喬秋江，龐 琦

（山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 濟南 250021）

腦膠質(zhì)瘤（glioma）是當(dāng)前中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，預(yù)后較差[1]。膠質(zhì)母細胞瘤（Ⅳ級）是其中惡性程度最高的一種，中位生存期不足15 個月[2]。異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突變狀態(tài)、1p/19q 共缺失和O-6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（O-6-Methylguanine-DNA Methyltransferase，MGMT）啟動子甲基化等被證明可以預(yù)測膠質(zhì)瘤患者的藥物反應(yīng)及預(yù)后[3，4]。也有研究發(fā)現(xiàn)[5-7]，不同類型膠質(zhì)瘤中DNA 修復(fù)通路的激活、抗凋亡潛能或保護性自噬及膠質(zhì)瘤干細胞（GSCs）的差異同樣導(dǎo)致了預(yù)后的不同。由于惡性膠質(zhì)瘤的腫瘤微環(huán)境異質(zhì)性，目前治療仍未見明顯進展，探究影響膠質(zhì)瘤腫瘤預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物對臨床治療有重要意義。自噬是一種高度保守的細胞動態(tài)自我消化過程，主要包括自噬體的形成以及自噬體與溶酶體的融合和降解[8]。自噬有助于維持細胞的能量代謝，也可消除受損細胞器和錯誤折疊的蛋白質(zhì)，維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。而過度自噬的發(fā)生，可引起細胞死亡，這種死亡方式稱為Ⅱ型程序性細胞死亡[9]。自噬對于腫瘤微環(huán)境中抗腫瘤免疫中也有重要作用[10]，調(diào)節(jié)腫瘤細胞生存的潛在能力使其成為癌癥治療的目標(biāo)。缺氧是影響膠質(zhì)瘤腫瘤微環(huán)境的重要因素，可以導(dǎo)致腫瘤細胞的營養(yǎng)不足和基因表達的改變，也影響著細胞內(nèi)自噬水平的改變[11]。缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）是細胞缺氧反應(yīng)中的重要調(diào)控因子，能夠影響細胞內(nèi)自噬相關(guān)基因的表達，進而影響腫瘤細胞的免疫微環(huán)境。有研究表示[12]，缺氧可以激活HIF-1α 依賴的自噬，從而通過抵消細胞毒性T 淋巴細胞和NK 細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)來促進腫瘤細胞的生存。而本研究旨在通過公共數(shù)據(jù)庫挖掘腦膠質(zhì)瘤缺氧與自噬相關(guān)基因的關(guān)系，并建立模型預(yù)測患者預(yù)后和免疫微環(huán)境，以期為腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療提供更可靠的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載及數(shù)據(jù)處理 在Human Autophagy Database（HADb）（http://www.autophagy.lu/）下載232個自噬相關(guān)基因。通過The Cancer Genome Atlas（TCGA）（https://portal.gdc.cancer.gov/）和 Chinese Glioma Genome Atlas（CGGA）（http://www.cgga.org.cn/）數(shù)據(jù)庫分別收集610 例和658 例膠質(zhì)瘤患者臨床信息和基因表達數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析過程中去除臨床信息不完整的樣本。

1.2 基因相關(guān)性分析 利用R4.1 軟件進行Pearson相關(guān)性分析，并挑選出|與HIF-1α 相關(guān)性值|＞0.3，P＜0.05 的基因。通過與已下載的232 個自噬相關(guān)基因（ARGs）對比，篩選出與缺氧相關(guān)的ARGs。

1.3 差異表達基因功能分析 使用org.Hs.eg.db，cluster Profiler，ggplot2 等R 包對已篩選出的ARGs進行GO[生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）]和KEGG 功能富集分析，F(xiàn)DR＜0.05 視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。富集分析篩選出與缺氧相關(guān)的ARGs 潛在分子機制和信號通路。

1.4 預(yù)后分析 對以上篩選出的ARGs 使用單因素Cox 回歸分析，選出與預(yù)后相關(guān)的基因，篩選閾值為：風(fēng)險比HR≠1，P＜0.05。對預(yù)后相關(guān)基因進行多因素Cox 比例風(fēng)險回歸分析，獲得預(yù)后相關(guān)基因的回歸系數(shù)。使用基因的表達水平和回歸系數(shù)計算患者的風(fēng)險分數(shù)。根據(jù)風(fēng)險評分中位數(shù)將以上患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。使用K-M 生存曲線評估兩組之間生存預(yù)后的差異；繪制ROC 曲線，計算AUC值，引入CGGA 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)作為驗證集評估該風(fēng)險評分模型效能。

1.5 構(gòu)建風(fēng)險預(yù)測模型與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系分析 使用R 語言分別通過ESITMATE 算法和Cibersort 算法計算高、低風(fēng)險組的免疫浸潤分數(shù)和22 種免疫細胞浸潤的差別，利用兩組中抑制性免疫檢查點的表達差異推測其對免疫治療的反應(yīng)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 使用R4.1、Adobe Illustrator 2019進行統(tǒng)計分析和作圖。生存曲線使用Log-rank 檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因表達相關(guān)性分析 共篩選出2370 個基因與HIF-1α 存在相關(guān)性（圖1A）。通過與從HADb 下載的232 個ARGs 比較，結(jié)果篩選出40 個HIF-1α 表達相關(guān)的ARGs，見圖1B。

圖1 基因表達相關(guān)性分析

2.2 GO 和KEGG 富集分析 GO 分析顯示，BP 中主要包括對外界刺激的反應(yīng)、自噬的調(diào)控和對營養(yǎng)水平的反應(yīng)；CC 中主要為膜筏、自噬體以及死亡誘導(dǎo)復(fù)合體；MF 中主要為半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與的凋亡信通路，見圖2A；KEGG 富集分析顯示，上述ARGs 主要富集于自噬、凋亡、多種神經(jīng)退行性疾病以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工等，見圖2B。

圖2 HIF-1α 相關(guān)性ARGs 的GO 和KEGG 富集分析

2.3 風(fēng)險評估模型的建立 通過單因素Cox 回歸分析，在40 個與HIF-1α 相關(guān)的ARGs 中有36 個與患者生存預(yù)后密切相關(guān)（圖3A）。對其進行多元Cox回歸分析，篩選出4 個ARGs（CASP3、MAPK9、NAMPT、CAMKK2）以構(gòu)建風(fēng)險評估模型（圖3B）。通過所選基因的回歸系數(shù)系數(shù)及相對表達量構(gòu)建膠質(zhì)瘤患者的風(fēng)險評分，并以中位風(fēng)險評分將患者分為低風(fēng)險組和高風(fēng)險組，散點圖顯示高風(fēng)險組死亡率高于低風(fēng)險組，熱圖顯示隨著風(fēng)險評分的升高，CASP3 和NAMPT 在高風(fēng)險組中表達升高，與不良預(yù)后相關(guān)；MAPK9 與CAMKK2 在高風(fēng)險組中表達降低，其低表達與不良預(yù)后相關(guān)，為保護性因素（圖3C）。

圖3 構(gòu)建基于HIF-1α 相關(guān)的ARGs 的風(fēng)險評分預(yù)后模型

2.4 預(yù)后模型的驗證 使用R 語言的survival ROC包，制作不同時間點的ROC 曲線，并計算AUC，結(jié)果顯示該風(fēng)險模型可預(yù)測膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的效果，其中3 年時AUC 最大，為0.89（圖4A）。K-M 生存曲線顯示，低風(fēng)險組生存率高于高風(fēng)險組（圖4B）。隨著風(fēng)險評分的升高，死亡患者隨之增加，4 個ARGs 表達情況與上述結(jié)果基本一致，K-M 生存曲線同樣驗證了該風(fēng)險評估模型在預(yù)測膠質(zhì)瘤患者的良好表現(xiàn)（圖4C、4D）。

圖4 預(yù)后風(fēng)險模型效能的評價

圖4 預(yù)后風(fēng)險模型效能的評價（續(xù)）

2.5 風(fēng)險評估模型與免疫微環(huán)境的關(guān)系 ESITMATE算法顯示，高風(fēng)險組免疫浸潤評分高于低風(fēng)險組（圖5A）；免疫檢查點基因結(jié)果顯示，高風(fēng)險組PD1、PDL1、PDL2、LAG3、B7H3、TIM3、CTLA4 高于低風(fēng)險組（圖5B）；免疫細胞浸潤結(jié)果顯示，高風(fēng)險組單核細胞、活化自然殺傷細胞和漿細胞低于低風(fēng)險組（圖5C）。

圖5 風(fēng)險評估模型與免疫微環(huán)境的關(guān)系

3 討論

膠質(zhì)瘤具有很強的腫瘤異質(zhì)性，相比肺癌、乳腺癌等其他惡性腫瘤，目前針對膠質(zhì)瘤的靶向治療仍未取得較大進展。惡性膠質(zhì)瘤的遺傳不穩(wěn)定性和不均一性明顯，相關(guān)信號通路作用及相互調(diào)節(jié)機制尚未清楚，多靶點聯(lián)合分析并構(gòu)建相關(guān)風(fēng)險模型是膠質(zhì)瘤治療中重要的研究思路。缺氧在膠質(zhì)瘤腫瘤微環(huán)境起重要作用，參與了血管生成、轉(zhuǎn)移、耐藥、免疫逃逸等在內(nèi)的多個方面。同時研究證明[13]，缺氧與腫瘤細胞自噬的發(fā)生密切相關(guān)，自噬可以通過缺氧環(huán)境依賴的方式抑制或驅(qū)動腫瘤的發(fā)生與進展。HIF-1α是腫瘤缺氧環(huán)境的重要調(diào)控因子，也是腫瘤微環(huán)境中免疫逃逸的重要組成部分。研究報道[14]，HIF-1α 通過誘導(dǎo)自噬促進腫瘤細胞免疫逃避。

本研究中用于構(gòu)建風(fēng)險評估模型的4 個ARGs，包 括 CASP3、MAPK9、NAMPT、CAMKK2。NAMPT 是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）合成的重要限速酶，在調(diào)節(jié)腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用，可以驅(qū)動IFN-γ 誘導(dǎo)PD-L1 的表達，并以CD8+T 細胞依賴的方式調(diào)控腫瘤免疫逃避，進而調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究證明[15]，抑制NAMPT 可以通過激活線粒體功能障礙有效地靶向調(diào)控膠質(zhì)瘤的遺傳異質(zhì)性。另有研究報道[16]，CAMKK2 抑制劑可以CD8+T 細胞依賴的方式抑制乳腺癌細胞生長，并促進免疫細胞的重新編程。MAPK9 是MAP 激酶家族的一員，在基因表達調(diào)控和細胞質(zhì)生物功能中起關(guān)鍵作用。有研究證明[17]，MAPK9 在非小細胞肺癌中發(fā)揮作用。

腫瘤細胞具有多種免疫逃避的機制，但其受限于患者腫瘤免疫微環(huán)境的區(qū)別，存在應(yīng)用局限性。通過此風(fēng)險評估模型判斷膠質(zhì)瘤患者免疫微環(huán)境差異有助于免疫治療的臨床應(yīng)用。腫瘤細胞通過產(chǎn)生異常的免疫檢查點信號來減弱免疫反應(yīng)，從而促進免疫逃逸[18]。PD1 是重要的T 細胞抑制因子，其與腫瘤細胞的PD-L1 結(jié)合可以明顯抑制細胞毒性T 細胞的增殖和活性，導(dǎo)致腫瘤細胞的免疫逃逸，且抑制性免疫檢測點的阻斷治療方法已經(jīng)在多種腫瘤治療中展現(xiàn)了良好的效果。有研究證明[19]，HIF-1α 在非小細胞肺癌細胞中通過表皮生長因子受體突變調(diào)控程序性細胞死亡配體1 的表達。PD1、PDL1、LAG3、TIM3、B7H3 等免疫檢查點的高表達通常代表腫瘤細胞對免疫檢查點抑制劑的反應(yīng)較好。本研究中高風(fēng)險組PD1、PDL1、PDL2、LAG3、B7H3、TIM3、CTLA4 高于低風(fēng)險組，提示本預(yù)后模型可以用于判斷膠質(zhì)瘤免疫治療的效果。而免疫細胞浸潤結(jié)果顯示，高風(fēng)險組單核細胞、活化自然殺傷細胞和漿細胞低于低風(fēng)險組；同時高風(fēng)險組免疫浸潤評分高于低風(fēng)險組，以上結(jié)果說明該風(fēng)險評估模型可以用于判斷膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境的改變。

基于生物信息學(xué)構(gòu)建的風(fēng)險評估模型仍具有一定的局限性，使用公共數(shù)據(jù)庫構(gòu)建預(yù)后模型的基因僅有具有統(tǒng)計學(xué)意義的關(guān)聯(lián)，暫不能肯定其相互作用。本研究中基因的生物學(xué)功能及作用的信號通路仍需在體內(nèi)實驗和體外實驗中驗證，其臨床意義也需在大規(guī)模多中心臨床隊列中進行驗證?？傊?，本研究提供了一種通過構(gòu)建基于缺氧這一重要腫瘤微環(huán)境相關(guān)ARGs 的模型來預(yù)測膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的方法，為膠質(zhì)瘤提供了研究方向和靶點。