定量乙腈1 000 r·min-1離心3 次洗去表面除蟲菊酯，加入定量乙腈，使用超聲破碎儀處理15 min 后，1 500 r·min-1離心處理10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至25 ml容量瓶定容，用0.22 μm有機濾膜過濾待測。載藥率Lc［13］的計算公式為

Lc=wp∕wm×100% （1）

式中：wp為微膠囊中除蟲菊酯原藥的質(zhì)量；wm為對應(yīng)微膠囊樣品粉末的質(zhì)量。

1.3.2 表面形貌表征

利用掃描電子顯微鏡在一定掃描電壓下觀察樣品的表面形貌。利用激光粒度儀得到微膠囊粉末的平均粒徑D以及粒徑分散系數(shù)δ。利用傅里葉變換紅外光譜儀，用KBr 壓片法對微膠囊進行官能團的測定。

1.3.3 熱穩(wěn)定性分析

取5～10 mg 干燥微膠囊粉末，利用Q600 SDT型綜合熱分析儀分析微膠囊在50～600 ℃溫度范圍內(nèi)的熱穩(wěn)定性。

1.3.4 緩釋性能分析

參照王娣等［14］、閻鑫等［15］使用恒溫熱失重法對緩釋性能進行表征。分別測定微膠囊粉末在100、125、150、175、200 ℃烘箱中加熱5h 的有效成分含量，計算累計揮發(fā)率，平行3 次，并以天然除蟲菊酯原藥作為對比；200 ℃烘箱中樣品共加熱8 h，每隔1 h 取樣稱重，計算有效成分累計揮發(fā)率，平行3次，并以天然除蟲菊酯原藥作為對比。

1.3.5 儲存穩(wěn)定性分析

測定原藥和微膠囊粉末避光儲存于4 ℃冰箱內(nèi)一段時間后的載藥率及表面形貌的變化。

1.3.6 毒性分析

委托中國科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所測試微膠囊對4 齡淡色庫蚊和白紋伊蚊幼蟲的毒力；委托上海南方農(nóng)藥研究中心測試微膠囊對3齡初期蠶豆蚜蟲和黏蟲幼蟲的毒性。

2 結(jié)果與討論

2.1 天然除蟲菊酯成分測定

利用液相色譜法對天然除蟲菊酯進行定性、定量分析，其色譜圖如圖2所示。

圖2 天然除蟲菊酯液相色譜Fig.2 Liquid chromatogram of natural pyrethrins

2.2 微膠囊制備條件優(yōu)化

利用響應(yīng)曲面法探究pH（因子A）、TEOS 投加量（因子B）、反應(yīng)溫度（因子C）3個重要因子對微膠囊制備的相互影響，以載藥率作為評價指標，并使用BBD 實驗設(shè)計方案來尋求最佳制備工藝條件，實驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2所示。

表2 響應(yīng)曲面實驗結(jié)果Tab.2 Design and results of response surface methodology

對實驗數(shù)據(jù)結(jié)果進行二次響應(yīng)回歸分析，分別擬合并建立二階響應(yīng)曲面模型。模型擬合輸出結(jié)果表示，二階模型對于本實驗表現(xiàn)為對載藥率影響顯著（p＜0.05，F(xiàn)=60.25＞20），模型擬合度較高，R2=0.966 4＞0.80，擬合所得二次方程如式（2）所示：

可知，3 個因素影響水平的大小依次為：TEOS投加量、pH 值、反應(yīng)溫度。對式（2）進行處理，得到如下相應(yīng)三維曲面和等值線圖，如圖3所示。

圖3 載藥率三維響應(yīng)曲面和等值線Fig.3 Three-dimensional response surface and contour map of drug loading efficiency

最終確定制備微膠囊最佳的工藝條件為pH 為9.02，TEOS 投加量為0.96g，反應(yīng)溫度為36.5 ℃。TEOS投加量對微膠囊載藥率的影響最為顯著（p＜0.05）。響應(yīng)值即微膠囊載藥率隨著TEOS 投加量的增加而增大，達到峰值后，隨著TEOS投加量的繼續(xù)增大，響應(yīng)值開始減小。芯材量不變的情況下，隨著TEOS 的投加量增加，被完整包覆的芯材乳液滴增多，微膠囊載藥率增大，當TEOS 過量時，聚沉在乳液滴表面的壁材增多，過剩的壁材自聚生成硅自聚體顆粒，導(dǎo)致測得載藥率下降；在堿性條件下，響應(yīng)值隨pH值的升高而增大，當pH值過大，響應(yīng)值有所減小，可能是由于溶液中OH-的增多，縮聚反應(yīng)加快，三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的硅凝膠不斷沉積在芯材乳液滴表面，硅凝膠相對于芯材過剩，導(dǎo)致芯材所占微膠囊產(chǎn)物的質(zhì)量百分比減少，載藥率減小；在低溫條件下（25～45℃），響應(yīng)值受溫度變化的影響不明顯，趨勢為隨溫度的升高先增大后減小，這可能由于溫度升高到一定值之后，水解反應(yīng)加劇，與縮聚反應(yīng)競爭增強［16］，導(dǎo)致成囊率下降，載藥率減小。

2.3 微膠囊表面形貌分析

圖4 為二氧化硅微膠囊的掃描電子顯微鏡圖。微膠囊呈球形，表面光滑。分散性較好，有少部分團聚現(xiàn)象，表面或其周圍有雜質(zhì)顆粒，這是由于氫鍵作用力較弱，縮聚速率較快，多硅酸自聚形成硅自聚體小顆粒。圖3c可以通過破碎的微膠囊觀察到清晰的“殼-核”結(jié)構(gòu)，其殼壁厚度在0.8～1.0 μm 左右。張煥芝［17］在溶膠-凝膠法制備微膠囊的過程中發(fā)現(xiàn)，隨硅基聚合物的逐步沉積，形成的二氧化硅微膠囊壁不斷加厚，與本實驗結(jié)果相似。

圖4 微膠囊掃描電子顯微鏡圖Fig.4 SEM of microcapsule

圖5 為微膠囊的粒徑分布圖，激光粒度儀測定結(jié)果顯示D10=2.5 μm，D50=29.0 μm，D90=57.1 μm，其粒徑分散系數(shù)δ=1.88＞1.2，呈多分散狀態(tài)。微膠囊的平均粒徑為29 μm。

圖5 微膠囊粒徑分布Fig.5 Particle aerodynamic diameter spectra of microcapsule

2.4 傅里葉紅外光譜分析

圖6 為微膠囊的紅外色譜分析圖，其中曲線1、2、3分別代表了天然除蟲菊酯、空白二氧化硅微膠囊和包封天然除蟲菊酯的微膠囊。對比圖線2、3，在1 111.2 cm-1和462.5 cm-1處出現(xiàn)了Si-O-Si 的對稱和不對稱振動吸收峰，964.1 cm-1處出現(xiàn)了Si-OH 的彎曲振動特征峰，在3 413.4 cm-1處的弱吸收譜帶為Si-OH的伸縮振動特征峰。根據(jù)余錫賓等［16］的研究，正硅酸四乙酯作為硅前驅(qū)體的硅凝膠中均含有Si-OH 基團。Si-OH 和Si-O-Si 特征峰的存在證明本實驗在低溫條件下完成了溶膠-凝膠過程，實現(xiàn)了以TEOS為硅前驅(qū)體的水解、縮合和聚合反應(yīng)，得到了二氧化硅壁材。對比曲線1、曲線3，在1 714.8 cm-1處的強烈吸收峰是酯類C=O伸縮振動的特征峰，來自天然除蟲菊酯的酯基官能團；在1 650.8 cm-1處的較弱吸收峰為酮基的C=O伸縮振動特征峰，來自天然除蟲菊酯醇部分的環(huán)戊烯酮；在1 151.3 cm-1處的較強吸收峰為烷烴類C-C伸縮振動特征峰，來自天然除蟲菊酯酸部分的環(huán)丙烷。圖2則無以上天然除蟲菊酯特征峰，證明微膠囊產(chǎn)品將除蟲菊酯成功包埋。

圖6 微膠囊紅外譜Fig.6 FTIR of microcapsule

2.5 熱穩(wěn)定性分析

圖7為封裝了天然除蟲菊酯的二氧化硅微膠囊的熱重分析曲線，其中圖7a是微膠囊隨溫度變化的質(zhì)量變化曲線，即TG 曲線；7b 是DTG 曲線，為TG曲線對溫度的微分。曲線1、2 和3 分別是空白微膠囊、除蟲菊酯微膠囊和天然除蟲菊酯的曲線。

圖7 微膠囊熱重曲線Fig.7 Thermogravimetric analysis of microcapsule

結(jié)合兩圖中曲線3可知，天然除蟲菊酯發(fā)生了3次明顯的質(zhì)量損失，損失速率最高峰分別在150 ℃、300 ℃、430 ℃左右，其中以300 ℃左右分解比例最高，損失量約為50%。第3 階段原藥的損失質(zhì)量約為23%，明顯小于失重第2階段。相比之下，當溫度由室溫逐漸升溫至200℃時，微膠囊樣品僅出現(xiàn)了2%～4%的質(zhì)量損失，推測為樣品中殘余的少量水分揮發(fā)所致。曲線2 的2 個主要失重階段的損失質(zhì)量約為35%和30%，相差較少。對比3條曲線分析原因，微膠囊第1 階段的質(zhì)量損失來自于囊內(nèi)天然除蟲菊酯活性成分的揮發(fā)并熱解，而此時基于TEOS 的二氧化硅殼壁并未熱解，第2 階段30%的質(zhì)量損失則來自于硅酸縮聚的結(jié)構(gòu)水失重和天然除蟲菊酯原藥的第3階段質(zhì)量損失。對比圖7b中2條曲線可知，曲線2的最大失重速率小于曲線3；400 ℃后，曲線2 的質(zhì)量損失速率大于曲線3，分析是由于硅酸縮聚的結(jié)構(gòu)水失重和天然除蟲菊酯原藥的第3階段質(zhì)量損失共同作用；曲線1相對于曲線3出現(xiàn)質(zhì)量損失的溫度有所后移。證明所制備的微膠囊的熱穩(wěn)定性有所提升，能對囊內(nèi)的天然除蟲菊酯活性成分起到一定的保護作用。

2.6 緩釋性能分析

圖8為天然除蟲菊酯和微膠囊在不同溫度下的芯材質(zhì)量揮發(fā)率曲線。在所設(shè)溫度梯度下，原藥同微膠囊都存在芯材的質(zhì)量揮發(fā)損失，相比之下，微膠囊芯材損失明顯低于原藥。從圖8b 可知，在200℃的條件下放置8 h，微膠囊芯材的質(zhì)量揮發(fā)率對比原藥減少了約38.8%。由此可知微膠囊對芯材在100至200℃的條件下可以起到較好的保護作用，具有良好的緩釋性能。

圖8 微膠囊的芯材質(zhì)量揮發(fā)曲線Fig.8 Mass volatilization curve of drug in microcapsule

2.7 儲存穩(wěn)定性分析

圖9a、9b分別為微膠囊于4℃冰箱冷藏并避光儲存的第0、5個月的掃描電子顯微鏡圖。對比圖9a的光滑表面，圖9b 中微膠囊略微粗糙，這可能與微膠囊殼壁中Si-OH的存在有關(guān)，在環(huán)境濕度的影響下，Si-OH 與空氣中的H2O 或相鄰Si-OH 形成氫鍵，導(dǎo)致微膠囊表面粗糙［17］。

圖9 微膠囊儲存不同時間的SEM對比Fig.9 SEM of microcapsule at different storage times

在不同存儲時間下，微膠囊原藥剩余率的變化情況如圖10 所示。微膠囊在4 ℃下避光儲存4 個月，載藥率為35.6%，下降了6.2%；儲存8個月，載藥率變?yōu)?9.6 %，下降了48.5 %。儲存前4 個月內(nèi)，載藥率損失速度較慢，后續(xù)則逐漸加快。推測原因為在儲存過程中，附著于微膠囊表面的天然除蟲菊酯先揮發(fā)，隨著儲存時間的延長，外部天然除蟲菊酯完全揮發(fā)到環(huán)境中，使微膠囊內(nèi)外滲透壓變大，內(nèi)部芯材釋放速率加大。所制備的二氧化硅微膠囊在4個月內(nèi)能起到較好的保護作用。

圖10 微膠囊儲存不同時間原藥剩余率變化Fig.10 Variation of residual rate of original drug in microcapsule at different storage times

2.8 毒性分析

表3是微膠囊對淡色庫蚊和白紋伊蚊幼蟲及對蠶豆蚜蟲和黏蟲的毒性測定結(jié)果。參考評價標準［18］：半數(shù)致死濃度大于100 g·ml-1為無活性，50 ～100 g·ml-1為有活性，小于50 g·ml-1為高活性。對比可知所制備的微膠囊對2種蚊蟲的幼蟲均具有高生物活性，但略低于天然除蟲菊酯原藥。這是因為此2種蚊蟲對天然除蟲菊酯原藥較為敏感，接觸后在短時間內(nèi)即可達較高的死亡率，當天然除蟲菊酯原藥被微膠囊化后，藥效具有緩釋性，致使24 h內(nèi)的急性毒性低于原藥。微膠囊對于蠶豆蚜蟲和黏蟲的殺蟲效果，推測是因微膠囊增強了芯材的持效，明顯加強了其持續(xù)性毒殺能力，較大地提高了對2 種害蟲的 殺蟲效果。

表3 4種常見昆蟲毒力測定結(jié)果Tab.3 Toxicity of four common insecticides

3 結(jié)論

采用溶膠-凝膠法制備了以TEOS 為硅前驅(qū)體的天然除蟲菊酯二氧化硅微膠囊，將響應(yīng)曲面法應(yīng)用于制備條件的優(yōu)化，結(jié)合掃描電子顯微鏡與紅外色譜等驗證了最優(yōu)制備條件下微膠囊的成功包埋，微膠囊平均粒徑為13.5 μm，載藥率最大值可達38.0 %。所得微膠囊在100～200 ℃下熱穩(wěn)定性良好，具有良好的緩釋效果，200℃下微膠囊芯材揮發(fā)率明顯優(yōu)于原藥。微膠囊在4 ℃避光條件下儲存也能有效減少芯材揮發(fā)。天然除蟲菊酯的微膠囊制劑針對蠶豆蚜蟲和黏蟲的24h毒力有明顯提升，對于2種常見的蚊蟲幼蟲也能保持高生物活性，具有實際應(yīng)用價值。TEOS 的微膠囊成本低且環(huán)境無害，但其缺點是在溶膠-凝膠過程中，水解和縮聚的反應(yīng)是可逆的，影響因素較多，反應(yīng)速率比較難控制，仍需進一步探討。

作者貢獻聲明：

徐 冉：項目規(guī)劃與管理、實驗規(guī)劃、論文審閱及修訂。

劉海容：數(shù)據(jù)分析、實驗結(jié)果可視化、初稿撰寫。

崔婧媛：方法設(shè)計、實驗探究、數(shù)據(jù)整理。