唐 標(biāo)，吳 靜，王靜鴿,3，鄭 雪，吉小鳳，錢鳴蓉，楊 華*

(1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021；2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021；3. 青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

肉雞和蛋雞的養(yǎng)殖在我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)重要地位。不同品種的雞在不同地方的生長(zhǎng)環(huán)境、養(yǎng)殖規(guī)模、養(yǎng)殖設(shè)備不僅影響雞的品質(zhì)，還影響其糞便的微生物組成。蛋雞多籠養(yǎng)，活動(dòng)范圍?。蝗怆u養(yǎng)殖模式多樣，既有散養(yǎng)也有籠養(yǎng)。因此兩者的飼養(yǎng)方式以及養(yǎng)殖環(huán)境均大有不同。養(yǎng)雞行業(yè)的集約化生產(chǎn)，帶來(lái)了可觀的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)也產(chǎn)生了大量的排泄物。雞糞通常作為肥料、飼料及沼氣發(fā)酵被利用起來(lái)，但是雞糞中具有許多病原菌、寄生蟲卵、重金屬及抗生素殘留等有毒有害物質(zhì)，對(duì)人類健康和環(huán)境構(gòu)成潛在威脅。因此，在進(jìn)行養(yǎng)殖場(chǎng)糞便資源化再利用的同時(shí)，深入研究不同種類的養(yǎng)雞場(chǎng)糞便的菌群結(jié)構(gòu)具有必要性。很多學(xué)者對(duì)雞糞菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了報(bào)道，鄧雯文等用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)研究雞糞菌群變化，發(fā)現(xiàn)在門水平，各組均以厚壁菌門()、變形菌門()、擬桿菌門()3個(gè)菌門為主，對(duì)樣品中潛在病原菌菌屬進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬桿菌()、不動(dòng)桿菌()、假單胞菌()等13個(gè)菌屬在鮮雞糞中有較高的豐度。王學(xué)靜等的研究表明散養(yǎng)雞的益生菌豐度高于籠養(yǎng)雞，而籠養(yǎng)雞的致病菌豐度高于散養(yǎng)雞。造成雞腸道或糞便微生物菌群差異變化因素較多，因此，在不同地區(qū)和養(yǎng)殖環(huán)境下，引起蛋雞和肉雞糞便菌群差異性的原因還需進(jìn)一步探究。

本研究基于16S rDNA擴(kuò)增子高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)浙江省部分養(yǎng)雞場(chǎng)糞便中的微生物菌群進(jìn)行分析，研究了蛋雞與肉雞的菌群結(jié)構(gòu)的差異，結(jié)合不同養(yǎng)殖場(chǎng)的不同養(yǎng)殖方式、飼養(yǎng)環(huán)境等因素，明確了蛋雞和肉雞的微生物菌群結(jié)構(gòu)和差異性，對(duì)優(yōu)化養(yǎng)殖方式及糞便資源化利用具有重要參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

隨機(jī)選取浙江省養(yǎng)雞規(guī)模較大的5個(gè)縣市的養(yǎng)雞場(chǎng)，共采集53個(gè)樣品。在杭州市富陽(yáng)區(qū)(FY)散養(yǎng)的白羽肉雞場(chǎng)采集糞便樣品14個(gè)，在桐廬縣(TL)某散養(yǎng)肉雞仙居雞場(chǎng)采集糞便樣品14個(gè)，兩個(gè)肉雞場(chǎng)均采用散養(yǎng)模式。在杭州市余杭區(qū)(YH)某蛋雞廠采集海蘭白糞便樣品10個(gè)；在溫州市(WZ)某養(yǎng)殖廠采集京紅1號(hào)蛋雞糞便樣品8個(gè)；在臺(tái)州市天臺(tái)縣(TT)某蛋雞場(chǎng)采集海蘭褐蛋雞糞便樣品7個(gè)，另外此養(yǎng)殖廠在喂養(yǎng)時(shí)添加了殼聚多肽。三個(gè)蛋雞場(chǎng)均為籠養(yǎng)模式，樣品為養(yǎng)殖場(chǎng)的蛋雞和肉雞的新鮮糞便，取樣后干冰保存并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組總DNA提取

用糞便DNA提取試劑盒(QIAampFast DNA Stool Mini Kit)提取所采樣品的總DNA，具體提取方法參考說(shuō)明書。每個(gè)糞便樣品稱取180～220 mg提取DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA的完整性，NanoDrop 2000分光光度計(jì)用于評(píng)估所提樣品中DNA濃度與純度。

1.3 16S rDNA擴(kuò)增及Illumina Mi-Seq測(cè)序

采用引物338F 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' 和806R 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3' 對(duì)16S rDNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系(總體積為20 μL)：2.5 mmol/L dNTP 4 μL，338F和806R各1 μL，rTaq Buffer(10×)2.5 μL，rTaq 酶0.3 μL, ddHO 11.2 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于符合條件的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物采用 TruSeqTM DNA Sample Prep Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，利用Illumina Mi-Seq平臺(tái)(美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，中國(guó)上海)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.4 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

使用美吉生物云在線平臺(tái)(www.majorbio.com)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)量評(píng)估，對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾區(qū)分樣本，用Uparse 7.0.1090進(jìn)行操作分類單元 (operational taxonomic unit，OTU)聚類，用Usearch 7.0進(jìn)行OTU統(tǒng)計(jì)，OTU數(shù)量可以代表樣品物種的豐度，從而進(jìn)行高通量測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與質(zhì)量分析；利用Mothur軟件計(jì)算每個(gè)樣品的OTU數(shù)量，根據(jù)Coverage指數(shù)、Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)進(jìn)行α多樣性分析；利用Qiime 1.9.1計(jì)算門到種水平的豐度進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)分析及組間差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與質(zhì)量分析

53份樣品共產(chǎn)生3 027 200條有效序列。平均長(zhǎng)度為437 bp，由圖1A可見，測(cè)序序列數(shù)大于30000時(shí)，曲線上升緩慢，表明測(cè)序深度與數(shù)據(jù)量合理，測(cè)序數(shù)據(jù)量繼續(xù)加大，只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU。

在各分類水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的菌群，共獲得20個(gè)門，44個(gè)綱，93個(gè)目，175個(gè)科，425個(gè)屬，712個(gè)種1523個(gè)OTU。由圖1B可知，蛋雞OTU總數(shù)為1352，肉雞OTU總數(shù)為1332。蛋雞獨(dú)有的OTU數(shù)為191，肉雞獨(dú)有的OTU數(shù)為171，兩組樣品在微生物菌群組成上存在差異。

圖1 16S rDNA高通量測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量與統(tǒng)計(jì)Fig.1 16S rDNA high-throughput sequencing data quality and statistics

2.2 α多樣性分析

Coverage指數(shù)代表了樣品的覆蓋率，所有樣本的Coverage指數(shù)均大于0.99，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果可信。Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)代表菌群的豐度，TL肉雞場(chǎng)的樣品中Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)分別為612.70、609.99，均高于三個(gè)蛋雞場(chǎng)的樣品，這可能與肉雞場(chǎng)的散養(yǎng)方式有關(guān)。Simpson指數(shù)越大，多樣性越低。其中兩個(gè)蛋雞場(chǎng)WZ和TT的平均Simpson指數(shù)(0.17、0.10)均低于兩個(gè)肉雞場(chǎng)FY和TL(0.32、0.14)。Shannon指數(shù)和菌群的多樣性正相關(guān)，Shannon指數(shù)越大，說(shuō)明多樣性越高，各組樣本在OTU水平的Shannon指數(shù)如圖2A所示。

三個(gè)蛋雞場(chǎng)的平均Shannon指數(shù)(YH、WZ和TT: 3.35、3.79、3.78)均高于兩個(gè)肉雞場(chǎng)FY和TL(1.73、3.25)。如圖2B所示，蛋雞糞便的Shannon指數(shù)極顯著高于肉雞(<0.01)，說(shuō)明蛋雞糞便樣本的菌群多樣性顯著高于肉雞。

圖2 不同組樣品在OTU水平的α多樣性分析Fig.2 Analysis of α diversity of different groups at OTU level

2.3 菌群結(jié)構(gòu)分析

在門水平上，蛋雞和肉雞的糞便菌群結(jié)構(gòu)如圖3所示，厚壁菌門(36.83%)，變形菌門(29.79%)，擬桿菌門(19.80%)，梭桿菌門(Fusobacteria，8.62%)是所采樣品的優(yōu)勢(shì)菌群。其中肉雞糞便的變形菌門相對(duì)豐度高于蛋雞(肉雞FY: 71.20%，TL:25.11%，蛋雞YH: 9.60%，WZ: 10.17%，TT:7.60%)。蛋雞樣品的擬桿菌相對(duì)豐度(YH、WZ和TT: 33.21%、28.13%、31.52%)高于肉雞(FY和TL：1.69%，17.70%)。蛋雞樣品中梭桿菌門的相對(duì)豐度(YH、WZ和TT: 26.26%、5.47%和11.10%)高于肉雞樣品(FY: 0.003%，TL: 5.18%)。另外，蛋雞場(chǎng)TT雞糞樣品中的厚壁菌門平均豐度(42.26%)高于其他兩個(gè)蛋雞場(chǎng)(YH和WZ)。

圖3 蛋雞和肉雞糞便在門水平的菌群結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial communities structure of faeces of broiler and laying hen at the phylum level

屬水平的糞便菌群組成熱圖如圖4所示，所采樣品的優(yōu)勢(shì)菌群有埃希氏菌-志賀氏菌(-，12.95%)、消化鏈球菌(，12.95%)、螺桿菌(，12.95%)、擬桿菌(12.30%)、梭菌屬(，8.70%)和乳酸桿菌屬(，4.36%)。肉雞場(chǎng)(FY和TL)的埃希氏菌-志賀氏菌屬(31.21%、17.49%)和螺桿菌(31.43%、2.55%)的平均豐度均高于其他三個(gè)蛋雞場(chǎng)(0.02%、0.91%、1.50%)(1.71%、0.71%、2.02%)。

圖4 不同組樣品在屬水平的菌群組成熱圖Fig.4 Heat map of bacterial communities composition of different groups of samples at the genus level

2.4 基于門水平和屬水平的組間差異分析

為了解蛋雞和肉雞細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異，對(duì)其進(jìn)行了基于門和屬水平的組間差異顯著性檢驗(yàn)。由圖5A可知，在門水平上，變形菌門、梭菌門、互養(yǎng)菌門()和黏膠球形菌門()在蛋雞和肉雞之間的差異極顯著(<0.01)。由圖5B可知，在屬水平上，埃希氏菌-志賀氏菌、螺桿菌、Bacteroides_barnesiae在兩組樣品之間的差異極顯著(<0.01)，另外還有4個(gè)屬在兩組樣品之間差異極顯著(<0.01: Fusobacterium_mortiferum, Rikenellaceae_RC9_gut_group, unclassified_g__Bacteroide，unclassified_o__Bacteroidales)。通過(guò)偏最小二乘法判別分析可知，蛋雞和肉雞均被分為不同的區(qū)域，這表明蛋雞和肉雞的菌有顯著的差異，同一組內(nèi)的糞便樣本菌群的重復(fù)性良好(圖6)。

圖5 蛋雞與肉雞的組間差異顯著性檢驗(yàn)圓點(diǎn)對(duì)應(yīng)的數(shù)值表示物種在兩組中平均相對(duì)豐度的差值，圓點(diǎn)顏色顯示為物種豐度占比較大的分組顏色，圓點(diǎn)上的I型區(qū)間為差值的上下限值；最右邊為P值。Fig.5 Significance test of differences between broiler and laying henThe value corresponding to the dot represents the difference of the average relative abundance of species between the two groups.The color of the dot represents the grouping color with a large proportion of species abundance. The I-type interval on the dotrepresents the upper and lower limits of the difference. P value is on the far right.

圖6 在屬水平的菌群PLS-DA組間差異Fig.6 PLS-DA of bacterial communities at the genus level

3 討 論

本研究中所采樣品蛋雞和肉雞糞便優(yōu)勢(shì)菌組成類似。肉雞糞便樣品中，厚壁菌門(36.83%)、變形菌門(29.79%)、擬桿菌門(19.80%)、梭桿菌門(2.59%)依次為優(yōu)勢(shì)菌門；蛋雞在門水平上的優(yōu)勢(shì)菌豐度從高到低分別為厚壁菌門(40.01%)、擬桿菌門(30.95%)、梭桿菌門(14.28%)和變形菌門(9.13%)。與前人報(bào)道類似，張俊華等的研究發(fā)現(xiàn)寧夏某養(yǎng)殖場(chǎng)蛋雞糞便優(yōu)勢(shì)菌群主要由厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門組成；Schreuder等的研究報(bào)道蛋雞糞便中門水平的相對(duì)豐度主要是厚壁菌門(40.0±0.9)%和擬桿菌門(45.5±0.9)%。另外，朱見深等的研究發(fā)現(xiàn)蛋雞糞便菌群主要由厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門及Actinobacteria組成。

盡管主要菌群組成相似，但是相對(duì)豐度仍有差異，可能與喂料有關(guān)。本研究蛋雞樣品中梭桿菌門的豐度(14.28%)高于肉雞樣品(2.59%)，在其他研究者的研究結(jié)果中未見到類似的梭菌豐度。另外，兩個(gè)肉雞場(chǎng)樣品的擬桿菌的平均豐度(0.16%、7.90%)低于三個(gè)蛋雞場(chǎng)(16.08%、11.16%、13.74%)。擬桿菌屬參與許多重要的代謝活動(dòng)，包括碳水化合物的發(fā)酵，腸上皮細(xì)胞中關(guān)鍵糖酵解酶的誘導(dǎo)，含氮物質(zhì)的利用，膽汁酸的生物轉(zhuǎn)化和病原體增殖的預(yù)防。已有研究表明雞的飲食成份會(huì)影響腸道菌群，特別是消化道下端，喂高纖維和低脂類的飼料會(huì)增加擬桿菌門的豐度，而低纖維和高脂肪飼料則會(huì)增加雞腸道菌群中厚壁菌門的豐度。Cesare等研究發(fā)現(xiàn)，飼喂低蛋白飲食會(huì)使肉雞盲腸中大多數(shù)放線菌門的豐度增加，而厚壁菌門和變形菌門豐度降低。另外，益生元復(fù)合物經(jīng)常被作為添加劑添加到飲用水或者飼料中，以促進(jìn)畜禽腸道發(fā)育。據(jù)報(bào)道，甘露寡糖通常存在于酵母細(xì)胞壁中，可改變家禽腸道的微生物組成。Jung等證明了益生元刺激雙歧桿菌的活性并改變了肉雞的腸道菌群。本研究中，蛋雞TT養(yǎng)殖場(chǎng)在喂養(yǎng)雞的飼料中添加了殼聚多肽，結(jié)果其雞糞樣品中的厚壁菌門豐度高于本實(shí)驗(yàn)中其他兩個(gè)蛋雞場(chǎng)。這與前人的報(bào)道類似，如Shang等的研究也表明益生元相關(guān)復(fù)合物能夠增加厚壁菌門的豐度。以上研究說(shuō)明菌群差異與蛋雞和肉雞的飼料和添加劑相關(guān)。

雞糞菌群結(jié)構(gòu)及多樣性差異還可能與養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)，可變因素較多。畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)的生物氣溶膠中含有微生物，可通過(guò)空氣傳播，養(yǎng)殖場(chǎng)的衛(wèi)生條件、消毒方式、通風(fēng)情況等均會(huì)影響?zhàn)B殖場(chǎng)的氣溶膠。高敏等的研究發(fā)現(xiàn)蛋雞舍內(nèi)生物氣溶膠濃度大于肉雞，可能與消毒方式有關(guān)，蛋雞場(chǎng)消毒時(shí)一般雞在舍內(nèi)，很難消毒完全，肉雞一般在雞出欄后進(jìn)行消毒，消毒較為徹底，降低了殘留細(xì)菌的傳播風(fēng)險(xiǎn)。劉夏陽(yáng)等的研究可印證這一觀點(diǎn)，同一個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)，蛋雞感染致病菌的概率大于肉雞。此次研究中，蛋雞糞便中菌群多樣性高于肉雞，可能與此有關(guān)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)肉雞中螺桿菌具有較高豐度，而它作為一種人畜共患病微生物，與十二指腸潰瘍，胃潰瘍，胃癌相關(guān)。肉雞場(chǎng)(FY和TL)采用散養(yǎng)模式，可能會(huì)促進(jìn)螺桿菌的傳播，具有人畜共患微生物的傳播風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié) 論

此研究對(duì)浙江省部分地區(qū)蛋雞和肉雞糞便進(jìn)行了16S rDNA擴(kuò)增子高通量測(cè)序和分析，結(jié)果表明蛋雞與肉雞菌群差異較大，且蛋雞糞便中的微生物多樣性高于肉雞，可能是與蛋雞和肉雞的飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)方式等因素有關(guān)，可為科學(xué)飼養(yǎng)和糞便廢棄物利用提供思路。