董超華，于家惠，劉瑛雙，王南，曲衍杰，孫欣，柏素花，張玉剛

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/青島市園藝植物遺傳改良與育種重點實驗室；3.山東省高校植物生物技術(shù)重點實驗室，山東青島 266109)

基因編輯技術(shù)是一種能對生物基因組特定序列進(jìn)行精確修改的基因工程技術(shù)，是21世紀(jì)最重要的生物技術(shù)之一。基因編輯技術(shù)主要依賴4種核酸內(nèi)切酶，包括歸巢核酸內(nèi)切酶(meganuclease)、鋅指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR)系統(tǒng)。

歸巢核酸內(nèi)切酶能夠特異識別12～40 bp的DNA序列，造成DNA雙鏈斷裂，細(xì)胞在修復(fù)斷裂的DNA時，會在斷裂位點隨機(jī)插入或刪除核苷酸[1]。ZFNs是將限制性核酸內(nèi)切酶FokⅠ[2]切割域與鋅指模塊融合而成，通過改造鋅指模塊可靶向切割DNA序列，造成雙鏈斷裂。但該技術(shù)效率低、成本高、易脫靶。TALENs與ZFNs的形式類似，是由FokⅠ內(nèi)切酶切割域與TALEN蛋白DNA結(jié)合域融合組成。與前兩種技術(shù)相比，TALENs特異性較高[3]，但模塊組裝過程繁瑣，具有一定的細(xì)胞毒性。CRISPR/Cas系統(tǒng)由CRISPR序列元件和CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)基因家族組成，CRISPR包含一個crRNA(CRISPR RNA)、一個反式激活crRNA(tracrRNA)和Cas9蛋白。其中crRNA用于識別靶序列，tracrRNA用于促進(jìn)crRNA成熟，Cas9蛋白用于切割靶序列。為方便應(yīng)用，將tracrRNA和crRNA融合在一起形成單一引導(dǎo)RNA(sgRNA)。前三種內(nèi)切酶的共同特點是：直接與靶序列DNA結(jié)合并切割，不依賴同源識別，而CRISPR/Cas9系統(tǒng)依賴sgRNA識別靶序列，然后由Cas9進(jìn)行切割。這幾種核酸內(nèi)切酶都能造成雙鏈斷裂，斷裂后由細(xì)胞通過兩種修復(fù)途徑進(jìn)行修復(fù)：同源重組(homologous recombination,HR)和非同源端連接(nonhomologous end joining,NHEJ)[4]。在連接過程中造成隨機(jī)少量核苷酸的插入或缺失，使基因的編碼區(qū)發(fā)生移框，從而影響基因的表達(dá)導(dǎo)致功能喪失。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其簡單、精準(zhǔn)、高效的特點被廣泛應(yīng)用于動植物基因功能的挖掘及定向改良。例如基因編輯技術(shù)推動了轉(zhuǎn)基因動物的發(fā)展，基因編輯小鼠[5-6]、基因編輯猴[7]和基因編輯豬[8]成為人類疾病建模的主要工具和器官移植的潛在器官供體，對人類疾病研究有重要貢獻(xiàn)。植物上，基因編輯在調(diào)控株型[9]、增強(qiáng)抗病性[10-11]、提高產(chǎn)量[12]等方面有廣泛的研究和應(yīng)用。蘋果作為我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，基因編輯技術(shù)對其遺傳改良具有重要意義，可用于改善抗病性[13]，獲得提早開花的突變植株[14]，調(diào)控果實營養(yǎng)物質(zhì)的合成[15]等。但受限于其極低的轉(zhuǎn)化效率，蘋果的基因編輯技術(shù)進(jìn)展很慢，還遠(yuǎn)不成熟，本文以蘋果愈傷組織為試驗材料，通過改造載體、靶序列驗證，獲得編輯成功的蘋果愈傷組織，初步建立基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

試驗材料包括蘋果(Malusdomestica)‘Orin’愈傷組織和本生煙(Nicotinanabenthamiana)。‘Orin’愈傷組織在Y1培養(yǎng)基(4.4 g/L MS，0.225 mg/L 6-BA，30 g/L蔗糖，8 g/L瓊脂，1 mg/L 2,4-D,pH 5.8)上，25 ℃暗培養(yǎng)。本生煙培養(yǎng)在人工氣候箱內(nèi)，25 ℃、8 h/16 h的光暗循環(huán)。

1.1.2 試驗藥品

MS(Murashige &Skoog Medium)培養(yǎng)基，廣泛應(yīng)用于植物器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體的培養(yǎng)；6-芐氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)，細(xì)胞分裂素；2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)，具有代表性的合成植物生長素(auxin)；萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid，NAA)，促進(jìn)植物根系生長的植物生長調(diào)節(jié)劑；2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸一水(MES monohydrate，MES)，用于緩沖液；乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)，可誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因的活化，從而促進(jìn)外源基因的整合。

1.2 試驗方法

1.2.1 載體的構(gòu)建

根據(jù)CCTop-CRISPR/Cas9 target online predictor 在線(http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/)預(yù)測目標(biāo)基因的編輯靶位點。選定的靶序列與基因組序列進(jìn)行比對，以確保靶位點的連續(xù)性，排除跨越內(nèi)含子的靶點序列。本試驗對MdVPE1進(jìn)行編輯，用CCTop選定的靶點序列為5′-TCTTTTTCCCTCATCGGCAGTGG-3′和5′-CAAGTAATCCTACAGAACCATGG-3′。選用的載體是用于擬南芥的基因編輯載體pHDE-35S-Cas9-mCherry-UBQ[16]。為方便蘋果愈傷組織選擇，首先將載體原有的篩選潮霉素抗性基因HYG換成卡那霉素抗性基因Kan，并利用同源重組將gRNA和AtU6-26終止子連接到載體上。隨后，利用PCR將MdU6啟動子和基因靶位點序列進(jìn)行整合，將PCR產(chǎn)物回收后，通過同源重組插入到gRNA序列前。將構(gòu)建完成并測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105菌株，用于后續(xù)愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2.2 本生煙葉片的瞬時轉(zhuǎn)化

將農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)至OD600=0.8，倒入50 mL離心管中，5 500 r/min 離心10 min，棄上清液，將沉淀用同體積的侵染液重懸(10 mmol/L MgCl2·6H2O、10 mmol/L MES、0.1 mmol/L AS，pH 5.8)。選取生長狀態(tài)良好的4～6周本生煙草葉片，用1 mL 注射器吸取重懸后的菌液，在煙草葉片背面用壓力滲入法將農(nóng)桿菌注入葉片中。

1.2.3 愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化

取轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌菌液100 μL加入到含有相應(yīng)抗生素的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃，200 r/min搖床中培養(yǎng)農(nóng)桿菌至OD600=0.8。將新鮮的菌液轉(zhuǎn)入50 mL離心管，5 500 r/min離心10 min，收集菌體；用等體積愈傷組織侵染液RM(4.4 g/L MS、30 g/L蔗糖、100 μmol/L AS)重懸，28 ℃振蕩培養(yǎng)30 min；在超凈工作臺中用高溫滅菌后的鑷子挑取20 d的愈傷組織移至重懸后的菌液中，并將較大塊的愈傷組織搗碎，侵染15 min；將侵染后的愈傷組織用無菌紗布過濾，并用濾紙吸干菌液；將愈傷組織均勻鋪到共培養(yǎng)基Y1上，黑暗中25 ℃共培養(yǎng)2～3 d。

共培養(yǎng)后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有100 mg/L的Kan抗生素的篩選培養(yǎng)基Y2(4.4 g/L MS、0.225 mg/L 6-BA、30 g/L蔗糖、8 g/L瓊脂、1 mg/L萘乙酸,pH 5.8，滅菌后加入100 mg/L Kan)上，25 ℃暗培養(yǎng)，直至長出陽性愈傷組織。轉(zhuǎn)移陽性愈傷組織至新鮮Y2培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，并提取DNA，進(jìn)行鑒定。

1.2.4 基因編輯結(jié)果的鑒定

根據(jù)靶位點前后各300 bp左右的基因組DNA序列設(shè)計特異性引物，提取陽性愈傷組織DNA，并以其為模板用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上。挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR篩選后，測序，根據(jù)測序結(jié)果確定靶位點是否編輯成功,如發(fā)現(xiàn)靶序列發(fā)生改變，則用二代測序技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增子測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 MdU6啟動子的克隆

以擬南芥U6-26基因為電子探針，用一套在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫或DNA數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比較的分析工具 (basic local alignment search tool,BLAST)在蘋果基因組數(shù)據(jù)庫中分析其同源序列，獲得其同源基因序列(命名為MdU6)。根據(jù)基因編碼區(qū)上游1 kb 基因組 DNA序列設(shè)計引物，以蘋果基因組DNA為模板擴(kuò)增獲得其編碼區(qū)上游序列。將獲得的序列與擬南芥U6-26啟動子序列進(jìn)行比對，確定蘋果MdU6基因啟動子(圖1)，注冊序列號為MT584802。

圖1 蘋果MdU6啟動子和擬南芥U6-26啟動子序列比對Fig.1 Sequence alignment between apple U6 promoter and Arabidopsis U6-26 promoter注：黑色背景表示一致的核苷酸，灰色背景表示相似的核苷酸。

2.2 靶序列的驗證

為驗證目標(biāo)基因靶序列的有效性，將目標(biāo)基因的靶點序列及間隔序列毗鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)整合到綠色螢光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的5′端構(gòu)建植物表達(dá)載體，與基因編輯載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，然后將含有兩種載體的農(nóng)桿菌注射到本生煙葉片中，使它們在煙草葉片中共表達(dá)，并進(jìn)行基因編輯。同時，對上述整合到GFP基因上的PAM位點進(jìn)行點突變以破壞PAM位點，并以新的載體與基因編輯載體共表達(dá)作為對照，比較對照和編輯部位熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，MdVPE1編輯載體與PAM位點突變的GFP融合表達(dá)載體的農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)煙草后的熒光強(qiáng)度明顯高于MdVPE1編輯載體與GFP融合表達(dá)載體的農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)煙草后的熒光強(qiáng)度，而單一MdVPE1編輯載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)煙草后，無熒光產(chǎn)生(圖2)。

圖2 基因編輯靶點序列有效性的快速驗證Fig.2 Rapid verification of the effectiveness of gene editing target sequences注：圖中所示為本生煙葉片注射農(nóng)桿菌后2 d觀察的GFP熒光；紅色虛線所示為注射區(qū)域，圖中文字說明響應(yīng)區(qū)域所注射農(nóng)桿菌中包含的載體。

2.3 CRISPR載體的構(gòu)建及愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化

為探索基因編輯在蘋果愈傷組織中的有效性，將蘋果液泡加工酶基因(MdVPE1)作為目標(biāo)基因構(gòu)建基因編輯載體。液泡加工酶是植物體內(nèi)參與植物抗病性的一種蛋白酶，該酶突變會使植物抗性發(fā)生改變。利用在線軟件CCTop選擇靠近基因編碼區(qū)5′端的靶位點，并與蘋果基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，保證其特異性?；蚓庉嬢d體框架采用pHDE-35S-Cas9-mCherry-UBQ質(zhì)粒。采用卡那霉素抗性基因作為報告基因。為提高轉(zhuǎn)錄效率，以蘋果自身的MdU6啟動子啟動gRNA的轉(zhuǎn)錄，采用擬南芥U6-26終止子。按蘋果的密碼子偏好優(yōu)化了Cas9蛋白的編碼序列(圖3)。

圖3 蘋果MdVPE1基因編輯載體的T-DNA區(qū)域組成Fig.3 Composition of T-DNA region of apple MdVPE1 gene editing vector

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將上述構(gòu)建完成的基因編輯載體轉(zhuǎn)化‘Orin’愈傷組織，以驗證基因功能。侵染后，在Y1培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3 d，移至含有Kan抗生素的培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，待長出新的愈傷凸起，移至繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)繼代培養(yǎng)(圖4)。

a.愈傷組織在篩選培養(yǎng)基上共培養(yǎng)；b.愈傷組織在篩選培養(yǎng)基上長出凸起的抗性愈傷組織。圖4 愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化Fig.4 Genetic transformation of apple callus

2.4 蘋果MdVPE1基因編輯結(jié)果鑒定

將測序結(jié)果與原基因序列比對后發(fā)現(xiàn)，靶位點1和靶位點2均存在多種突變類型的混合突變體。其中，靶位點1分別出現(xiàn)了8個堿基的缺失、13個堿基的缺失。靶位點2分別出現(xiàn)了8個堿基的缺失、4個堿基的替換和5個堿基的插入。這些突變使蛋白質(zhì)編碼區(qū)(sequence coding for amino acids in protein,CDS)序列編碼紊亂，導(dǎo)致MdVPE1基因的敲除及功能喪失(圖5)。

a.MdVPE1靶位點位置示意圖；b.MdVPE1基因突變測序結(jié)果示意圖(紅色代表PAM位點，藍(lán)色代表突變位點，綠色代表插入位點)；c.MdVPE1基因突變測序結(jié)果峰圖。圖5 蘋果愈傷組織MdVPE1基因編輯后的2個編輯位點基因組測序結(jié)果出現(xiàn)6種突變Fig.5 Six mutations in genome sequencing results of 2 editing sites after MdVPE1 gene editing in apple callus

2.5 MdVPE1基因編輯愈傷組織對輪紋病菌的抗性分析

為了進(jìn)一步確定MdVPE1基因編輯后是否影響蘋果愈傷組織的抗病性，對基因編輯發(fā)生突變的愈傷組織(knock out,KO)、轉(zhuǎn)化空的CRISPR載體作為對照愈傷組織(empty vector,EV)和野生型愈傷組織(wild type,WT)分別接種病原菌進(jìn)行鑒定。用繼代3周的KO、EV和WT愈傷組織進(jìn)行接種試驗，這3種愈傷組織沒有明顯的表觀差異。在KO、EV和WT愈傷組織上分別接種輪紋病病原菌(B.dothidea)。以菌絲延伸區(qū)域直徑作為評估愈傷組織抗性的指標(biāo)，接種5 d后，真菌侵染區(qū)域在KO和EV之間或KO和WT之間表現(xiàn)出極顯著差異(p<0.01，圖6)。與EV和WT愈傷組織相比，KO愈傷組織的菌絲顯著減少，延伸速度較慢，表明基因編輯導(dǎo)致愈傷組織對B.dothidea的抗性發(fā)生改變。

a.病原菌在不同的愈傷組織中表現(xiàn)不同的生長速度；b.病原菌的延伸區(qū)域直徑在基因編輯愈傷組織中顯著小于野生型和空載體對照，** 代表在p<0.01的水平上差異極顯著。圖6 MdVPE1 基因編輯導(dǎo)致愈傷組織抗病性發(fā)生改變Fig.6 Changes in callus disease resistance caused by MdVPE1 gene editing

3 討論與小結(jié)

目前，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已在擬南芥、番茄、本生煙等模式植物中應(yīng)用廣泛。與傳統(tǒng)的物理突變不同，利用該技術(shù)可以對靶基因的特定位點進(jìn)行編輯，實現(xiàn)精準(zhǔn)的基因突變。通過本生煙草瞬時表達(dá)進(jìn)行靶序列驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MdVPE1編輯載體與PAM位點突變的GFP融合表達(dá)載體的農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)煙草后的熒光強(qiáng)度明顯高于MdVPE1編輯載體與GFP融合表達(dá)載體的農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)煙草后的熒光強(qiáng)度，而單獨(dú)的MdVPE1編輯載體的農(nóng)桿菌瞬轉(zhuǎn)煙草后無熒光。這表明PAM位點突變后，編輯載體無法識別NGG結(jié)構(gòu)，未能對靶位點進(jìn)行基因編輯，從而無法影響靶位點下游的GFP的表達(dá)；而當(dāng)PAM位點未發(fā)生突變時，編輯成功，使CDS 序列編碼紊亂，導(dǎo)致基因發(fā)生突變，影響GFP的正常表達(dá)，表現(xiàn)出熒光強(qiáng)度的大幅度減弱。利用這一方法可以快速篩選高效的靶序列。

本文利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功編輯蘋果愈傷組織中MdVPE1基因。對獲得的陽性愈傷組織進(jìn)行DNA測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)愈傷組織中MdVPE1基因的CDS序列在靶位點均出現(xiàn)堿基突變。且同一愈傷組織中出現(xiàn)不同類型的堿基突變，這表明我們所獲得的陽性愈傷組織不是單細(xì)胞的克隆，或者這些細(xì)胞中的編輯行為不是一次性完成的。統(tǒng)計分析突變類型發(fā)現(xiàn)，主要包括非3整數(shù)倍數(shù)的多個堿基的缺失、不同數(shù)目堿基的插入及替換。這些突變使基因CDS序列中斷，最終導(dǎo)致愈傷組織中MdVPE1基因的敲除及功能喪失，表明成功實現(xiàn)基因編輯。分析MdVPE1基因編輯愈傷組織對輪紋病菌的抗性發(fā)現(xiàn)，接種5 d后，與EV和WT愈傷組織相比，KO愈傷組織的菌絲顯著減少，表明基因編輯導(dǎo)致愈傷組織對B.dothidea的抗性發(fā)生改變。

本文利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)成功敲除蘋果愈傷組織中MdVPE1基因，建立了基于 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)，為研究蘋果基因功能奠定了重要基礎(chǔ)。