張桂寧，方弟安，2*，薛向平，毛成誠，彭云鑫

（1中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214081；2上海海洋大學(xué)/水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，南京 210095）

0 引言

【研究意義】翹嘴鲌（）俗稱大白魚、翹嘴白魚等，隸屬于鯉科（Cyprinidae）鲌亞科（Cultrinae），是東亞特有鯉科魚類中重要的一個(gè)類群（倪勇和伍漢霖，2006）。翹嘴鲌生活于水體上層，是一種廣溫性魚類，其肉質(zhì)鮮嫩，生長迅速，營養(yǎng)價(jià)值高，是目前人工養(yǎng)殖的重要水生經(jīng)濟(jì)魚類之一（何舜平等，2004）。近年來，由于水域環(huán)境遭到破壞，加之過度捕撈，致使我國野生的翹嘴鲌資源面臨巨大挑戰(zhàn)，呈現(xiàn)出群體小型化和低齡化的趨勢（賈永義，2019）。開展生物群體遺傳多樣性分析是采取有效保護(hù)措施的基礎(chǔ)（代應(yīng)貴和肖海，2011），即明確翹嘴鲌遺傳多樣性，不僅有利于評估其種質(zhì)資源狀況，還能為保護(hù)翹嘴鲌種質(zhì)資源提供參考依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】線粒體DNA（mtDNA）具有結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速率適宜及母系遺傳的特點(diǎn)，適用于物種進(jìn)化和分子多態(tài)性研究（陳四海等，2011；鄒輝等，2020）。魚類mtDNA主要包括37個(gè)編碼基因（13個(gè)疏水蛋白基因、2個(gè)rRNA基因和22個(gè)tRNA編碼基因）、1個(gè)負(fù)責(zé)復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起始的控制區(qū)（D-loop）和1個(gè)輕鏈復(fù)制起始區(qū)（郭新紅等，2004），其中細(xì)胞色素氧化酶（COI、COII和COIII）是由疏水蛋白基因編碼。與其他線粒體蛋白編碼基因相比，基因的進(jìn)化速率較快（彭居俐等，2009），常被用于研究親緣關(guān)系較近的種、種下分類單元及地理群體間的關(guān)系（王偉，2007；黃小彧，2012；楊子拓，2016）。近年來，國內(nèi)外針對翹嘴鲌的研究主要集中在營養(yǎng)與飼料（王桂芹等，2008）、解剖學(xué)與生物學(xué)特性（Cao et al.，2011）、遺傳多樣性（黃小彧，2012；王丹等，2015）及人工繁殖和胚胎發(fā)育（周彥鋒等，2018；賈永義，2019）等方面，而基于mtDNA分析翹嘴鲌遺傳多樣性的研究主要集中在基因、D-Loop控制區(qū)和基因序列。王偉等（2008）研究證實(shí)了基因序列在翹嘴鲌群體遺傳學(xué)研究中的有效性，并分析黑龍江興凱湖至江蘇太湖6個(gè)水域的翹嘴鲌群體遺傳多樣性，認(rèn)為通過基因可將我國翹嘴鲌進(jìn)行區(qū)域劃分，但尚不能作為群體鑒別的分子標(biāo)記；黃小彧（2012）基于線粒體D-Loop控制區(qū)分析長江水系14個(gè)翹嘴鲌群體的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)翹嘴鲌群體具有高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性共存現(xiàn)象；王丹等（2015）利用線粒體基因初步分析鲌屬魚類的遺傳多樣性，結(jié)果表明鲌屬魚類具有高的遺傳多樣性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】受環(huán)境污染、棲息地被破壞及水利修建等因素的影響，翹嘴鲌野生資源瀕臨枯竭，且種群小型化、低齡化現(xiàn)象嚴(yán)重，但目前針對翹嘴鲌遺傳背景的系統(tǒng)研究較少，難以為其種質(zhì)資源的保護(hù)工作提供可靠依據(jù)，尤其鮮見基于基因序列開展地理位置較近翹嘴鲌群體遺傳多樣性的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】在長江下游水域（淀山湖、高郵湖、太湖、長蕩湖及長江江蘇段）設(shè)點(diǎn)捕獲收集翹嘴鲌野生樣本，基于基因序列分析翹嘴鲌遺傳多樣性，明確其遺傳多樣性的豐富程度和進(jìn)化歷史，為翹嘴鲌育種及遺傳改良打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019年5—9月，使用絲網(wǎng)分別在淀山湖（DS）、高郵湖（GY）、太湖（TH）、長蕩湖（CD）和長江（CJ）江蘇段設(shè)5個(gè)采樣水域（圖1）捕獲收集翹嘴鲌樣本，剪下尾鰭浸泡于95%酒精中，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)測量

使用精度為0.01 mm的游標(biāo)卡尺測量所有翹嘴鲌的全長和體長，以精度為0.01 g的電子秤稱量魚體質(zhì)量。當(dāng)魚體長超過500.00 mm時(shí)，則使用卷尺和臺(tái)秤進(jìn)行測量。

1.3 DNA提取

剪取備用鰭條組織樣品（＜30.0 mg）置于離心管中，采用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取DNA，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。DNA樣品-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 COII基因PCR擴(kuò)增及測序

依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的翹嘴鲌基因序列（AY704458）設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物：-3（5'-TGAT CGCTCTGCCCCCCCT-3'）、-5（5'-AGGATCAG CTCGAAGTGC-3'）（王偉等，2008）。PCR反應(yīng)體系25.0μL：dNTP Mixture 12.0μL，上、下游引 物（5μmol/L）各0.5μL，DNA模板2.0μL，ddHO 10.0μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃10 s，59℃10 s，72℃30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃結(jié)束。2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將條帶清晰的有效擴(kuò)增產(chǎn)物送至亦欣生物科技（上海）有限公司進(jìn)行雙向測序，測序引物與擴(kuò)增引物一致。

1.5 數(shù)據(jù)分析

測量所有翹嘴鲌的體長和體質(zhì)量，通過SPSS 19.0進(jìn)行均值比較分析。采用ClustalX 1.83（Petren and Case，1997）和Seaview（Gouy et al.，2012）進(jìn)行基因核苷酸組成及序列分析；使用DNASPv5（Librado and Rozas，2009）計(jì)算群體單倍型，并進(jìn)行Tajima’s D和Fu’s Fs中性檢驗(yàn)，以推測群體是否發(fā)生群體擴(kuò)張；運(yùn)用Arlequin 3.5（Excoffier and Lischer，2010）進(jìn)行遺傳多樣性分析、群體分子方差分析（Analysis of molecular variance，AMOVA）及計(jì)算遺傳距離和基因流（）；在MEGA 6.0中以Kimura雙參數(shù)法（Kimura-2-parameter）為替代模型（Tamura et al.，2013），采用鄰接法（Neighbour-joining，NJ）構(gòu)建翹嘴鲌群體單倍型系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分析各群體間的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

翹嘴鲌?bào)w長與體質(zhì)量數(shù)據(jù)均為每個(gè)采樣點(diǎn)的平均數(shù)值，以太湖翹嘴鲌群體最大，其次是長江群體，而后依次是高郵湖群體、長蕩湖群體和淀山湖群體。共測序得到197個(gè)基因序列（表1）。

圖1 翹嘴鲌采樣水域分布情況Fig.1 Distribution of C.alburnus sampling waters

表1 5個(gè)翹嘴鲌野生群體的生物信息Table 1 Biological information of 5 wild C.alburnus populations

圖2 部分翹嘴鲌樣本的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.2 PCR amplification electrophoresis of some C.alburnus samples

2.2 翹嘴鲌COII基因序列變異及單倍型分析結(jié)果

以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，運(yùn)用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，部分電泳結(jié)果如圖2所示。5個(gè)翹嘴鲌野生群體197個(gè)個(gè)體的基因序列長度經(jīng)比對后獲得的有效長度為425 bp，有31個(gè)變異位點(diǎn)（表2），變異率為7.29%。翹嘴鲌基因測序結(jié)果（圖3）表明，其堿基含量排序?yàn)門（29.61%）＞C（28.03%）＞A（24.19%）＞G（18.17%）。AT含量為53.8%，CG含量為46.2%。

31個(gè)變異位點(diǎn)在197個(gè)個(gè)體中共定義出13種單倍型（表3）。其中，9個(gè)單倍型為各群體特有的單倍型，占69.23%，即hap6和hap7為高郵湖特有，hap4為淀山湖特有，hap8和hap9為長蕩湖所特有，長江群體特有4個(gè)單倍型（hap10、hap11、hap12和hap13）。此外，有4個(gè)單倍型（hap1、hap2、hap3和hap5）在翹嘴鲌群體中共享，占30.77%，有2個(gè)單倍型（hap1和hap2）在5個(gè)群體中均有分布。其中，又以hap1最常見，存在于138個(gè)個(gè)體中，是優(yōu)勢單倍型；其次是hap2。太湖群體與淀山湖群體共享hap3?；贙imura-2-parameter構(gòu)建的翹嘴鲌群體單倍型系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4）顯示，5個(gè)翹嘴鲌野生群體所特有的單倍型并未各自聚類形成獨(dú)立分支，而是相互交錯(cuò)形成復(fù)雜的簇群，說明不同翹嘴鲌群體間的分化并不明顯。

表2 翹嘴鲌COII基因的變異位點(diǎn)Table 2 Variation sites of mtDNA COII gene of C.alburnus

圖3 部分翹嘴鲌COII基因的測序圖譜Fig.3 Sequencing map of COII gene in some C.alburnus

表3 COII基因在5個(gè)翹嘴鲌野生群體中的單倍型分布情況Table 3 Haplotype distribution of the mtDNA COII gene in the 5 populations of C.alburnus

圖4 基于Kimura-2-parameter構(gòu)建的翹嘴鲌群體單倍型系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of haplotype of C.alburnus populations based on Kimura-2-parameter

2.3 遺傳多樣性分析結(jié)果

從5個(gè)翹嘴鲌野生群體197個(gè)個(gè)體中共檢測出13個(gè)單倍型，單倍型多樣性指數(shù)（）為0.273～0.603，以長江群體和長蕩湖群體的最高，太湖群體的最低；核苷酸多樣性指數(shù)（）為0.001～0.017，以長蕩湖群體的最高，淀山湖群體的最低（表4）。5個(gè)翹嘴鲌野生群體的為0.491，為0.007，說明其遺傳多樣性豐富。翹嘴鲌群體內(nèi)的遺傳距離為0.001～0.018（表5），其中淀山湖群體內(nèi)的遺傳距離最小，長蕩湖群體內(nèi)的遺傳距離最大；不同群體間遺傳距離為0.002～0.015，即群體間無顯著差異。5個(gè)翹嘴鲌野生群體間的為2.443～54.325（表5），以太湖群體與淀山湖群體間的最大（54.325），長蕩湖群體與淀山湖群體間的最小（2.443）。分子方差分析（AMOVA）結(jié)果（表6）顯示，不同群體間的遺傳變異為10.47%，而群體內(nèi)的遺傳變異為89.53%。

2.4 群體歷史動(dòng)態(tài)分析結(jié)果

中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示：除了長蕩湖群體的Tajima’s D為正值外，其余群體的Tajima’s D均為負(fù)值（表4），且太湖群體表現(xiàn)為極顯著偏離中性理論下的Wright-Fisher模型（＜0.01），長江群體表現(xiàn)為顯著偏離中性理論下的Wright-Fisher模型（＜0.05）。Fu’s Fs檢驗(yàn)結(jié)果表明，淀山湖和長江的Fu’s Fs為負(fù)值（表4），且長江群體具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5個(gè)翹嘴鲌野生群體的Tajima’s D和Fu’s Fs均為負(fù)值（-1.479和-0.547），但不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

遺傳分化指數(shù)（）是群體間遺傳分化的一個(gè)重要指標(biāo)，常用于衡量2個(gè)群體間的遺傳分化程度：當(dāng)＜0.05時(shí)表示群體間幾乎無遺傳分化，當(dāng)0.05＜＜0.15時(shí)表示群體間存在低度分化，當(dāng)0.15＜＜0.25時(shí)表示群體間存在中度分化，當(dāng)＞0.25時(shí)表示群體間存在高度分化（黃小彧，2012）。本研究中，5個(gè)翹嘴鲌野生群體間為0.105，表明不同翹嘴鲌野生群體間存在低度分化。Hebert等（2003）對動(dòng)物界11個(gè)門13320個(gè)物種的研究結(jié)果顯示，種內(nèi)遺傳距離大多數(shù)在1%以下，很少超過2%。本研究結(jié)果表明，淀山湖、高郵湖、太湖、長蕩湖和長江群體的群體內(nèi)遺傳距離分別為0.001、0.009、0.003、0.018和0.004，均符合Hebert等（2003）提出的觀點(diǎn)。將5個(gè)翹嘴鲌野生群體視為一個(gè)整體進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，翹嘴鲌群體的為0.491，為0.007，表現(xiàn)出低和高，說明具有較豐富的遺傳多樣性，與黃小彧（2012）基于線粒體D-Loop控制區(qū)研究長江水系14個(gè)翹嘴鲌群體遺傳多樣性得出的結(jié)論（為0.866，為0.0033）相反，究其原因可能是黃小彧（2012）研究利用的D-Loop控制區(qū)標(biāo)記與本研究采用的基因不同，也有可能是禁捕政策的實(shí)施促使近年來長江水域翹嘴鲌的資源量有所增加所致。顏岳輝等（2019）曾研究證實(shí)波氏吻蝦虎（）表現(xiàn)出低和高，與本研究結(jié)果相似，可能是歷史群體曾發(fā)生瓶頸效應(yīng)，而后伴隨出現(xiàn)群體快速增長及積累新突變。

表4 5個(gè)翹嘴鲌野生群體的遺傳多樣性參數(shù)Table 4 Genetic diversity parameters of 5 C.alburnus populations

表5 不同翹嘴鲌群體的基因流和遺傳距離Table 5 Gene flow and genetic distance of different C.alburnus populations

表6 不同翹嘴鲌野生群體間及群體內(nèi)的分子方差分析結(jié)果Table 6 Analysis of molecular variance between and within the C.alburnus populations

人類活動(dòng)在很大程度上會(huì)影響群體間的基因交流，如人工引種和增殖放流等?；蚪涣魇侵干飩€(gè)體從其發(fā)生地分散出去而導(dǎo)致不同群體間基因雜交的過程，其基本作用是削弱生物群體間的遺傳差異（Grant and Bowen，1998）。如大于1.000，表明在群體中會(huì)有較高水平的基因交流，尤其是＞4.000表明群體間存在頻繁的基因交流（Mcmillen-Jackson and Bert，2004）。本研究中，5個(gè)翹嘴鲌野生群體的在2.443～54.325，且長蕩湖群體與其他水域群體間的均較小（2.443～6.179）。從本研究采樣區(qū)域的地理位置來看，長蕩湖與其他水系不通，由于地理隔離造成該水域翹嘴鲌群體與其他水域翹嘴鲌群體間存在基因交流障礙；而太湖的地理?xiàng)l件優(yōu)越、物產(chǎn)豐富，先后建立了銀魚（）、秀麗白蝦（）、翹嘴鲌和青蝦（）等國家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)（谷孝鴻等，2009），為不同地理群體的基因交流創(chuàng)造了條件。太湖漁業(yè)資源調(diào)查發(fā)現(xiàn)，隨著人類捕撈活動(dòng)的加劇及棲息環(huán)境被破壞，翹嘴鲌多樣性逐漸降低，魚種趨于小型化和單一化（賈永義，2019），也可能是其他因素導(dǎo)致太湖翹嘴鲌群體遺傳多樣性降低，具體原因有待進(jìn)一步探究。翹嘴鲌性情活潑好動(dòng)，在無地理隔離條件下群體間的基因交流可能是導(dǎo)致不同群體形態(tài)相近的主要原因之一（王偉，2007）。淀山湖群體與太湖群體間的為54.325，表明這2個(gè)水域的翹嘴鲌存在一定的基因交流，是由于淀山湖與太湖距離相對較近，且歷史上有河流連通；高郵湖群體與長蕩湖群體間的遺傳距離最大（0.015），則因地理隔離形成了穩(wěn)定的地理群體；由于地理隔離的原因，長蕩湖與其他幾個(gè)水域間無河流連通，因此長蕩湖翹嘴鲌群體與其他湖泊的翹嘴鲌群體間幾乎無基因交流。

本研究對不同翹嘴鲌野生群體及整體分別進(jìn)行Tajima’s D檢驗(yàn)和Fu’Fs檢驗(yàn)，以推測翹嘴鲌群體是否經(jīng)歷過群體擴(kuò)張事件。當(dāng)Tajima’s D和Fu’Fs均為負(fù)值且具有顯著意義時(shí)，則認(rèn)為該群體曾發(fā)生過群體擴(kuò)張現(xiàn)象（Fu，1997；劉偉等，2016）。在5個(gè)翹嘴鲌野生群體中，僅長江群體的Tajima’s D和Fu’Fs均為負(fù)值且具有顯著意義，故推測該群體曾發(fā)生過群體擴(kuò)張現(xiàn)象。

4 結(jié)論

長江下游翹嘴鲌群體表現(xiàn)出低單倍型多樣性和高核苷酸多樣性，遺傳多樣性較豐富，群體間存在遺傳分化但分化程度差異不顯著。因此，后續(xù)研究應(yīng)增加野生翹嘴鲌群體的樣品數(shù)量和調(diào)查水域，全面而系統(tǒng)地評估長江下游各水域翹嘴鲌的種質(zhì)資源狀況，為建立自然保護(hù)區(qū)及人工增殖放流提供科學(xué)依據(jù)。