張園園，李苗云，趙莉君，朱瑤迪，趙改名，梁 棟，馬陽(yáng)陽(yáng)，劉 純

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（）是一種革蘭氏陽(yáng)性厭氧致病菌，廣泛分布于空氣、水、土壤、食物、動(dòng)物以及人類的胃腸道中，是引發(fā)食源性疾病，導(dǎo)致人類食物中毒的主要病原菌之一。產(chǎn)氣莢膜梭菌在外界環(huán)境不利條件下（如低溫/干燥或營(yíng)養(yǎng)缺乏等）極易形成芽孢休眠體，其芽孢具有含水量低、抗逆性強(qiáng)和休眠特性等特點(diǎn)，對(duì)各種惡劣環(huán)境（包括高溫、高壓、輻射、有毒有害化學(xué)物質(zhì)、酸或堿等）具有極強(qiáng)抵抗力，在食品工業(yè)滅菌后仍可存活。當(dāng)外界存在合適的萌發(fā)因子或適合萌發(fā)的條件，芽孢會(huì)迅速萌發(fā)生長(zhǎng)，恢復(fù)繁殖，失去休眠特性和芽孢抗性，產(chǎn)生可以引起食物腐敗變質(zhì)或?qū)е率吃葱约膊〉亩舅鼗蛎?。芽孢休眠體向營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生毒性的關(guān)鍵一步，因此芽孢萌發(fā)被認(rèn)為是產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢污染的第一階段。

熱激可提高許多芽孢桿菌及其相關(guān)物種的芽孢萌發(fā)速率和萌發(fā)程度。在自然條件下，芽孢的萌發(fā)速率十分緩慢，但熱激可促進(jìn)90%以上的芽孢種群萌發(fā)。不同種屬的芽孢表現(xiàn)出不同熱激要求，對(duì)于產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢，最常用的熱激條件是75 ℃處理10～20 min。90 ℃以上熱激溫度處理的芽孢萌發(fā)效果低于60～80 ℃熱激處理。熱激對(duì)芽孢的作用過(guò)程與芽孢蛋白結(jié)構(gòu)的變化和各種芽孢分子的釋放密切相關(guān)，該過(guò)程可能涉及一些芽孢蛋白中化學(xué)鍵（例如氫鍵）的斷裂。目前關(guān)于熱激的調(diào)控機(jī)制和熱激誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化尚未得到系統(tǒng)研究。

芽孢主要具有7 層結(jié)構(gòu)，由外到內(nèi)依次是孢外壁、芽孢衣、外膜、皮層、芽孢壁、內(nèi)膜和內(nèi)核。芽孢內(nèi)膜上存在超過(guò)300 種蛋白質(zhì)，其中與芽孢萌發(fā)相關(guān)的蛋白質(zhì)基本上都位于芽孢內(nèi)膜，如萌發(fā)受體蛋白和通道蛋白等，這些蛋白質(zhì)在芽孢萌發(fā)的不同階段起到信號(hào)傳導(dǎo)、門控機(jī)制等重要作用。芽孢內(nèi)膜與營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)組成存在較大差異，主要體現(xiàn)在萌發(fā)受體蛋白GRs和吡啶-2,6-二羧酸鈣（Ca-dipicolinic acid，Ca-DPA）通道蛋白-spoVA家族蛋白，此類蛋白不存在于營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞中。Luu等研究發(fā)現(xiàn)熱激是通過(guò)直接激活芽孢桿菌GRs蛋白引起芽孢萌發(fā)；Wang Guiwen等發(fā)現(xiàn)，濕熱處理主要影響產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢的Ca-DPA釋放過(guò)程中的一些重要蛋白。有研究證明枯草芽孢桿菌中spoVA蛋白與GRs存在物理作用，該過(guò)程可能涉及芽孢萌發(fā)期間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。雖然已經(jīng)確定了芽孢萌發(fā)時(shí)的一些物理變化以及參與這一過(guò)程的蛋白質(zhì)，但關(guān)于芽孢萌發(fā)的生理途徑仍不清楚。分析熱誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)過(guò)程中芽孢內(nèi)膜蛋白理化特性的變化對(duì)于深入解析萌發(fā)蛋白作用機(jī)制具有重要意義。

因此本實(shí)驗(yàn)以產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白為研究對(duì)象，以25 ℃處理為空白對(duì)照，選擇37、75、95 ℃對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白進(jìn)行熱激處理，以研究不同溫度熱激對(duì)芽孢內(nèi)膜蛋白理化特性的影響（圖1）。旨在為進(jìn)一步揭示熱激對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白功能的影響提供了理論基礎(chǔ)，也為高效、定向控制產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢萌發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

圖1 熱激對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白理化特性的探究流程圖Fig. 1 Experimental flow chart of this study

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室從漲袋的鹽焗雞中分離出產(chǎn)氣莢膜梭菌C1，并由華大基因有限公司通過(guò)全基因組測(cè)序鑒定用于本研究。

-環(huán)絲氨酸溶液、蛋白胨 青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司；胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（tryptone sulfite cycloserine，TSC）瓊脂基礎(chǔ)、皰肉牛肉粒、產(chǎn)芽孢肉湯、液體硫乙醇酸鹽（fluid thioglycollate，F(xiàn)TG）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、二硫蘇糖醇（-dithiothreitol，DTT）、核糖核酸酶A（RNase A）、脫氧核糖核酸酶I（DNase I）、溶菌酶、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、尿素、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、蛋白上樣緩沖液、溶菌酶、Tris、彩虹Marker、1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）索萊寶生物科技有限公司；革蘭氏陽(yáng)性菌膜蛋白提取試劑盒 北京百奧萊博科技有限公司；10-壬基吖啶橙（nonyl acridine orange，NAO） 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；MgCl、HCl（均為分析純）；碘海醇挪威Axis-shield公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Allegra 64R型高速冷凍離心機(jī) 貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司；TU-1901型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HIRAYAMA-HVE50高壓滅菌器 華粵行儀器有限公司；Electrotek AW200SG厭氧工作站 英國(guó)Electrotek公司；熒光顯微鏡 日本Olympus公司；Zeta電位儀 英國(guó)Malvern公司；激光共聚焦拉曼光譜儀 日本Horiba公司；熒光光譜儀 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；ECLIPSE 80i生物顯微鏡日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢培養(yǎng)及菌懸液的制備

參考Zhu Yaodi等方法制備芽孢，從TSC平板上挑取典型的黑色菌落接種到庖肉培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。取該菌液接種到新制備的FTG中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，得到芽孢懸浮液。將芽孢7 000 r/min、4 ℃離心20 min，用0.1%無(wú)菌蛋白胨水重復(fù)洗滌芽孢懸浮液2 次，將離心洗滌的芽孢重新懸浮保存于無(wú)菌蛋白胨水中，使用生物顯微鏡進(jìn)行鏡檢，當(dāng)芽孢純度在95%以上時(shí)使用碘海醇進(jìn)行芽孢和菌體的進(jìn)一步分離純化，當(dāng)純度達(dá)到99.9%時(shí)收集芽孢，置于-20 ℃保存。

1.3.2 芽孢內(nèi)膜級(jí)分及內(nèi)膜蛋白的提取

將芽孢與配制的反應(yīng)液以1∶1比例混合（50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、8 mol/L 尿素、1% SDS、50 mmol/L DTT），37 ℃水浴90 min，13 200 r/min、4 ℃離心5 min，將沉淀用150 mmol/L NaCl溶液洗滌4 次，無(wú)菌水洗滌4 次后保留沉淀。將去除芽孢衣的芽孢以O(shè)D為50～70懸浮在TEP緩沖液中（50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、5 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF），加入1 mg溶菌酶、1 μg RNase A、1 μg DNase I和20 μg MgCl。然后將芽孢懸浮液37 ℃孵育5 min，在冰上冷卻20 min后，將芽孢懸浮液用100 mg玻璃珠短暫超聲處理，在顯微鏡下檢查裂解情況，并在微離心機(jī)中以最大速度離心5 min，并保存上清液。后續(xù)使用革蘭氏陽(yáng)性菌膜蛋白提取試劑盒進(jìn)行膜蛋白的提取。

1.3.3 熒光染色劑NAO染色

熒光染色劑NAO可標(biāo)記芽孢內(nèi)膜，通過(guò)染色程度可判斷芽孢外部各層結(jié)構(gòu)的去除情況，為確保實(shí)驗(yàn)步驟1.3.2節(jié)方法可以去除芽孢外層結(jié)構(gòu)，對(duì)處理后的芽孢進(jìn)行熒光染色。熒光染色過(guò)程如下：將芽孢液和去除芽孢各層結(jié)構(gòu)的芽孢懸浮液與熒光染色劑NAO（200 nmol/L）在室溫下避光共同孵育1 h后，10 000 r/min離心10 min，將沉淀用PBS洗滌至去掉染色劑。然后將處理后的樣品在激發(fā)波長(zhǎng)490 nm、發(fā)射波長(zhǎng)528 nm下進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。

1.3.4 SDS-PAGE分析

采用蛋白質(zhì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的分子質(zhì)量分布。選用5%的濃縮膠和12%的分離膠，蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL。向內(nèi)膜蛋白樣品中加入上樣緩沖液，沸水浴5 min。初始電壓設(shè)定為90 V，進(jìn)入分離膠時(shí)設(shè)定為120 V。電泳結(jié)束后將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色，脫色后使用凝膠成像儀掃描成像。

1.3.5 粒徑分布

利用Zeta電位儀中動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定不同溫度熱激后內(nèi)膜蛋白的粒徑分布。蛋白質(zhì)樣品用PBS稀釋至0.1 mg/mL，比色皿的光程為1 cm，測(cè)定溫度為25 ℃。利用自帶軟件分析檢測(cè)測(cè)定結(jié)果，當(dāng)測(cè)定結(jié)果顯示為良好時(shí)檢測(cè)結(jié)果方可使用。

1.3.6 紫外-可見(jiàn)光譜掃描

將芽孢內(nèi)膜蛋白樣品用PBS稀釋至0.1 mg/mL。設(shè)置紫外分光光度計(jì)掃描范圍為200～400 nm，掃描速率為100 nm/min。

1.3.7 熒光光譜掃描

用PBS調(diào)節(jié)內(nèi)膜蛋白質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍300～460 nm，狹縫均為5.0 nm進(jìn)行掃描。

1.3.8 蛋白質(zhì)表面疏水性測(cè)定

參考Chelh等方法并適當(dāng)修改。取1.2 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的芽孢內(nèi)膜蛋白溶液，加入12 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液，渦旋振蕩10 min，使樣品和溴酚藍(lán)溶液混勻，4 ℃、8 000 r/min離心15 min，用相應(yīng)的PBS作空白對(duì)照，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。表面疏水性計(jì)算公式如下：

1.3.9 拉曼光譜

參考Yu Dianyu等方法，將內(nèi)膜蛋白質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至1 mg/mL，在進(jìn)行校正后開(kāi)始光譜掃描。本研究使用拉曼分析儀在室溫下進(jìn)行，激發(fā)波長(zhǎng)為532 nm，系統(tǒng)積分時(shí)間為30 s，光譜采集范圍400～2 000 cm。每個(gè)樣品至少隨機(jī)抽取5 個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量以保證數(shù)據(jù)可靠。所有拉曼光譜均使用HORIBA公司自帶軟件進(jìn)行處理。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 次重復(fù)，采用Origin 2018軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜級(jí)分的提取鑒定及內(nèi)膜蛋白的提取

熒光染色劑NAO可以和芽孢內(nèi)膜磷脂分子結(jié)合，當(dāng)芽孢衣和皮層等外部各層結(jié)構(gòu)未被去除時(shí)，NAO染色劑無(wú)法到達(dá)芽孢內(nèi)膜，去除后可以在熒光顯微鏡下觀察到熒光，故可以通過(guò)染色效果判斷外層結(jié)構(gòu)的去除效果。如圖2所示，未經(jīng)處理的芽孢懸浮液，其染色效果較差，熒光顯微鏡視野暗淡；去除芽孢外部各層結(jié)構(gòu)后進(jìn)行染色的芽孢，其芽孢內(nèi)膜的磷脂暴露，染色效果好，熒光顯微鏡視野明亮。以上結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)所用的芽孢均已有效去除芽孢外部各層結(jié)構(gòu)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均使用去除芽孢各層結(jié)構(gòu)后的內(nèi)膜級(jí)分進(jìn)行芽孢內(nèi)膜蛋白的提取，通過(guò)蛋白質(zhì)定量分析試劑盒測(cè)定提取出的產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白質(zhì)量濃度為6 mg/mL，分子質(zhì)量范圍在35～75 kDa之間（圖3）。

圖2 產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢熒光染色觀察圖Fig. 2 Fluorescence staining observation of C. perfringens spores

圖3 產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白SDS-PAGE圖Fig. 3 SDS-PAGE patterns of C. perfringens spore inner membrane proteins

2.2 不同溫度熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的粒徑分布情況

粒徑可以表征蛋白質(zhì)的聚集程度，同時(shí)也能反映蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的變化，蛋白粒徑的變化也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的功能特性產(chǎn)生影響。不同溫度熱激處理20 min后芽孢內(nèi)膜蛋白粒徑分布如圖4所示。空白組芽孢內(nèi)膜蛋白質(zhì)粒徑主要分布在70～170 nm之間，不同溫度熱激對(duì)芽孢內(nèi)膜蛋白溶液體系的影響不同。37 ℃處理后的內(nèi)膜蛋白粒徑分布與對(duì)照組無(wú)明顯差異。在75 ℃熱激后，內(nèi)膜蛋白粒徑分布均勻穩(wěn)定，主峰位置向大粒徑方向偏移，粒徑分布在85～205 nm之間。該結(jié)果表明75 ℃熱激提高了內(nèi)膜蛋白粒徑分布均勻性。粒徑的變化主要是由蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的交聯(lián)和聚集造成，熱激增加了蛋白質(zhì)之間的碰撞和聚集速度，從而形成蛋白質(zhì)的聚集。蛋白質(zhì)的聚集可能是由于非共價(jià)相互作用，如疏水相互作用，75 ℃熱激處理后內(nèi)膜蛋白構(gòu)象發(fā)生了變化，親水基團(tuán)埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部，疏水基團(tuán)暴露并重新聚集成具有較大粒徑的蛋白質(zhì)聚合物，這與陳振家等的研究結(jié)果一致。95 ℃熱活化后，內(nèi)膜蛋白粒徑分布變寬，粒徑分布向大粒徑方向顯著偏移，蛋白質(zhì)發(fā)生明顯聚集或變性現(xiàn)象，此時(shí)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可能被破壞。

圖4 不同溫度熱激對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白粒徑分布的影響Fig. 4 Effect of heat stress at different temperatures on the particle size distribution of C. perfringens spore inner membrane proteins

2.3 不同溫度熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的紫外-可見(jiàn)光譜分析

通過(guò)蛋白質(zhì)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜強(qiáng)度測(cè)定，可以由氨基酸微環(huán)境的變化推斷蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。芽孢內(nèi)膜蛋白樣品在280 nm波長(zhǎng)附近會(huì)出現(xiàn)色氨酸與酪氨酸特征吸收峰。蛋白質(zhì)中氨基酸微環(huán)境的變化會(huì)引起蛋白質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移或者藍(lán)移，從而引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。如圖5所示，37 ℃熱激后芽孢內(nèi)膜蛋白紫外光譜相對(duì)25 ℃空白組無(wú)明顯差別。75 ℃熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白紫外光譜熒光強(qiáng)度增加，表明熱激后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部氨基酸殘基暴露，芽孢內(nèi)膜蛋白構(gòu)象發(fā)生改變。95 ℃熱激后內(nèi)膜蛋白的吸收峰降低，這可能是高溫導(dǎo)致蛋白發(fā)生自聚集反應(yīng)。

圖5 不同溫度熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的紫外光譜圖Fig. 5 UV absorption spectra of C. perfringens spore inner membrane proteins after heat stress at different temperatures

2.4 不同溫度熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的熒光光譜圖

表1 不同最大發(fā)射波長(zhǎng)處Trp殘基所在的狀態(tài)Table 1 Status of Trp residues at different maximum emission wavelengths

圖6 不同溫度熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白熒光光譜Fig. 6 Fluorescence spectra of C. perfringens spore inner membrane proteins after heat stress at different temperatures

內(nèi)源熒光光譜是推測(cè)蛋白質(zhì)分子三級(jí)結(jié)構(gòu)變化的一種重要方法，蛋白質(zhì)熒光主要取決于自身芳香族氨基酸殘基所處環(huán)境的極性，熒光基團(tuán)的猝滅和熒光發(fā)射峰位的減少是分析蛋白質(zhì)結(jié)合的有用指標(biāo)。在295 nm處只有Trp被激發(fā)，而Tyr不會(huì)被激發(fā)。參考表1，如圖6A所示，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm時(shí)，不同溫度熱激后芽孢內(nèi)膜蛋白的最大發(fā)射波長(zhǎng)（）均在310～330 nm范圍內(nèi)，表明Trp殘基位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部部分疏水環(huán)境中。75 ℃熱激引起產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，且伴隨輕微藍(lán)移，這表明75 ℃熱激可能破壞了蛋白質(zhì)分子間的疏水鍵，使內(nèi)膜蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致分子內(nèi)的Trp殘基暴露，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。在280 nm激發(fā)波長(zhǎng)下熒光強(qiáng)度是Tyr和Trp兩種氨基酸產(chǎn)生的熒光之和。75 ℃熱激活后，內(nèi)膜蛋白Tyr的熒光強(qiáng)度明顯低于空白組（圖6B），表明芽孢內(nèi)膜蛋白之間可能發(fā)生相互作用，將Tyr殘基帶到極性環(huán)境中，導(dǎo)致熒光猝滅。

2.5 不同熱激溫度對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的表面疏水性的影響

表面疏水性主要利用蛋白質(zhì)表面疏水性氨基酸與8-苯氨-1-萘磺酸探針的特異性結(jié)合進(jìn)行測(cè)定，表面疏水作用力在維持蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)及功能特性等方面起著非常重要的作用，可用于反映蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況。如圖7所示，37 ℃熱激后芽孢內(nèi)膜蛋白表面疏水性與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，75 ℃熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，表面疏水性增強(qiáng)。許英一等在研究熱處理后改性燕麥蛋白的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)，熱處理能夠增強(qiáng)蛋白質(zhì)的表面疏水性，增加有利于蛋白質(zhì)無(wú)定形或纖維狀聚集體的形成。當(dāng)95 ℃熱激處理時(shí)，芽孢內(nèi)膜蛋白表面疏水性下降（＜0.05），可能是由于95 ℃熱激后，芽孢內(nèi)膜蛋白通過(guò)疏水相互作用聚集形成蛋白質(zhì)聚集物-簇，將暴露的少量疏水性殘基重新包埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部，從而使表面疏水性下降。

圖7 不同溫度熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的表面疏水性Fig. 7 Surface hydrophobicity of C. perfringens spore inner membrane proteins after heat stress at different temperatures

2.6 不同熱激溫度對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

拉曼光譜強(qiáng)度與散射中心（化學(xué)鍵和基團(tuán)）的數(shù)量正相關(guān)，因此樣品的拉曼光譜強(qiáng)度變化可以作為確定蛋白質(zhì)的化學(xué)鍵或基團(tuán)變化程度的依據(jù)，推測(cè)分析蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的變化，以及獲取如蛋白質(zhì)主鏈、側(cè)鏈和二硫鍵的信息。圖8為不同溫度熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白在400～2 000 cm范圍內(nèi)的拉曼光譜。拉曼光譜中的酰胺I帶（1 630～1 700 cm）和酰胺III帶（1 230～1 248、1 242～1 250、1 264～1 310 cm）的特征峰決定了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，可用于研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的定量分析。酰胺I主要涉及C＝O和C—N的拉伸，酰胺III主要涉及C—N的拉伸和NH的平面躍遷。然而，由于酰胺III所涉及的信息比較復(fù)雜，通過(guò)酰胺I帶分析熱激后芽孢內(nèi)膜蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，在拉曼光譜中，蛋白質(zhì)酰胺I帶中-螺旋結(jié)構(gòu)歸屬于1 600～1 611 cm，-折疊結(jié)構(gòu)歸屬于1 614～1 625 cm，-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)歸屬于1 625～1 632 cm，無(wú)規(guī)卷曲特征振動(dòng)頻率為1 604～1 619 cm。

圖8 不同溫度熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的拉曼光譜圖Fig. 8 Raman spectra of C. perfringens spore inner membrane proteins after heat stress at different temperatures

如圖9所示，空白組中芽孢內(nèi)膜蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)為-螺旋27.43%、-折疊22.49%、-轉(zhuǎn)角15.48%和無(wú)規(guī)卷曲34.60%，其中-螺旋、-折疊和無(wú)規(guī)卷曲為主要結(jié)構(gòu)。拉曼光譜結(jié)果表明，熱激可顯著影響產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（＜0.05）。與空白組相比，37 ℃熱激后內(nèi)膜蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化。75 ℃熱激后的蛋白質(zhì)-螺旋結(jié)構(gòu)含量下降3.17%、-折疊結(jié)構(gòu)含量降低3.94%、無(wú)規(guī)卷曲比例上升8.31%。-螺旋主要靠肽鏈內(nèi)部的氫鍵維持，75 ℃熱激破壞了維持-螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的氫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)加強(qiáng)；研究表明，-折疊依賴于肽鏈之間的氫鍵，-折疊結(jié)構(gòu)含量下降表明蛋白質(zhì)的疏水位點(diǎn)的暴露，75 ℃熱激后蛋白質(zhì)肽鏈展開(kāi)，表面疏水性增加；75 ℃熱激后內(nèi)膜蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由有序狀態(tài)逐漸向無(wú)規(guī)則狀態(tài)轉(zhuǎn)化。這與許晶等的報(bào)道一致，-螺旋含量降低，無(wú)規(guī)卷曲含量升高，即二級(jí)結(jié)構(gòu)由-螺旋結(jié)構(gòu)向無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變時(shí)，分子結(jié)構(gòu)更為松散，包埋在分子內(nèi)部的疏水性殘基更多的暴露出來(lái)，導(dǎo)致表面疏水性的增加。95 ℃熱激后的蛋白中-螺旋和-折疊結(jié)構(gòu)含量增加，無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)比例降低。

圖9 不同溫度熱激對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響Fig. 9 Effect of heat stress at different temperatures on the secondary structure content of C. perfringens spore inner membrane proteins

3 結(jié) 論

不同熱激溫度（37、75、95 ℃）對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白理化特性的影響存在差異。37 ℃熱激處理對(duì)芽孢內(nèi)膜蛋白的理化特性無(wú)明顯影響。75 ℃熱激破壞了維持-螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的氫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)加強(qiáng)，氨基酸微環(huán)境改變，疏水位點(diǎn)暴露，蛋白質(zhì)的表面疏水性增加。95 ℃熱激處理導(dǎo)致芽孢內(nèi)膜蛋白結(jié)構(gòu)被破環(huán)，并發(fā)生明顯聚集或變性。綜上所述，75 ℃熱激可使產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)更為豐富，該過(guò)程可能涉及多種蛋白質(zhì)的相互作用，深入研究芽孢內(nèi)膜蛋白質(zhì)的相互作用過(guò)程對(duì)于解析芽孢萌發(fā)機(jī)制具有重要意義。該結(jié)論為揭示熱激對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響提供了一定科學(xué)依據(jù)，也為了解產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢萌發(fā)相關(guān)蛋白的作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。