張顏，孫寶盛，肖貴榜，楊玉能，楊泓濤，李世春，鄧位喜*

（1遵義職業(yè)技術學院，貴州遵義 563006；2習水縣富興牧業(yè)有限公司，貴州遵義 564600）

0 引言

【研究意義】黔北麻羊是貴州省三大優(yōu)良地方山羊品種之一，因其獨特的生態(tài)和經(jīng)濟特征，代表了必要的形態(tài)和遺傳資源，于2013年獲國家農(nóng)產(chǎn)品地理標志登記保護。黔北麻羊被毛有茶褐色及淡褐色2種，具有背部羊毛呈黑色、腹部羊毛呈草白色的獨特特征（羅衛(wèi)星等，2010；曾瓊和史忠輝，2011）。因此，揭示黔北麻羊毛色特征形成機制，對探究及豐富羊毛顏色的形成機理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】羊毛的毛色差異主要是由皮膚中黑色素細胞產(chǎn)生的黑色素分布和轉(zhuǎn)運所決定（鮑加榮等，2015；郭躍躍等，2017；薛驥軒等，2019）。黑色素包括真黑色素和褐黑色素，合成于黑色素細胞中的黑素小體（劉海霞等，2021）。黑色素細胞由神經(jīng)峭細胞通過黑色素前體細胞等分化而成，部分黑色素前體細胞遷移至毛囊中，分化為成熟的黑色素細胞，產(chǎn)生的黑色素融入毛發(fā)纖維中而形成黑色羊毛（張汝芝和朱文元，2007）；當黑色素生成受抑制大幅度減少或缺乏時則形成白色羊毛（岳丹等，2021）。黑色素合成的關鍵信號通路包括MC1R/α-MSH、MAPK、PI3K/Akt及Wnt/β-catenin等（趙美娟等，2019；Mei et al.，2019），而參與黑色素合成通路的因子主要有酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關蛋白1（TYRP1）、酪氨酸酶相關蛋白2（TYRP2）（Jennifer and David，2007）、黑素皮質(zhì)素受體1（MC1R）（付冬麗，2013）、α-促黑色素細胞激素（α-MSH）和小眼畸形相關轉(zhuǎn)錄因子（MITF）等（許冬梅，2017）。其中，MITF是調(diào)控黑色素形成關鍵酶的重要轉(zhuǎn)錄因子（白瑞等，2006），而TYR是合成黑色素的關鍵酶（姜俊兵等，2010）。黑色素合成是TYR催化體內(nèi)酪氨酸羥化而發(fā)生的一系列生化反應（鄭會芹，2010；劉海霞等，2021），酪氨酸經(jīng)TYR催化后生成多巴，多巴再經(jīng)過一系列反應最終形成黑色素（熊和麗等，2019）?！颈狙芯壳腥朦c】為了研究黔北麻羊毛色形成的遺傳機制，翁吉梅等（2018）從基因水平分析了與黑色素生成相關的基因多態(tài)性，李佳璐（2020）研究證實了大足黑山羊、內(nèi)蒙古山羊皮膚中的TYR和MITF顯著差異表達是造成這2種山羊間黑白毛色差異的主要原因，但至今鮮見從蛋白水平研究黔北麻羊黑白毛色差異分子機制的相關報道?！緮M解決的關鍵問題】對黔北麻羊背部黑色羊毛和腹部白色羊毛的皮膚組織進行蛋白組學分析，以期獲得影響其毛色差異的特異性蛋白及其通路，為揭示黔北麻羊特征毛色的形成機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組

從習水縣富興牧業(yè)有限公司選取體況相近的1歲黔北麻羊公羊3只，分別采集其背部黑色羊毛下的皮膚組織塊和腹部白色羊毛下的皮膚組織塊，通過蛋白組學篩選出與這2個部位毛色差異相關的蛋白及其通路。黑色羊毛下的皮膚組織塊設為試驗組，共3個重復（Black-1、Black-2和Black-3）；白色羊毛下的皮膚組織塊設為對照組，共3個重復（White-1、White-2和White-3）。

1.2 飼養(yǎng)管理

按照NY 5032—2006《無公害食品 畜禽飼料和飼料添加劑使用準則》對黔北麻羊進行飼養(yǎng)管理。黔北麻羊飼料由富興牧業(yè)有限公司配制提供，其消化能為3.12 MJ/kg，由玉米（54.0%）、豆粕（26.0%）、麩皮（11.0%）、70%賴氨酸（0.5%）、磷酸氫鈣（0.5%）、石粉（1.0%）、小蘇打（1.0%）、食鹽（1.0%）及預混料（5.0%）組成。

1.3 樣品采集

將3只黔北麻羊背部黑色羊毛和腹部白色羊毛區(qū)域的羊毛刮凈，暴露皮膚，局部麻醉。在體側(cè)背部的肩胛骨后緣1 cm處取3小塊皮膚組織樣品，同樣在腹部取3小塊皮膚組織。以生理鹽水沖洗皮膚組織，迅速裝入標號的凍存管中，經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品檢測

參照夏澤宇（2021）的方法，采用SDT裂解法提取黔北麻羊皮膚組織蛋白，隨后進行蛋白定量分析。每個樣品取適量蛋白進行胰蛋白酶酶解，再對肽段進行脫鹽，肽段凍干后復溶及定量。將標記的肽段等量混合，采用高pH反相肽分離試劑盒進行分級?；旌系臉擞涬亩蜗冗M行柱平衡，經(jīng)離心脫鹽后梯度洗脫；樣品凍干后進行復溶并測定肽段濃度；樣品經(jīng)高效液相色譜分離后以質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析，最后對原始數(shù)據(jù)進行鑒定及定量分析（蔣少秋，2020）。

1.5 生物信息學分析

1.5.1 蛋白聚類分析對顯著差異表達蛋白的定量進行歸一化，并對蛋白表達量進行分類，然后生成聚類分析圖。

1.5.2 顯著差異表達蛋白定量分析以黑色羊毛皮膚組織塊為試驗組（Black）、白色羊毛皮膚組織塊為對照組（White），當組間蛋白的相比表達差異倍數(shù)（logFold Change）＞1.20且＜0.05時為上調(diào)表達，當logFold Change＜0.83且＜0.05時則為下調(diào)表達。然后通過蛋白數(shù)據(jù)庫，從顯著差異表達蛋白中篩選出與決定毛色的黑色素相關蛋白。

1.5.3 GO功能注釋及KEGG通路富集分析利用Blast2GO和KAAS分別對組間顯著差異表達蛋白進行GO功能注釋及KEGG通路富集分析。

1.5.4 亞細胞定位分析通過CELLO（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）對組間顯著差異表達蛋白進行亞細胞定位分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白聚類分析結(jié)果

顯著差異表達蛋白聚類分析結(jié)果（圖1）顯示，黔北麻羊黑色羊毛試驗組的3個重復（Black-1、Black-2和Black-3）和 白 色 羊 毛 對 照 組3個 重 復（White-1、White-2和White-3）間的顯著差異表達蛋白可明顯區(qū)分開，說明篩選結(jié)果能代表生物學處理對試驗樣本的影響，試驗數(shù)據(jù)可靠。

2.2 顯著差異表達蛋白定量分析結(jié)果

與白色羊毛對照組相比，黑色羊毛試驗組有420個顯著差異表達蛋白（圖2），其中247個呈上調(diào)表達（紅點）、173個呈下調(diào)表達（藍點）。通過蛋白數(shù)據(jù)庫進一步篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在247個上調(diào)蛋白中與形成黑色羊毛的黑色素相關蛋白共有9個，包括與視黃醇相關的表皮視黃醇脫氫酶2（SDR16C5）、視黃醇脫氫酶16（RDH16）和視黃醇飽和酶（RETSAT），以及角蛋白79（KRT79）等（表1）；在173個下調(diào)蛋白中，與黑色素相關的蛋白有6個，包括蛋白激酶B（AKT）、β抑制蛋白1（ARRB1）及分泌型卷曲相關蛋白1（SFRP1）等（表1）。

圖1 黔北麻羊黑白羊毛組間顯著差異表達蛋白聚類分析結(jié)果Fig.1 Cluster analysis of significantly differential proteins between black and white groups of C.hircus

2.3 顯著差異表達蛋白GO功能注釋分析結(jié)果

對420個顯著差異表達蛋白進行GO功能注釋分析，結(jié)果（圖3）表明這些蛋白主要參與到細胞過程（Cellular process）、代謝過程（Metabolic process）及生物調(diào)節(jié)（Biological regulation）等25種生物學過程（Biological process），還參與結(jié)合（Binding）、催化活性（Catalytic activity）和轉(zhuǎn)運活性（Transporter activity）等9種分子功能（Molecular function），以及細胞（Cell）、細胞區(qū)域（Cell part）、細胞器（Organelle）和細胞膜（Membrane）等17種細胞組分（Cellular component）。

由于GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn)許多顯著差異表達蛋白涉及細胞組分，因此進一步對420個顯著差異表達蛋白進行亞細胞定位分析，并以餅狀圖展示各亞細胞器中的顯著差異表達蛋白數(shù)目及分布比例，結(jié)果（圖4）顯示有159個蛋白定位于細胞質(zhì)、128個蛋白定位于細胞核及88個蛋白定位于線粒體。

圖2 黔北麻羊黑白毛色組間差異表達蛋白的火山分布圖Fig.2 Volcano plot of up-regulated proteins and down-regulated proteins between groups of C.hircus

2.4 顯著差異表達蛋白KEGG通路富集分析結(jié)果

對420個顯著差異表達蛋白進行KEGG通路富集分析，結(jié)果（圖5）表明這些顯著差異表達蛋白富集在209條KEGG通路上，其中排名前20的通路包括纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解（Valine，leucine and isoleucine degradation）、過氧化物酶體（Peroxisome）、脂肪酸降解（Fatty acid degradation）、不飽和脂肪酸生物合成（Thermogenesis）及丙酸代謝（Propanoate metabolism）等。

在富集獲得的209條KEGG通路中，進一步篩選到5條與黑色素生成相關的KEGG通路（表2），包括視黃醇代謝（Retinol metabolism）、黑色素生成（Melanogenesis）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇3激酶—蛋白激酶B（PI3K-Akt）和Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/β-catenin）通路。

3 討論

羊毛的顏色由皮膚中黑色素細胞產(chǎn)生的黑色素顆粒分布及轉(zhuǎn)運所決定（薛驥軒等，2019）。黑色素細胞產(chǎn)生的黑色素會傳遞給周圍的角質(zhì)形成細胞進行存儲，而角質(zhì)形成細胞在分化過程中形成角蛋白。崔玉琮等（2017）研究表明，角蛋白家族的角蛋白2可激活羊駝皮膚黑色素細胞中與黑色素合成相關的信號通路，促進黑色素合成。本研究中，與白色羊毛對照組相比，黑色羊毛試驗組的角蛋白KTR79表達顯著上調(diào)，意味著形成角蛋白的角質(zhì)形成細胞及其中的黑色素增加，故推測KTR79是形成黔北麻羊背部黑色羊毛的重要蛋白之一。此外，黑色羊毛試驗組中與視黃酸分化相關的SDR16C5、RDH16和RETSAT等蛋白也呈顯著上調(diào)表達趨勢。其中，視黃酸與視黃酸受體結(jié)合形成復合物，然后與酪氨酸酶基因調(diào)控區(qū)的視黃酸反應元件結(jié)合，上調(diào)酪氨酸酶基因表達，從而生成更多的黑色素（何成，2019）。本研究中，與視黃酸分化相關的SDR16C5、RDH16和RETSAT等蛋白表達上調(diào)，通過視黃醇代謝通路增加背部黑色羊毛皮膚的黑色素生成。黑色羊毛試驗組的合成蛋白17（STX17）、RAS腫瘤基因家族成員（RAB9A）、溶酶體相關細胞器復合體1亞基3（BLOC1S3）等蛋白明顯上調(diào)，均有利于促進黑色素的生成。其中，BLOC1S3與色素沉著（Morgan et al.，2006）、黑素體運輸（Setty et al.，2007）及黑素體組織（Lee et al.，2012）密切相關，基因表達下降會引起小鼠色素沉著減少（Starcevic and Dell'Angelica，2004）。RAB9A調(diào)節(jié)黑素細胞中溶酶體和黑素體的運輸（Mahanty et al.，2016），而STX17表達上調(diào)可促進黑素細胞增殖（Pielberg et al.，2008）。

表1 黔北麻羊黑白羊毛組間與黑色素生成相關的顯著差異表達蛋白Table 1 Significantly differential proteins related to melanogenesis between groups of C.hircus

圖3 顯著差異表達蛋白的GO功能注釋分析結(jié)果Fig.3 GO functional annotation of significantly differentially proteins

圖4 顯著差異表達蛋白的亞細胞定位分析結(jié)果Fig.4 Subcellular localization of significantly differential proteins

相反，本研究中黑色羊毛試驗組的AKT較白色羊毛對照組呈顯著下調(diào)趨勢，也有利于黑色素的生成和黑色羊毛的形成。已有研究表明，當PI3K-AKT通路中的AKT受抑制時，將會激活糖原合成酶激酶-3β（GSK3β），促使MITF磷酸化，從而增強MITF與酪氨酸酶啟動子的結(jié)合，促進黑色素生成（Khaled et al.，2002）。ARRB1可增加酪氨酸酶活性，增加細胞內(nèi)黑色素的含量（平鋒鋒等，2017）；其參與的MAPK通路能激活黑色素細胞受體，促使MITF上調(diào)，加速酪氨酸酶相關蛋白合成，引起黑色素生成增加（Wang et al.，2017）。但在本研究中黑色羊毛組的ARRB1表達顯著下調(diào)，故推測黔北麻羊黑色羊毛中的黑色素并非主要依靠MAPK信號通路形成。值得注意的是，黑色羊毛試驗組中的SFRP1表達也呈下調(diào)趨勢。SFRP1會抑制Wnt/β-catenin信號通路活性（鄭楓蕓和李繼承，2007），而Wnt/β-catenin信號通路通過上調(diào)MITF活性（鄒道佩，2019）或激活PI3KAKT信號通路刺激黑色素生成（Mei et al.，2019）。本研究中，黑色羊毛試驗組的SFRP1表達顯著下調(diào)，對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用降低，而有利于黔北麻羊背部黑色羊毛黑色素的生成。

圖5 顯著差異表達蛋白的KEGG通路富集分析結(jié)果（前20名）Fig.5 KEGG pathway enrichment of significantly differential proteins（top 20）

表2 與黑色素生成相關的KEGG通路Table 2 KEGG pathway analysis of significantly differential proteins related to melanin production

β-catenin增強基因表達、刺激黑色素生成的過程均在細胞核內(nèi)完成（Huang et al.，2011；Guo et al.，2012）。本研究的GO功能注釋分析和亞細胞定位結(jié)果也顯示，在420個顯著差異表達蛋白中有128個蛋白定位于細胞核，另有88個蛋白定位于線粒體，進一步證實線粒體在維持皮膚黑素細胞功能和色素沉著方面也具有重要作用（Ni-Komatsu and Orlow，2007）。本研究從蛋白水平上解釋了黔北麻羊黑白毛色差異的原因，為山羊毛色形成機制的研究打下了基礎，也為推進黔北麻羊特色種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供了新思路。

4 結(jié)論

導致黔北麻羊存在黑白毛色差異的原因：一方面是參與黑色素生成通路的KRT79及參與視黃醇通路的SDR16C5、RDH16和RETSAT等蛋白表達上調(diào)，促進黑色素細胞中黑色素的生成和黑色羊毛的形成；另一方面是參與PI3K-AKT通路的AKT表達下調(diào)，以及SFRP1表達下調(diào)而降低對Wnt/β-catenin信號通路的抑制，均有利于黑色素生成。