肖 楊，蔣 振

（川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，四川 南充 637000）

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作用范圍廣、功能多未探索，近年來引起了廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著調(diào)控作用，其與多種疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 合成酶1（HMGCS1）是甲羥戊酸（MVA）途徑的限速酶，催化HMG-CoA 的合成，HMGCR 的底物是MVA 的中間體[1-4]。HMGCS 有兩種亞型，細(xì)胞溶質(zhì)HMGCS1和線粒體HMGCS2。研究發(fā)現(xiàn)[5，6]，HMGCS1 基因組擴(kuò)增和突變涉及各種腫瘤類型，尤其是乳腺癌和肺癌。作為MVA 的中間體，HMG-CoA 也可以被HMGCl 催化產(chǎn)生酮體。HMGCS1 可通過HMGCL-乙酰乙酸軸增強BRAFV600E 依賴性MEK1 激活，從而促進(jìn)BRAFV600E 陽性黑色素瘤的細(xì)胞增殖和腫瘤生長[7-10]。研究發(fā)現(xiàn)，甲羥戊酸（MVA）信號通路中的HMGCS1 在結(jié)腸癌組織中過表達(dá)，并正向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，HMGCS1 可增強PERK 的活性而不依賴于MVA 途徑，抑制HMGCS1 可完全降低EGF 誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[11-14]。然而，HMGCS1 在細(xì)胞內(nèi)的作用及其在疾病發(fā)展中的作用仍不明確。為了全面闡明長鏈非編碼RNA HMGCS1 在細(xì)胞內(nèi)所調(diào)控的分子功能及生物學(xué)過程，本研究擬運用生物信息學(xué)方法，分析lncRNA-HMGCS1 在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控靶基因及信號通路，并對其進(jìn)行生物學(xué)功能注釋，闡述lncRNAHMGCS1 在細(xì)胞內(nèi)的功能作用和分子機制。

1 資料與方法

1.1 lncRNA-HMGCS1 靶基因預(yù)測 經(jīng)NCBI 基因數(shù)據(jù)庫查詢lncRNA-HMGCS1 的序列，經(jīng)miRDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.mirdb.org/）和Starbase3.0 數(shù)據(jù)庫（https://starbase.sysu.edu.cn/index.php）預(yù)測與lncRNA-HMGCS1 有miRNA-lncRNA 互作關(guān)系的miRNA，將miRDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miRNA 與Starbase3.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測到的miRNA 選取2 個數(shù)據(jù)庫的交集進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.2 miRNAs 靶基因預(yù)測 在Starbase3.0 數(shù)據(jù)庫中分別對這些miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測，選取預(yù)測程序個數(shù)為3，預(yù)測到靶基因的評分比較高的前5 個，通過David數(shù)據(jù)庫（www.ncifcrf.gov）進(jìn)行靶基因的GO 注釋和信號通路富集分析。

1.3 GO 注釋 在David 數(shù)據(jù)庫中對選取的miRNAs靶基因結(jié)果進(jìn)行功能注釋（GO analysis），主要從基因功能的4 個方面進(jìn)行：細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物學(xué)過程（biological process，BP）和信號通路（pathways）。得到具有統(tǒng)計學(xué)意義的GO 注釋顯著性分析（P≤0.05），同樣信號通路富集分析閾值取P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA-HMGCS1 預(yù)測miRNAs 結(jié)果顯示，在miRDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到與lncRNA-HMGCS1 有miRNA-lncRNA 互作關(guān)系的miRNAs95 個，Starbase3.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測到167 個；取兩者交集共有14 個miRNA，是在Starbase3.0 數(shù)據(jù)庫預(yù)測程序數(shù)為3 時能預(yù)測到靶基因的miRNA，具體如下：hsa-miR-543、hsamiR-429、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-496、hsa-miR-206、hsamiR-4735-3p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-2355-3p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-579-3p、hsa-miR-450b-5p。

2.2 GO 注釋分析 選取其中評分較高的前2 個miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測，再運用數(shù)據(jù)庫對結(jié)果中的靶基因進(jìn)行GO 功能注釋。結(jié)果顯示，lncRNAHMGCS1 通過hsa-miR-543 作用的靶基因主要調(diào)控細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基復(fù)合體物質(zhì)轉(zhuǎn)運、調(diào)控細(xì)胞周期、染色質(zhì)組裝、細(xì)胞分裂以及蛋白質(zhì)磷酸化等生物學(xué)過程；通過hsa-miR-543 作用的細(xì)胞內(nèi)分子功能主要有轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列特異性DNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄協(xié)作因子活性、組蛋白結(jié)合、GDP 結(jié)合、GDP 結(jié)合、ATPase 結(jié)合及染色質(zhì)結(jié)合等功能；長鏈非編碼RNA HMGCS1 通過hsa-miR-429作用的靶基因主要調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡過程、RNA剪接、細(xì)胞應(yīng)對DNA 損傷反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運、細(xì)胞分裂、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、蛋白磷酸化與去磷酸化、染色質(zhì)重塑、蛋白質(zhì)泛素化以及負(fù)性調(diào)控細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程；通過hsa-miR-429 作用的細(xì)胞內(nèi)分子功能主要有ATP 結(jié)合、泛素化蛋白連接酶活性、RNA 聚合酶Ⅱ序列特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、PDZ 結(jié)構(gòu)域結(jié)合、蛋白激酶活性、小GTPase 結(jié)合及序列特異性DNA 結(jié)合等分子功能，見圖1。

圖1 GO 注釋分析

圖1 GO 注釋分析（續(xù)）

2.3 信號通路富集分析 選取評分較高的前2 個miRNA 進(jìn)行信號通路富集，結(jié)果顯示，長鏈非編碼RNA HMGCS1 通過hsa-miR-543 作用的信號通路包括細(xì)胞衰老泛素化介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解、晝夜節(jié)律、FoxO 信號途徑、生長激素合成分泌和作用、TGFbeta 信號通路、人T 細(xì)胞白血病病毒1 感染、腫瘤信號通路、Kaposi 肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、MAPK 信號通路、VEGF 信號通路以及自噬信號通路等；長鏈非編碼RNA HMGCS1 通過hsa-miR-429 作用的信號通路包括神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路、腫瘤中的糖蛋白信號通路、FoxO 信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白降解信號通路、Ras 信號通路、人乳頭狀瘤病毒感染、MAPK信號通路、細(xì)胞衰老以及自噬信號通路等，見圖2。

圖2 富集通路分析

3 討論

HMGCS1 是甲羥戊酸途徑中的一個潛在調(diào)節(jié)節(jié)點，在多種疾病中發(fā)生突變[15-18]，其表達(dá)在腫瘤中普遍失調(diào)。癌癥基因組學(xué)數(shù)據(jù)集顯示，HMGCS1 在胃癌、乳腺癌和肺癌等多種癌癥中得到擴(kuò)增，HMGCS1 可促進(jìn)細(xì)胞增殖，如HMGCS1 介導(dǎo)的膽固醇生物合成促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和生長。

HMGCS1 可通過HMGCL-乙酰乙酸軸增強，MEK1 的激活，從而促進(jìn)黑色素瘤的細(xì)胞增殖和腫瘤生長，其在細(xì)胞生長、分化、個體發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用[19-21]。本研究通過分析lncRNA-HMGCS1 的靶基因，并進(jìn)一步分析其在細(xì)胞內(nèi)調(diào)控的信號通路。

本次研究在miRDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到lncRNAHMGCS1 相關(guān)的miRNAs 共95 個，同時在Starbase3.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miRNAs 共167 個，取交集共得到14個miRNAs，分別是hsa-miR-543，hsa-miR-429，hsa-miR-200b-3p，hsa-miR-200c-3p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-496，hsa-miR-206，hsa-miR-4735-3p，hsa-miR-18b-5p，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-2355-3p，hsa-miR-664b-3p，hsa-miR-579-3p，hsa-miR-450b-5p。對評分較高的前2 個miRNA 通過GO 功能注釋發(fā)現(xiàn)，lncRNA-HMGCS1 通過hsa-miR-543主要調(diào)控細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運，比如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基復(fù)合體物質(zhì)轉(zhuǎn)運。還調(diào)控細(xì)胞周期、染色質(zhì)組裝、細(xì)胞分裂以及蛋白質(zhì)磷酸化等生物學(xué)過程。同時，作用的細(xì)胞內(nèi)分子功能主要有轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列特異性DNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄協(xié)作因子活性及組蛋白結(jié)合等。此外，通過hsa-miR-429 的靶基因主要包括細(xì)胞應(yīng)對DNA 損傷反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運、細(xì)胞分裂、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、蛋白磷酸化與去磷酸化、染色質(zhì)重塑、蛋白質(zhì)泛素化，以及負(fù)性調(diào)控細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程，表明其生物學(xué)功能主要跟細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合及蛋白質(zhì)結(jié)合密切相關(guān)。

進(jìn)一步研究顯示，lncRNA-HMGCS1 在細(xì)胞內(nèi)作用的信號通路包括細(xì)胞衰老泛素化介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解、晝夜節(jié)律、FoxO 信號途徑、生長激素合成分泌和作用、TGF-beta 信號通路，提示它們的功能主要與細(xì)胞衰老、細(xì)胞節(jié)律、細(xì)胞長時程增強以及泛素介導(dǎo)的蛋白降解等方面相關(guān)。另一方面，通過hsamiR-429 作用的信號通路包括神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路、腫瘤中的糖蛋白信號通路、FoxO 信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白降解信號通路及Ras 信號通路等，提示其與細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)營養(yǎng)、腫瘤形成、蛋白降解等多種病理生理過程相關(guān)。然而，HMGCS1 的作用十分廣泛，研究顯示HMGCS1 可增強整合應(yīng)激反應(yīng)（ISR），并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白激酶RNA 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）相互作用，以代謝和非代謝方式促進(jìn)胃癌的進(jìn)展。

綜上所述，lncRNA-HMGCS1 在細(xì)胞內(nèi)調(diào)控的多個靶基因和信號通路，涉及到多種細(xì)胞內(nèi)的生理和病理過程，與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，長鏈非編碼RNA-HMGCS1 是有潛力的疾病診斷或治療靶點。