吳 萍，李燕妮，鄒 輝，陳義倫

（山東農業(yè)大學食品科學與工程學院，山東泰安 271018）

脲酶（Urease,EC 3.5.1.5），又稱尿素胺基水解酶，能夠水解尿素生成氨和氨基甲酸酯。在人體胃部，幽門螺旋桿菌脲酶作為定植因子和毒力因子，催化尿素水解以提高胃部pH，導致一系列胃部病變，如胃潰瘍、萎縮性胃炎、腸化生及異型增生，甚至發(fā)展為胃癌。天然及合成的脲酶抑制劑可干擾尿素與催化位點的結合，降低脲酶的催化活性，減少幽門螺旋桿菌的感染及對人體的危害。

研究表明尿素類似物、氧肟酸類、磷酰胺酯類、醌類、雜環(huán)化合物以及植物多酚等可以直接或間接地抑制幽門螺旋桿菌脲酶活性。直接作用于脲酶催化活性中心與尿素競爭結合位點的抑制劑屬于競爭性抑制劑，包括尿素類似物和磷酰胺酯類；作用于非催化活性中心的抑制劑屬于非競爭性抑制劑，包括巰基乙醇和氧肟酸類等。雖然上述多種物質均具有抑制脲酶活性的作用，但因副作用強、耐藥性高和成本高等弊端而發(fā)展前景有限。來源于植物中的生物活性物質副作用小、耐藥性差且成本低，如植物多酚，具有良好的抑制幽門螺旋桿菌脲酶的作用。黃芩苷能夠與脲酶活性位點的巰基結合，屬于競爭性-緩慢結合型脲酶抑制劑。槲皮素可通過羥基作用于脲酶的flap 區(qū)域，屬于非競爭性抑制類型。此外，染料木素、蘆丁、楊梅素、楊梅苷和木犀草素等多酚對幽門螺旋桿菌脲酶也有明顯的抑制作用。

蒲公英（）是一種藥食兩用的天然草本植物，其水提多酚可抑制幽門螺旋桿菌定植，預防胃部病變。但蒲公英水提物中的主要抑酶多酚成分尚未明確，且抑制作用機理仍不清晰。不同來源脲酶的單體具有高度保守的氨基酸序列，活性區(qū)域的結構大致相似，而植物來源的洋刀豆脲酶，因其易獲得性而成為脲酶抑制劑前期研究中的模式酶。本實驗選取洋刀豆脲酶為受體蛋白，以蒲公英全草為材料，通過液質聯(lián)用法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）和分子對接法篩選了蒲公英水提物中的主要抑酶多酚，研究了其抑酶效果和抑制類型，并采用熒光分析法結合分子對接分析了抑酶作用機制，以期為蒲公英多酚應用于脲酶抑制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

堿地蒲公英全草粉（3000 目） 含水量7.77%，產(chǎn)于河北保定，購于泰安藥材市場；洋刀豆脲酶Sigma-Aldrich 貿易有限公司；菊苣酸（純度≥98%）成都儀睿生物科技有限公司；咖啡酸（純度≥98%）、XAD-7 大孔樹脂 上海麥克林生化科技有限公司；尿素、乙二胺四乙酸、亞硝基鐵氰化鈉、無水乙醇（色譜純）、甲醇（色譜純）及其他有機溶劑 天津市凱通化學試劑有限公司；氯化鋰 北京索萊寶科技有限公司；苯酚、磷酸氫二鉀 國藥集團化學試劑有限公司。

TGL16M 臺式高速冷凍離心機 長沙英泰儀器有限公司；QL-901 渦旋機 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海華鄰實業(yè)有限公司；SpectraMax M5 酶標儀 上海美谷分子儀器；LTQ-Orbitrap Elite 組合型高分辨質譜儀 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒲公英水提多酚制備及定性定量分析 稱取30 g 蒲公英全粉溶于300 mL 的去離子水中，超聲30 min 后，以8000 r/min 的離心速率離心10 min，取上清液過濾后，用XAD-7 大孔樹脂純化，旋蒸濃縮，冷凍干燥。制得蒲公英水提多酚。

HPLC 條件：C色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A：純水（1‰甲酸），流動相B：甲醇（1‰甲酸）。紫外檢測器的檢測波長為280 nm，流速0.3 mL/min，進樣體積5 μL。梯度洗脫程序：0～1 min，2%B；1～9 min，2%～98%B；9～12 min，98%B。

MS 條件：電噴霧電離離子源，負離子模式；毛細管電壓3.5 kV；脫溶劑氣溫度325 ℃；質譜掃描范圍m/z 100～1000。

根據(jù)一級質譜離子峰面積外標法（選擇離子模式）進行定量分析，選取含量大于6%的多酚；再通過二級質譜碎片離子的m/z（子離子模式）結合文獻報道進行定性分析，確定含量大于6%的多酚種類。

1.2.2 蒲公英多酚與洋刀豆脲酶的分子對接分析以洋刀豆脲酶（PDB ID:1E9Z）為受體蛋白，四種多酚為小分子配體，用Ledock 軟件進行對接，每種配體的對接模型為50 個，根據(jù)模型的對接能量分析其抑酶作用。

1.2.3 菊苣酸、咖啡酸和蒲公英水提多酚對脲酶的抑制率的測定 用苯酚-次氯酸鹽比色法（Berthelot Method）測定抑制率，溶劑為磷酸鹽緩沖溶液（10 mmol/L磷酸氫二鉀，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L 氯化鋰）；按照1.2.1 測定的蒲公英水提多酚中菊苣酸和咖啡酸的含量配制相應質量濃度比例的樣品溶液，即菊苣酸，咖啡酸和蒲公英水提多酚的質量濃度分別為0.2124、0.1478 和2 g/L，各100 μL；脲酶質量濃度為0.25 g/L，100 μL；顯色劑A 液（0.005%亞硝基鐵氰化鈉，1%苯酚），100 μL；顯色劑B 液（0.5%氫氧化鈉，0.1%次氯酸鈉），100 μL。

具體操作如下：取2 mL 的離心管，以溶劑為空白對照，將抑制劑加入到脲酶溶液中，用渦旋機混勻，于37 ℃條件下反應30 min，加入50 mmol/L 的尿素100 μL，于37 ℃孵育60 min 后加入顯色劑（先加A液再加B 液）反應10 min，取200 μL 于96 孔酶標板，在625 nm 條件下測定吸光度。根據(jù)公式（1）計算抑制率。

式中：OD為空白組的吸光度值；OD為添加抑制劑組的吸光度值。

1.2.4 菊苣酸和咖啡酸的脲酶半數(shù)抑制濃度（IC）的測定 以乙酰氧肟酸為對照，質量濃度為0.25 g/L的脲酶溶液各100 μL，抑制劑分別為菊苣酸溶液（0、0.125、0.25、0.375、0.5、0.625、0.75、0.875、1 mmol/L）/咖啡酸溶液（0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 mmol/L）/乙酰氧肟酸溶液（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mmol/L），各100 μL。具體操作見1.2.3，并求得各抑制劑的IC。

1.2.5 菊苣酸和咖啡酸抑制脲酶的熒光猝滅分析將100 μL 的菊苣酸/咖啡酸（濃度均為0、6、12、18、24、30 μmol/L）分別與100 μL 質量濃度為0.25 g/L 的洋刀豆脲酶溶液于96 孔酶標板中混合。熒光測試條件為激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長范圍290～360 nm，振動5 s，溫度37 ℃。測得不同濃度菊苣酸/咖啡酸與洋刀豆脲酶溶液的熒光強度，并根據(jù)Stern-Volmer方程（2）計算猝滅常數(shù)。根據(jù)公式（3），確定結合位點數(shù)n 和結合常數(shù)K，并分析熒光猝滅規(guī)律及機制。

式中：F和F 分別是抑制劑不存在和存在的熒光強度；[Q]是抑制劑的濃度；K是熒光猝滅常數(shù)；K是熒光猝滅速率常數(shù)，反映了體系中分子的彼此擴散和相互碰撞對生物大分子熒光壽命衰減速率的影響；為猝滅劑不存在時熒光分子的平均壽命。

式中：K 為結合常數(shù)；n 為結合位點數(shù)。

1.2.6 菊苣酸和咖啡酸抑制脲酶活性的抑制類型的確定 用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法，根據(jù)方程（4）以尿素濃度的倒數(shù)為橫坐標，相對吸光度值的倒數(shù)為縱坐標作圖。計算動力學參數(shù)K（結合常數(shù)）和V（最大反應速度），確定菊苣酸/咖啡酸抑制洋刀豆脲酶的抑制類型。

式中：OD 為空白組的吸光度值與添加抑制劑的吸光度的差值；[urea]為尿素濃度，mmol/L；K為米氏常數(shù)，其值為最大反應速度V一半時的底物濃度。

1.2.7 菊苣酸和咖啡酸抑制脲酶的關鍵氨基酸和相互作用力分析 以洋刀豆脲酶（PDB ID:1E9Z）為受體蛋白，菊苣酸和咖啡酸分別為小分子配體，用icm軟件進行對接。分析菊苣酸和咖啡酸與洋刀豆脲酶作用位點的作用力和關鍵氨基酸。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 蒲公英水提多酚抑制脲酶的主要組分篩選

蒲公英水提多酚的特征含量與其抑制脲酶活性的強弱有關，采用質譜離子峰面積外標法確定多酚含量。據(jù)表1，蒲公英水提物中含量最高的四種多酚的峰面積占比均大于6%，且峰面積占比之和大于30%，除第五種多酚的峰面積占比約為4.33%外，其他多酚均低于4%。據(jù)其碎片離子的質荷比，可確定這四種多酚按含量從高到低依次為菊苣酸＞咖啡酸＞七葉內酯＞沒食子酸單水合物。其中，菊苣酸和咖啡酸的含量之和占蒲公英水提總多酚的18.10%，是含量最高的兩種多酚，與Katrin 等的測定結果一致。

表1 蒲公英多酚的定性、定量分析Table 1 Qualitative and quantitative analysis of dandelion polyphenols

多酚結構中的羥基也可影響其抑酶效果，將四種多酚分別與洋刀豆脲酶進行對接，結合能量越高，對脲酶的親和力越強。結果如圖1（a），結合能量從高到低依次為菊苣酸＞咖啡酸＞沒食子酸單水合物＞七葉內酯。由圖1（b）可知，菊苣酸結構中含有的羥基數(shù)目最多，共6 個，可推測多酚對脲酶的親和力與羥基數(shù)目有關。沒食子酸單水合物比咖啡酸含有的羥基多，結合能量卻略低于咖啡酸，可能由于其苯環(huán)上的3 個鄰位羥基產(chǎn)生的空間位阻效應，影響了沒食子酸單水合物與洋刀豆脲酶的結合。七葉內酯含有的羥基數(shù)目最少，與脲酶的結合能量最低。

圖1 四種蒲公英水提多酚作用于洋刀豆脲酶的結合能量和分子結構Fig.1 Binding energy against jack bean urease and structures of four dandelion water-extracted polyphenols

通過相對含量和對接能量兩個方面篩選蒲公英中的主要抑酶多酚，結果表明菊苣酸和咖啡酸不僅是蒲公英水提多酚中含量最高的，而且是與洋刀豆脲酶親和力最強的多酚。

采用苯酚-次氯酸鹽比色法驗證菊苣酸和咖啡酸的抑酶作用，結果如表2，菊苣酸和咖啡酸混合組對脲酶的抑制率占蒲公英水提總多酚的75.76%。由此可推斷，蒲公英水提多酚中發(fā)揮抑制脲酶活性作用的主要多酚是菊苣酸和咖啡酸。

表2 菊苣酸和咖啡酸與蒲公英水提總多酚的抑酶活性Table 2 Anti-enzyme activity of cichoric acid,caffeic acid and dandelion water-extracted polyphenols

2.2 菊苣酸和咖啡酸的脲酶抑制效果

按照1.2.3 的方法，以乙酰氧肟酸為陽性對照，測定菊苣酸和咖啡酸對洋刀豆脲酶的抑制效果。結果如圖2 所示，乙酰氧肟酸的抑制效果最強，IC值為0.14±0.08 mmol/L，菊苣酸和咖啡酸的IC值分別為0.34±0.07 和3.04±0.68 mmol/L。乙酰氧肟酸因抑制效果顯著已用于臨床，但持續(xù)使用有致畸、致突變作用。雖然菊苣酸和咖啡酸的抑制效果不及乙酰氧肟酸，但作為天然無毒副作用的脲酶抑制劑仍表現(xiàn)出低濃度高效性和濃度依賴性的抑酶作用。菊苣酸比咖啡酸的抑酶效果強，可能是由于菊苣酸可水解生成兩個咖啡酸，比咖啡酸的羥基數(shù)目多，羥基數(shù)目的增多可能會增強抑酶效果。

圖2 菊苣酸（a）、咖啡酸（b）和乙酰氧肟酸（c）與洋刀豆脲酶作用的IC50Fig.2 IC50 of cichoric acid (a),caffeic acid (b) and acetohydroxamic acid (c) against jack bean urease

2.3 菊苣酸和咖啡酸抑制脲酶的機理分析

2.3.1 熒光猝滅分析 洋刀豆脲酶內源熒光的主要供體是色氨酸，當激發(fā)波長為280 nm 時，色氨酸可產(chǎn)生熒光。在猝滅劑存在的情況下，熒光發(fā)射峰出現(xiàn)的藍移和紅移現(xiàn)象可表明菊苣酸和咖啡酸是否與洋刀豆脲酶存在相互作用。菊苣酸和咖啡酸與洋刀豆脲酶均在發(fā)射波長為318 nm 處有最大發(fā)射峰（λ）。如圖3（a）所示，當反應體系中菊苣酸的濃度增大后，λ發(fā)生微弱偏移，從318 nm 移動到317 和316 nm。如圖3（b）所示，咖啡酸濃度增大，從318 nm 移動到317 nm。表明菊苣酸和咖啡酸與洋刀豆脲酶發(fā)生了相互作用，改變了洋刀豆脲酶中色氨酸的微環(huán)境，且峰值隨著抑制劑濃度的增大而減小，表明菊苣酸和咖啡酸對洋刀豆脲酶為濃度依賴性的猝滅作用。

圖3 不同濃度菊苣酸（a）和咖啡酸（b）與洋刀豆脲酶作用的熒光強度Fig.3 Fluorescence intensity of different concentrations of cichoric acid (a) and caffeic acid (b) with jack bean urease

由圖4 和表3 可知，菊苣酸和咖啡酸的熒光猝滅速率常數(shù)K為10數(shù)量級，遠大于生物大分子的最大散射碰撞速率常數(shù)2.0×10L/mol/s，可推斷猝滅機制均為靜態(tài)猝滅。即菊苣酸和咖啡酸與色氨酸在基態(tài)時發(fā)生配合反應，生成了不發(fā)光的基態(tài)化合物。結合位點數(shù)n 約為2，表明菊苣酸和咖啡酸與洋刀豆脲酶均存在2 個結合位點。菊苣酸對洋刀豆脲酶的K值和K 值均大于咖啡酸，說明菊苣酸對洋刀豆脲酶的抑制能力更強。結果與半數(shù)抑制濃度測定的結果一致。

表3 菊苣酸和咖啡酸與洋刀豆脲酶相互作用的參數(shù)Table 3 Interaction parameters of cichoric acid and caffeic acid against jack bean urease

圖4 菊苣酸和咖啡酸與洋刀豆脲酶作用的熒光分析Fig.4 Fluorescence analysis of different concentrations of cichoric acid and caffeic acid against jack bean urease

2.3.2 菊苣酸和咖啡酸對脲酶的抑制動力學分析通過動力學參數(shù)K和V隨抑制劑濃度的變化規(guī)律可推斷酶抑制劑的作用類型。據(jù)圖5 和表4 可知，菊苣酸/咖啡酸的存在并未改變K的大?。o顯著性差異）；菊苣酸/咖啡酸濃度增大，V均逐漸減小。由此可知，菊苣酸和咖啡酸對脲酶的抑制作用為非競爭性抑制類型。菊苣酸和咖啡酸通過與洋刀豆脲酶催化活性中心外的必需基團結合，從而影響洋刀豆脲酶的活性，與尿素的濃度無關。其他植物多酚如黃芩苷和槲皮素作用于脲酶的抑制類型是非競爭性抑制類型，與本實驗結論一致。

表4 不同濃度菊苣酸和咖啡酸對洋刀豆脲酶動力學參數(shù)的影響Table 4 Effect of different concentrations of cichoric acid and caffeic acid on the kinetic parameters of jack bean urease

圖5 Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法測定菊苣酸（a）和咖啡酸（b）的動力學參數(shù)Fig.5 Determination of kinetic parameters of cichoric acid(a) and caffeic acid (b) by Lineweaver-Burk

2.3.3 菊苣酸/咖啡酸與脲酶的相互作用力分析 洋刀豆脲酶被激活后，flap 區(qū)域的活動是影響其催化效果的關鍵。圖6 的分子對接結果顯示，菊苣酸和咖啡酸與洋刀豆脲酶的同一位點結合，即鎳離子活性中心上的flap 區(qū)域，限制了flap 區(qū)域的閉合，導致脲酶活性降低。進一步分析相互作用的關鍵氨基酸和作用力，如圖7（a）所示，與菊苣酸形成氫鍵的主要氨基酸殘基包括Asp-730、Glu-718、Glu-742、Gln-82、Ala-80、Lys-716；形成碳氫鍵的主要氨基酸殘基為Val-81；產(chǎn)生范德華力的主要氨基酸殘基有Phe-712、Lys-709、Lys-745、Val-744、Val-36、Tyr-32、Ala-16、Ala-37、Met-746、Thr-33、Thr-740、Pro-743、Leu-13。如圖7（b）所示，與咖啡酸形成氫鍵的主要氨基酸殘基包括Glu-718、Val-744；形成范德華力的主要氨基酸殘基有Lys-709、Phe-712、Lys-745、Met-746；形成Π 鍵的有Asp-730 和Lys-716。其中，菊苣酸和咖啡酸均與Glu-718 形成氫鍵，與Lys-709、Phe-712、Lys-745、Met-746 產(chǎn)生范德華力。與槲皮素抑制脲酶的作用方式相似，上述非共價相互作用力可能為抑制劑作用于脲酶提供穩(wěn)定的空腔，以便flap 區(qū)域相關氨基酸殘基的活動，降低了尿素與脲酶活性中心結合的概率。

圖6 菊苣酸（a）和咖啡酸（b）與洋刀豆脲酶的復合物結構Fig.6 Docking structure of cichoric acid (a) and caffeic acid (b)with jack bean urease

圖7 菊苣酸（a）和咖啡酸（b）與脲酶相互作用的關鍵氨基酸及相互作用力Fig.7 Key amino acids and interaction power of cichoric acid (a) and caffeic acid (b) against urease

3 結論

是蒲公英水提多酚中抑制洋刀豆脲酶活性的主要多酚，含量分別為10.62%和7.39%。半數(shù)抑制濃度分別為0.34±0.07 和3.04±0.68 mmol/L，均呈濃度依賴性抑制，菊苣酸的抑酶效果強于咖啡酸，抑制類型均為以氫鍵和范德華力為主的非競爭性抑制類型，且熒光猝滅機制為靜態(tài)猝滅。本研究從蒲公英水提多酚的特征含量入手進行分析，其它多酚或多組分的抑酶作用及機理需進一步研究探討，以更深入全面地闡明蒲公英多酚抑制脲酶活性的作用機制。