段坤坤，朵德龍，趙 妮，陳 倩，王 潔，崔雯麗，桓芝蘭，王亞峰*

1.青海大學醫(yī)學院(青海 西寧 810001) 2.青海省人民醫(yī)院藥學部(青海 西寧 810007)

顱腦疾病包括腦出血、創(chuàng)傷性顱腦損傷、顱內(nèi)占位性病變等，可通過引起神經(jīng)遞質(zhì)失衡、離子通道異常、線粒體功能障礙等多種機制誘導繼發(fā)性癲癇的發(fā)作。丙戊酸鈉(VPA)是臨床常用的一線廣譜抗癲癇藥物，對顱腦疾病患者繼發(fā)性癲癇的發(fā)作具有良好的預防效果，但VPA的治療窗較窄且患者的個體化差異較大，血藥濃度偏離50～100 μg/mL的參考范圍時，可能導致臨床療效不佳或藥物不良反應發(fā)生的風險增大。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)代謝了人體約50%的VPA，其主要亞型UGT1A6的基因多態(tài)性位點T19G可能通過改變酶蛋白的結(jié)構(gòu)，影響其表達和活性，是增大患者個體間VPA藥動學差異的重要因素[1]，本研究探討其對顱腦疾病患者VPA血藥濃度的影響，以期為臨床合理用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2021年9月-2021年10月青海省人民醫(yī)院神經(jīng)外科收治的顱腦疾病患者，Excel記錄患者的一般資料，包括患者性別、年齡、身高、體質(zhì)量、給藥劑量、血藥濃度、肝腎功能和臨床診斷等，本研究通過了青海省人民醫(yī)院倫理委員會批準(審批號：2021-91)及中國人類遺傳資源采集審批(審批號：2021-CJ2667)。納入標準：①神經(jīng)外科顱腦疾病患者，包括腦挫傷、硬膜下出血、硬膜外出血、基底節(jié)區(qū)出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血等；②使用VPA并進行了血藥濃度監(jiān)測；③VPA血藥濃度達穩(wěn)態(tài)(至少5個半衰期)；④肝腎功能正常且無其他臟器嚴重疾病；⑤否認家族遺傳病史。排除標準：①孕婦或平時持續(xù)服用抗癲癇藥物治療的癲癇患者；②發(fā)生藥物不良反應；③入院后使用可能影響VPA血藥濃度的藥物，如碳青霉烯類抗生素、苯妥英鈉、卡馬西平等；④未簽署患者知情同意書。本研究共納入顱腦疾病患者38例，男性29例，女性9例；年齡18～72歲，平均(48.47±14.74)歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)16.00～29.73 kg/m2，平均BMI(23.19±3.18)kg/m2；單位體質(zhì)量給藥劑量6.35～22.22 mg/kg，平均單位體質(zhì)量給藥劑量(12.22±2.73)mg/kg；VPA血藥濃度18.24～99.47 μg/mL，平均VPA血藥濃度(53.79±19.73)μg/mL；VPA標準化血藥濃度1.60～7.81(μg·kg)/(mL·mg)，平均VPA標準化血藥濃度(4.43±1.50)(μg·kg)/(mL·mg)。

1.2儀器與試劑ADVIA Centaur CP化學發(fā)光免疫分析儀(西門子醫(yī)學診斷股份有限公司)，H2-16KR醫(yī)用離心機(湖南可成儀器設備有限公司)，9700 PCR擴增儀(美國Applied Biosystems公司)，3730XL基因測序儀(美國Applied Biosystems公司)，NanoDrop2000超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)，血凝塊基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，VPA試劑盒(西門子醫(yī)學診斷股份有限公司)，VPA校準品(西門子醫(yī)學診斷股份有限公司)，免疫分析質(zhì)控物370(伯樂實驗有限公司)，VPA注射液(四川科瑞德制藥股份有限公司)。

1.3血藥濃度的測定及標準化患者的VPA血藥濃度達穩(wěn)態(tài)后，在次日清晨給藥前，空腹條件下用含有惰性分離膠的促凝管取靜脈血2～3 mL，3 500 r/min離心10 min，取上層血清，按照化學發(fā)光免疫分析儀的操作流程測定VPA血藥濃度。VPA標準化血藥濃度=VPA血藥濃度(μg/mL)/單位體質(zhì)量給藥劑量(mg/kg)。以消除給藥劑量、患者體質(zhì)量對VPA血藥濃度的影響，探究單位體質(zhì)量內(nèi)每毫克藥物所引起的血藥濃度變化。

1.4 DNA的提取VPA血藥濃度測定結(jié)束后，棄去上層血清，取約1 mL的血凝塊，根據(jù)血凝塊基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取DNA。NanoDrop 2000超微量分光光度計測定提取DNA的濃度和純度，OD260/OD280比值在1.7～1.9范圍內(nèi)視為純度達到實驗要求，DNA樣本于-25℃環(huán)境下保存。

1.5基因測序及分型NCBI數(shù)據(jù)庫中輸入UGT1A6 T19G位點名稱，引物設計軟件Primer Premier 5.0設計篩選各基因特異性引物見表1，引物的合成、聚合酶鏈式反應-限制性長度片段多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)進行基因測序等由北京六合華大基因生物科技有限公司完成。PCR擴增反應體系為：PCR Mix 22 μL，Primer F (10 pmol/μL)1 μL，Primer R (10 pmol/μL)1 μL，DNA 1 μL。PCR的擴增反應程序為：96℃預變性5 min，96℃變性20 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共10個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降低1℃。96℃變性20 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)。取3 μL PCR產(chǎn)物進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳實驗并于254 nm紫外燈下拍照記錄電泳圖譜，磁珠對PCR產(chǎn)物進行純化后通過基因測序儀測序，測序結(jié)束后對測序峰圖進行命名、分類，phred/phrap軟件進行多態(tài)性分析并導出分析結(jié)果。

表1 UGT1A6 T19G的PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1基因分型結(jié)果UGT1A6 T19G 基因片段PCR擴增引物的瓊脂糖凝膠電泳圖(圖1)，M泳道為Marker，從上到下依次為5 000、3 000、2 000、1 000、750、500、250、100 bp，1～4泳道為T19 G(rs6759892)的PCR擴增引物，UGT1A6 T19G不同基因型的測序峰圖見圖2。UGT1A6 T19G的基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)，納入的樣本具有較好的群體代表性。其中，野生型(TT)14例，突變雜合型(TG)22例，突變純合型(GG)2例，等位基因突變率為34.21%，見表2。

圖1 UGT1A6 T19G基因片段PCR擴增引物的瓊脂糖凝膠電泳圖

注：(a)：T19G TT基因型；(b)：T19G TG基因型； (c)：T19G GG基因型。

表2 UGT1A6 T19G的基因型頻率分布[n(%)]

2.2不同基因型患者的一般資料比較UGT1A6 T19G不同基因型患者的性別、年齡、BMI比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，UGT1A6 T19G TT基因型患者的單位體質(zhì)量給藥劑量低于TG基因型患者(P<0.05)，見表3。

表3 UGT1A6 T19G不同基因型患者的一般資料比較

2.3基因多態(tài)性對VPA血藥濃度的影響UGT1A6 T19G不同基因型患者VPA血藥濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。TT基因型患者VPA標準化血藥濃度顯著高于TG、GG基因型患者(P<0.05)，見表4。

表4 UGT1A6 T19G不同基因型患者的VPA血藥濃度

3 討論

UGT屬于微粒體糖基轉(zhuǎn)移酶家族，可將尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的葡萄糖醛酸基團轉(zhuǎn)移到其他化合物上，增加其極性，促使其通過尿液排出體外，廣泛參與了膽紅素、脂肪酸等內(nèi)源性化合物及藥物等外源性化合物的代謝。UGT1A6在VPA代謝過程中發(fā)揮著重要作用，其多態(tài)性位點T19G在我國人群中具有較高的等位基因頻率。本研究發(fā)現(xiàn)，UGT1A6 T19G等位基因突變率為34.21%，與Banawalikar等[2]報道的31.50%相近，但該研究以印度癲癇患兒為研究對象，得出的結(jié)論可能并不具有普遍性。林雪玉等[3]研究納入了107例漢族癲癇患者，發(fā)現(xiàn)UGT1A6 T19G等位基因突變率為16.8%，韓海燕等[4]研究以神經(jīng)外科顱腦手術(shù)患者為研究對象，發(fā)現(xiàn)該位點的等位基因突變率為24.54%，均低于本研究的34.21%。不同研究得出的UGT1A6 T19G等位基因突變率存在較大差異，可能與納入的患者類型及樣本量大小有關(guān)，或等位基因的分布存在顯著的種族差異和地區(qū)差異。

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)[5]，顱腦疾病患者VPA血藥濃度的影響因素主要有患者的性別、BMI、單位體質(zhì)量給藥劑量，在本研究中需排除這些因素對研究結(jié)果的干擾?；颊咭话阗Y料的分析結(jié)果表明，UGT1A6 T19G不同基因型患者的性別分布、年齡、BMI均無顯著性差異，但TG基因型患者的單位體質(zhì)量給藥劑量顯著高于TT基因型的患者，本研究采用了患者的VPA標準化血藥濃度，可在一定程度上減少患者體質(zhì)量、給藥劑量對研究結(jié)果的干擾。結(jié)果表明，UGT1A6 T19G不同基因型患者的VPA血藥濃度無顯著差異，而不同基因型患者的VPA標準化血藥濃度有顯著性差異，其中，TT患者雖具有較低的單位體質(zhì)量給藥劑量，但其VPA標準化血藥濃度顯著高于TG和GG患者。韓海燕等[4]研究納入了55例神經(jīng)外科預防性用藥VPA的患者，發(fā)現(xiàn)TT患者的VPA血藥濃度顯著高于突變基因攜帶者(TG、GG)，與本研究結(jié)論一致。說明突變基因可能增加了UGT1A6的活性，使VPA代謝加快，標準化血藥濃度降低，臨床用藥過程中應酌情增加其給藥劑量，而TT患者可能需要更低的給藥劑量。有研究得出了不同的結(jié)論，Nandith等[6]研究發(fā)現(xiàn)，UGT1A6 T19G位點不同基因型患者的VPA標準化血藥濃度無顯著性差異(P>0.05)，Xu等[7]的研究也得出了同樣的結(jié)論，但這兩項研究均以癲癇患兒為研究對象，兒童患者和成人患者的VPA代謝模式差異可能導致研究結(jié)果的不同，得出的結(jié)論也未必適用于顱腦疾病患者?；谀壳暗难芯拷Y(jié)果，顱腦疾病患者的VPA血藥濃度是由多個基因共同調(diào)控的結(jié)果，單個位點的基因多態(tài)性對VPA血藥濃度的影響可能有限，未來的研究中，可進一步探究基因組的基因多態(tài)性對VPA血藥濃度的影響，為顱腦疾病患者的個體化用藥提供理論依據(jù)。