曾婷婷，謝芝勛*，華俊，謝麗基*，李孟，黃嬌玲，張民秀，張艷芳，苑亞?wèn)|，撒薇

（1廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001；2廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病學(xué)研究所，廣西南寧530004）

0 引言

【研究意義】禽1型副黏病毒（1，APMV-1）又稱(chēng)新城疫病毒（Newcastle disease Viruses，NDV），在世界范圍內(nèi)能感染家禽或鳥(niǎo)類(lèi)250多種（Amarasinghe et al.，2018），尤其是強(qiáng)毒株感染家禽特別是雞和火雞后表現(xiàn)為羽毛蓬松、腹瀉、食欲廢絕、癱瘓甚至死亡，死亡率高達(dá)100%。目前，由于NDV疫苗的推廣應(yīng)用，在雞、鴨、鵝等家禽上已鮮有新城疫（Newcastle disease，ND）暴發(fā)，但鴿子ND暴發(fā)時(shí)有報(bào)道，且NDV宿主廣泛、可在不同宿主間互相傳播，全球范圍內(nèi)不斷出現(xiàn)NDV新基因型毒株（Dimitrov et al.，2019）。因此，仍需密切監(jiān)測(cè)NDV的流行分布情況，為科學(xué)防控ND疫情提供參考依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】根據(jù)基因組長(zhǎng)度，NDV可劃分為兩大分支：Class I和Class II（Czeglédi et al.，2006）。其中，Class I基因組長(zhǎng)度為15198 nt，Class II則包含2種長(zhǎng)度，分別是15186和15192 nt。每個(gè)分支又細(xì)分為若干基因型。根據(jù)Diel等在2012年提出的分類(lèi)系統(tǒng)中，宜利用F基因全長(zhǎng)編碼序列描繪系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，至2019年NDV基因分型系統(tǒng)得到進(jìn)一步優(yōu)化。Class I NDV包含1個(gè)基因型，下分3個(gè)基因亞型：1.1.1、1.1.2和1.2；Class II NDV包含I～XXI共21個(gè)基因型（Dimitrov et al.，2019）。不同基因型NDV具有一定的地域分布特征（Dimitrov et al.，2016），我國(guó)境內(nèi)的流行毒株是以感染雞、鴨、鵝等家禽為主的基因VII型（Liu et al.，2003；Qin et al.，2008）和感染鴿子為主的基因VI型（Guo et al.，2013；Xue et al.，2017）。由于家禽生產(chǎn)中廣泛使用疫苗，近十年來(lái)已很少出現(xiàn)基因VII型病例，但鴿子感染基因VI型NDV病例的報(bào)道較多（Wei et al.，2018；He et al.，2020）。class II基因XII型NDV于2004年首次在南美洲發(fā)現(xiàn)（Chumbe et al.，2017），隨后2008年在越南被分離鑒定（Xuyen et al.，2018），2010年在我國(guó)廣東和福建活禽市場(chǎng)監(jiān)測(cè)中也分離到基因XII型NDV（劉華雷等，2017）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】2018年本課題組在廣西分離鑒定出2株鵝源基因XII型NDV（曾婷婷等，2020），但其生物學(xué)特性，以及與其他省份分離株的親緣關(guān)系均有待進(jìn)一步探究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)對(duì)2株分離株進(jìn)行致病性試驗(yàn)、全基因組測(cè)序，并分析主要毒力基因的氨基酸差異位點(diǎn)及遺傳進(jìn)化關(guān)系，以期為NDV流行分布的系統(tǒng)監(jiān)測(cè)和ND的科學(xué)防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年通過(guò)SPF雞胚從廣西活禽市場(chǎng)銷(xiāo)售鵝的咽/泄殖腔拭子中分離獲得2株基因XII型NDV（曾婷婷等，2020），分別命名為Goose/China/GX02/2018和Goose/China/GX17/2018。SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行孵化至9～11日齡。核酸抽提試劑盒EasyPureViral DNA/RNA Kit、膠回收試劑盒EasyPureQuick Gel Extraction Kit及載體連接試劑盒pEASY-Blunt Cloning Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；雙鏈cDNA合成試劑盒Prime-ScriptDouble Strand cDNA Synthesis Kit、高保真RT-PCR試劑盒PrimeScriptII High Fidelity One Step RT-PCR Kit及末端序列擴(kuò)增試劑盒SMARTer RACE 5'/3'Kit購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。

1.2 病毒純化

根據(jù)趙明等（2014）的方法，連續(xù)進(jìn)行4個(gè)代次的病毒噬斑純化。當(dāng)DF-1細(xì)胞鋪滿(mǎn)6孔細(xì)胞板95%底部時(shí)，以PBS清洗2次。以無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基對(duì)原代病毒液進(jìn)行10倍梯度稀釋至原濃度的10倍，每個(gè)濃度分別接種至6孔細(xì)胞板中，置于37℃、5% CO培養(yǎng)箱孵育2 h。孵育完成后吸凈病毒液并以PBS清洗2次，然后覆蓋含1%胎牛血清及1%低熔點(diǎn)瓊脂的DMEM/F12培養(yǎng)基（2 mL/孔）。待瓊脂完全凝固，置于37℃、5% CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，再覆蓋含0.02%中性紅、1%胎牛血清及1%低熔點(diǎn)瓊脂的DMEM/F12培養(yǎng)基（2 mL/孔），12～24 h后觀察挑斑。挑取輪廓清晰，與其他噬斑距離較遠(yuǎn)，且大小與大多數(shù)噬斑相似的噬斑2個(gè)，置于無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基中漩渦振蕩1 min并凍融2次后作為下一代噬斑純化的母液。連續(xù)純化4個(gè)代次后，接種SPF雞胚增殖病毒，收獲尿囊液備用，并參照廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立的檢測(cè)方法排除其他禽副黏病毒（謝志勤等，2017）。

1.3 致病性試驗(yàn)

根據(jù)GB/T 16550—2008《新城疫診斷技術(shù)》的步驟進(jìn)行致死雞胚平均死亡時(shí)間（MDT）和腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）試驗(yàn)，測(cè)定2株分離株的致病性。

1.3.1 MDT操作步驟使用無(wú)菌生理鹽水將新鮮尿囊液稀釋為10～10，每個(gè)稀釋度取0.1 mL，經(jīng)尿囊腔途徑接種5枚9日齡的SPF雞胚，8 h后以同樣的尿囊液再接種1次，所有接種雞胚置于37℃下繼續(xù)孵化培養(yǎng)。雞胚連續(xù)觀察7 d，每天觀察2次，記錄雞胚死亡時(shí)間和死亡數(shù)量。

式中，、為或小時(shí)死亡的SPF雞胚數(shù)（枚），、為雞胚死亡時(shí)間（h），為SPF雞胚死亡總數(shù)（枚）。

1.3.2 ICPI操作步驟HA≥4 log2的新鮮尿囊液以無(wú)菌生理鹽水稀釋10倍，出殼24～40 h的雛雞均經(jīng)腦內(nèi)途徑接種0.5 mL稀釋后的尿囊液。接種后連續(xù)觀察8 d，每天1次，并計(jì)分：正常計(jì)0分，病雞計(jì)1分，死亡計(jì)2分（雛雞死亡后每天仍計(jì)2分）。

式中，∑s為8 d累計(jì)發(fā)病數(shù)（羽），∑d為8 d累計(jì)死亡數(shù)（羽），為8 d累計(jì)觀察雛雞總數(shù)（羽）。

1.4 全基因組測(cè)序及分析

根據(jù)核酸抽提試劑盒說(shuō)明分別抽提2株分離株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA后送至澤塔生物科技（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。由于NDV為單股負(fù)鏈RNA病毒，二代測(cè)序無(wú)法直接獲得病毒基因組5'端和3'端50～100 nt序列，因此分別使用5'端引物（5'-TTCTGTTTCCCTGCAAGGG-3'）和3'端引物（5'-GTGCTCAACAAAAATTCTAC-3'）配合末端序列擴(kuò)增試劑盒提供的通用引物，以2株分離株RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段克隆后送至深圳華大基因股份有限公司測(cè)序。

1.5 主要抗原蛋白氨基酸序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析

使用DNASTAR比對(duì)2株分離株與南美分離株（基因XIIa亞型）、越南分離株（基因XIId亞型）及我國(guó)廣東分離株（基因XIIb亞型）（表1）的主要抗原蛋白（F蛋白和HN蛋白）氨基酸序列，計(jì)算F基因核苷酸序列相似性，并使用MEGA X的最大似然法（Maximum likelihood method），基于F基因核苷酸序列相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（Kumar et al.，2018），設(shè)1000次自展（Bootstrap）驗(yàn)證。同時(shí)，以MEGA X的Maximum Composite Likelihood計(jì)算各毒株間的遺傳距離，并通過(guò)Gamma Distribution計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的變異率（Diel et al.，2012）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒純化及致病性

經(jīng)過(guò)DF-1細(xì)胞4個(gè)代次的噬斑純化，分別獲得2株分離株（Goose/China/GX02/2018和Goose/China/GX17/2018）的純化株。純化株接種SPF雞胚收獲的尿囊液-30℃保存，作為后續(xù)試驗(yàn)的母液。致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，2株分離株的MDT分別為54和48 h，ICPI分別為1.65和1.65，表明這2株NDV均為強(qiáng)毒株。

2.2 全基因序列測(cè)定結(jié)果及基因組基本結(jié)構(gòu)

使用DNASTAR將測(cè)序獲得的序列與RT-PCR擴(kuò)增的5'端和3'端序列拼接成完整的NDV全基因組，然后上傳至GenBank，獲得序列號(hào)分別為MZ306224和MZ306223。2株分離株的基因組長(zhǎng)度均為15192 nt，與我國(guó)廣東分離的基因XII型NDV基因組結(jié)構(gòu)（王靜靜等，2018）一致，基因組3'端引導(dǎo)序列為55 nt，5'端尾隨序列為114 nt，NP基因-P基因、P基因-M基因、M基因-F基因、F基因-HN基因、HN基因-L基因的間隔區(qū)分別為1、1、1、31和47 nt（圖1）。

2.3 F基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

截取2株分離株的F基因全長(zhǎng)序列，使用DNASTAR計(jì)算其核苷酸序列相似性。結(jié)果顯示，2株分離株的F基因核苷酸序列相似性為99.9%，與我國(guó)廣東分離株的相似性為97.9%～99.3%，與南美分離株的相似性為90.9%～92.1%，與越南分離株的相似性為91.3%～92.8%。根據(jù)MEGA X計(jì)算F基因遺傳距離及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，2株分離株與我國(guó)廣東分離株處于同一分支上，遺傳距離介于0.0174～0.0220；與南美分離株（XIIa亞型）的遺傳距離介于0.0911～0.1150，與越南分離株（XIId亞型）的遺傳距離介于0.0801～0.0834。我國(guó)分離株與南美分離株的平均遺傳距離為0.0909，與越南分離株的平均遺傳距離為0.0691。根據(jù)Dimitrov等（2019）更新的NDV分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)：平均遺傳距離介于0.05～0.10，劃為1個(gè)基因亞型，大于0.10劃為1個(gè)基因型。即2株分離株（Goose/China/GX02/2018和Goose/China/GX17/2018）均屬于基因XIIb亞型，與我國(guó)廣東分離株屬于同一基因亞型。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖2）還顯示，我國(guó)2010年的分離株、2011年的分離株及2017年后的分離株分別形成3個(gè)小分支，南美分離株也具有類(lèi)似情況，2004—2006年分離株、2008—2009年分離株及2011年后的分離株分別形成3個(gè)小分支，提示基因XII型NDV一直處于不斷進(jìn)化中。

2.4 F蛋白氨基酸序列分析結(jié)果

測(cè)序結(jié)果顯示，2株分離株的F基因全長(zhǎng)1662 nt，F(xiàn)蛋白包含553個(gè)氨基酸殘基，F(xiàn)蛋白裂解位點(diǎn)均為RRQKRF。與其他基因XII型NDV相比，在F蛋白的信號(hào)肽區(qū)域、融合肽區(qū)域、七肽重復(fù)區(qū)和跨膜區(qū)共有14個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)（表2）。信號(hào)肽區(qū)域有5個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)，其中3個(gè)為2017年后我國(guó)分離株特有的氨基酸差異（I→L、I→V和C→H），1個(gè)是我國(guó)分離株特有的氨基酸差異（L→E）；融合肽區(qū)域有2個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)，其中1個(gè)是2017年后我國(guó)分離株特有的氨基酸差異（I→V）；七肽重復(fù)區(qū)有6個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)，其中3個(gè)是我國(guó)分離株特有的氨基酸差異（D→N、V→A和T→I），1個(gè)是2株廣西分離株特有的氨基酸差異（N→S）?？梢?jiàn)，氨基酸位點(diǎn)差異與時(shí)間推移有關(guān)，也提示基因XII型NDV一直處于不斷進(jìn)化中，與遺傳進(jìn)化分析結(jié)果一致。

2.5 HN蛋白氨基酸序列分析結(jié)果

測(cè)序結(jié)果顯示，2株分離株的HN基因全長(zhǎng)1716 nt，HN蛋白包含571個(gè)氨基酸殘基。由于已報(bào)道基因XII型NDV只有4株毒株（我國(guó)廣東分離株2株，南美分離株2株）上傳了HN基因序列，因此以這4株分離株的HN蛋白氨基酸序列為參考序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，2株分離株的HN蛋白存在5個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)（aa119、aa341、aa433、aa481和aa508），缺失aa538 N-糖基化位點(diǎn)，與我國(guó)廣東分離株一致。10個(gè)唾液酸受體結(jié)合位點(diǎn)與4株參考毒株均無(wú)差異。在2株南美分離株中，分離株NDV/peacock/Peru/2011同時(shí)缺少aa508和aa538 N-糖基化位點(diǎn)，分離株Chicken/Peru/1918-03/603/2008缺少aa508 N-糖基化位點(diǎn)。2株分離株的HN蛋白跨膜區(qū)及抗原中和區(qū)氨基酸序列與我國(guó)廣東分離株均一致（表3），其中蛋白跨膜區(qū)的aa27、aa28、aa34、aa41和aa42及 抗原中和區(qū) 的aa263和aa347與南美分離株存在7個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)（V→I、A→S、V→I、A→T、V→A、K→R和E→D），這些氨基酸差異可能導(dǎo)致NDV的抗原性差異。

3 討論

Class II基因XII型NDV于2004年首次在南美洲被分離獲得（Chumbe et al.，2017），隨后在越南和我國(guó)相繼有報(bào)道（劉華雷等，2017；Xuyen et al.，2018）。我國(guó)分離株此前集中在廣東，本研究中的2株分離株（Goose/China/GX02/2018和Goose/China/GX17/2018）是廣西首次分離獲得的鵝源基因XII型NDV。盡管致病性試驗(yàn)結(jié)果和F蛋白裂解位點(diǎn)氨基酸測(cè)序結(jié)果均顯示這2株分離為強(qiáng)毒株，但其宿主鵝并未表現(xiàn)出任何臨床癥狀。我國(guó)其他的基因XII型NDV分離株也均分離自肉眼觀測(cè)健康的活禽，Xiang等（2020）還研究證實(shí)鵝源分離株MK616244可從鵝跨物種水平傳播給雞，人工感染非免疫鵝并未表現(xiàn)任何癥狀，感染非免疫雞則表現(xiàn)出輕微精神沉郁、扭頭癱瘓等神經(jīng)癥狀，但不致死，且癥狀隨時(shí)間推移會(huì)逐漸減輕耐過(guò)。南美分離株（XIIa亞型）和越南分離株（XIId亞型）均對(duì)雞群表現(xiàn)出強(qiáng)毒致病性（Chumbe et al.，2017；Xuyen et al.，2018），南美分離株大部分分離自免疫后的雞群，肉雞感染死亡率為4.0%～12.0%，且表現(xiàn)出呼吸困難等臨床癥狀，蛋雞表現(xiàn)為輕微呼吸困難，產(chǎn)蛋量下降，感染死亡率為1.8%（Chumbe et al.，2017）；越南分離株也分離自免疫后的雞群，表現(xiàn)為精神沉郁、腺胃乳頭出血等（Xuyen et al.，2018）?？梢?jiàn)，在自然感染狀態(tài)下我國(guó)分離株對(duì)雞群的致病力遠(yuǎn)低于南美分離株和越南分離株。

NDV的毒力和抗原蛋白主要為F蛋白和HN蛋白。本研究通過(guò)比對(duì)分析GenBank已公布基因XII型NDV的F蛋白和HN蛋白氨基酸序列，結(jié)果在這些蛋白的主要功能域發(fā)現(xiàn)我國(guó)分離株相對(duì)于其他國(guó)家分離株存在一些獨(dú)特的氨基酸差異：F蛋白的信號(hào)肽區(qū)域（L→E/M→E），七肽重復(fù)區(qū)的HR1（D→N），七肽重復(fù)區(qū)的HR3（V→A/T→A），七肽重復(fù)區(qū)的HR2（T→I）；HN蛋白的跨膜區(qū)（V→I、S→A、V→I、A→T和V→A），抗原中和區(qū)（K→R和E→D）。前人研究結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)蛋白的主要功能域與其裂解后形成的F1蛋白膜融合活性相關(guān)，信號(hào)肽區(qū)域、七肽重復(fù)區(qū)的HR1和HR2及跨膜區(qū)的氨基酸位點(diǎn)突變均可導(dǎo)致膜融合活性下降，從而降低NDV的感染力和致病力（Sergel-Germano et al.，1994；Reitter et al.，1995；McGinnes et al.，2001；Gravel et al.，2011）。因此，我國(guó)分離株（XIIb亞型）與南美分離株（XIIa亞型）、越南分離株（XIId亞型）對(duì)雞群自然致病力的區(qū)別是否與這些位點(diǎn)的氨基酸差異有關(guān)，亟待應(yīng)用反向遺傳學(xué)進(jìn)一步探究。此外，我國(guó)分離株HN蛋白aa347的改變（E→D）值得關(guān)注，該位點(diǎn)的氨基酸突變（E→K）已被證實(shí)會(huì)造成NDV抗原的顯著差異（Hu et al.，2010），因此E→D是否導(dǎo)致基因XII型NDV與現(xiàn)有疫苗株間的抗原顯著差異，以及是否會(huì)降低現(xiàn)有疫苗保護(hù)率將是今后的研究熱點(diǎn)。

基于F基因核苷酸序列相似性構(gòu)建的基因XII型NDV系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)可知，2株分離株（Goose/China/GX02/2018和Goose/China/GX17/2018）與我國(guó)廣東分離株Goose/CH/GD/E115/2017處于同一小分支上，且這一小分支與其他小分支的遺傳距離較遠(yuǎn)；F蛋白氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，有3個(gè)氨基酸位點(diǎn)差異（I→L、C→H和I→V）是這3株分離株所特有，有2個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)（I→V和N→S）是廣西分離株所特有。說(shuō)明盡管2011年后一段時(shí)間內(nèi)未分離獲得基因XII型NDV毒株，但該病毒并非一過(guò)性感染，而是潛伏在某些宿主身上并一直持續(xù)進(jìn)化。因此，加強(qiáng)對(duì)不同宿主攜帶NDV的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)對(duì)分析病毒演化及防控NDV感染家禽至關(guān)重要。

4 結(jié)論

我國(guó)分離株（XIIb亞型）與南美分離株（XIIa亞型）和越南分離株（XIId亞型）在F蛋白和HN蛋白的氨基酸差異可能與其對(duì)雞群的致病力差異有關(guān)。此外，基因XII型NDV一直處于不斷進(jìn)化中，而需持續(xù)監(jiān)測(cè)該基因型NDV的流行分布情況。