羅嵐, 盧巧喬, 陳成新, 鄭馨回, 劉世震, 趙偉,3
自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀(self-adhesive cement)由于其良好的粘接性能、簡(jiǎn)便的操作及較低的牙本質(zhì)術(shù)后敏感,在臨床上多用于各種修復(fù)體的粘接。若粘接劑殘留,游離單體等成分在粘接劑固化后可能會(huì)有不同程度析出,從而對(duì)牙周組織產(chǎn)生影響。此外,冠粘接后的樹(shù)脂水門(mén)汀殘留可能是導(dǎo)致冠邊緣或種植體周緣牙槽骨吸收、牙齦退縮等的原因[1]。人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament fibroblasts, HPDLFs)具有多向分化能力,在外界刺激狀態(tài)下,參與牙周膜、牙骨質(zhì)和牙槽骨重塑,是牙周組織愈合和再生的重要基礎(chǔ)[2]。粘接劑的殘留及析出物與牙周組織密切接觸,HPDLFs的狀態(tài)與牙周健康息息相關(guān)。為比較不同自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀對(duì)牙周組織的影響,本研究比較臨床上常用的4種自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀(RelyX Unicem、SAC、Duo-Link和PermaCem)的浸提液對(duì)HPDLFs增殖的影響,以期為臨床上選擇理想的粘接材料以及使用方法提供一定的理論依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 牙齒 選取2017—2018年因正畸需要拔除的無(wú)齲病、無(wú)牙周病的前磨牙15顆,男性8顆,女性7顆,患者年齡10~20歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意,受試者均知情同意。
1.1.2 主要試劑和儀器 RelyX Unicem自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀(ESPE,美國(guó)3M公司);SAC可樂(lè)麗菲露復(fù)合樹(shù)脂粘接劑(日本可樂(lè)麗醫(yī)療器材株式會(huì)社);Duo-Link樹(shù)脂水門(mén)汀(美國(guó)BISCO公司);PermaCem 2.0自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀(德國(guó)DMG公司);DMEM低糖培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone公司);優(yōu)級(jí)南美胎牛血清(加拿大Wisent公司);胰酶(美國(guó)Gibco公司);Ⅰ型膠原酶(美國(guó)Sigma公司);磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)粉劑(北京蘭杰柯科技有限公司);青霉素-鏈霉素混合液(上海碧云天生物技術(shù)研究所)。CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CK04,日本同仁化學(xué)研究所);CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(3111,美國(guó)Thermo公司);熒光相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(DMIL/DFC295,德國(guó)萊卡公司);生物安全超凈臺(tái)(上海力申科學(xué)儀器有限公司);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(ELX808,美國(guó)Bio-Tek公司);自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó)Countstar公司);LED 光固化燈(EliparTMS10,美國(guó)3M公司)。其他普通試劑和常用儀器由福建省高校口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2 方法
1.2.1 試件制備 利用聚甲基丙烯酸甲酯模具制作硅橡膠方塊(20 mm×8 mm×10 mm),共16個(gè),每個(gè)方塊里有3個(gè)高8.0 mm、內(nèi)徑4.0 mm的圓柱體凹槽,將Unicem、SAC、Duo-Link和PermaCem等4種粘接劑按說(shuō)明書(shū)混合調(diào)拌,緩慢注入硅橡膠凹槽內(nèi),將硅橡膠置于固定框架內(nèi),蓋上聚甲基丙烯酸甲酯蓋板,用光固化燈(400~490 nm)沿各個(gè)方向分別照射粘接劑40 s,待粘接劑固化后,用無(wú)菌鑷子取出試件,經(jīng)紫外線(xiàn)照射消毒90 min后備用。
1.2.2 浸提液制備 按照DMEM完全培養(yǎng)液體積與試件表面積之比為1.885 mL/cm2的標(biāo)準(zhǔn)[3]。將每個(gè)品牌的試件分成4組,每組含3個(gè)試件。將試件放入15 mL的離心管中,加入2 mL的DMEM完全培養(yǎng)液,置于37 ℃恒溫箱中。分別于浸泡1、3、5 和7 d時(shí)取浸提液,用0.22 μm濾菌器過(guò)濾,得到無(wú)菌的樹(shù)脂浸出液。
1.2.3 HPDLFs的原代培養(yǎng)與鑒定 采用酶消化組織塊法[4],將牙齒移入裝有無(wú)菌PBS的培養(yǎng)皿中,保持牙面濕潤(rùn),用PBS沖洗牙齒3~4次,除去血污。用無(wú)菌刀片刮取根中1/3部位的牙周膜,直接移入1 mL含0.05% Ⅰ型膠原酶的PBS中,置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。每10 min振蕩1次,共消化20 min,1 000 r/min 離心5 min,去除上清液。加入DMEM完全培養(yǎng)液1 mL,吹勻,接種于6孔板,繼續(xù)添加DMEM至3 mL。待細(xì)胞長(zhǎng)出后,每3天換液1次,待組織塊中游出的細(xì)胞鋪滿(mǎn)孔底的80%時(shí),胰酶消化傳代。在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞,大部分細(xì)胞回縮變圓后,終止消化,換液后完成傳代。為盡可能保持原始異質(zhì)性并盡量減少克隆細(xì)胞,HPDLFs不應(yīng)在后期傳代(不超過(guò)7代)使用[5]。取3~5代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代HPDLFs,0.25%胰酶消化后,制備細(xì)胞爬片。待細(xì)胞長(zhǎng)至孔板的70%時(shí),丙酮固定,常規(guī)免疫組織化學(xué)法進(jìn)行波形絲蛋白、角蛋白單抗染色,光鏡下觀(guān)察。
1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)良好的第5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HPDLFs,用0.25%胰酶消化,調(diào)整細(xì)胞密度至1×105mL-1[6],接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100 μL,常規(guī)培養(yǎng)24 h,吸去培養(yǎng)液和未貼壁細(xì)胞,每個(gè)板分別加入相同浸提時(shí)間的4種樹(shù)脂浸提液100 μL,每種品牌重復(fù)5個(gè)孔,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育48 h后,吸去樹(shù)脂浸提液,用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液沖洗2次后,每孔內(nèi)加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,酶聯(lián)檢測(cè)儀下測(cè)定光密度(optical density, OD)值,用倒置相差顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)并拍照。計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的相對(duì)增殖率(relative growth rate, RGR)。根據(jù)RGR[7]將細(xì)胞毒性分為0~5級(jí),共6級(jí)。
RGR=[(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(陰性對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件分析4種自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀浸提液培養(yǎng)HPDLFs的OD值,采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析,多重比較采用LSD法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 形態(tài)學(xué)觀(guān)察 HPDLFs呈長(zhǎng)梭形或星形,胞突細(xì)長(zhǎng),胞體較大,胞質(zhì)均勻,核呈圓形或卵圓形,分布均勻(圖1),約20 d長(zhǎng)滿(mǎn)。
圖1 牙周膜成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀(guān)察Fig.1 Morphological observation of periodontal ligament fibroblasts
2.2 免疫組織化學(xué)鑒定 波形絲蛋白經(jīng)染色胞質(zhì)呈現(xiàn)出棕黃色,呈陽(yáng)性(圖2A);角蛋白胞質(zhì)無(wú)染色,呈陰性(圖2B)。結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)所獲得的細(xì)胞來(lái)源于中胚層,屬于纖維細(xì)胞,且未出現(xiàn)上皮源性細(xì)胞污染情況。
2.3 各實(shí)驗(yàn)組OD值、細(xì)胞RGR和細(xì)胞毒性分級(jí) 各實(shí)驗(yàn)組OD值、細(xì)胞RGR見(jiàn)表1。4種自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀均是3 d浸提液的細(xì)胞RGR達(dá)到最低,隨浸提時(shí)間延長(zhǎng),RGR增加(圖3)。細(xì)胞毒性分級(jí)結(jié)果顯示,4種自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀1 d浸提液的毒性分級(jí)均為0級(jí);浸提3 d時(shí),Unicem組毒性分級(jí)為3級(jí),SAC組和Duo-Link組為2級(jí),PermaCem組為1級(jí);浸提5 d時(shí),除了SAC組毒性分級(jí)為2級(jí),其余3組對(duì)細(xì)胞均無(wú)毒性;浸提7 d時(shí),4種樹(shù)脂水門(mén)汀均無(wú)細(xì)毒性。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行綜合分析(圖4),浸提3 d的Unicem組、SAC組和Duo-Link組以及浸提5 d的SAC組,各組細(xì)胞密度均勻,貼壁伸展,形態(tài)正常呈梭形或星形,浸提3 d的Unicem組和SAC組細(xì)胞密度略低于對(duì)照組。可見(jiàn)浸提3 d的Unicem組、SAC組和Duo-Link組以及浸提5 d的SAC組對(duì)HPDLFs的細(xì)胞毒性較小,對(duì)細(xì)胞增殖影響較小。
A:波形絲蛋白染色呈陽(yáng)性;B:角蛋白染色呈陰性。圖2 牙周膜成纖維細(xì)胞免疫組織化學(xué)結(jié)果Fig.2 Immunohistochemical results of HPDLFs
RGR:相對(duì)增殖率。圖3 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞RGR折線(xiàn)圖Fig.3 Line chart of relative growth rate of cells in each experimental group
表1 各實(shí)驗(yàn)組及陰性組OD值、RGR和細(xì)胞毒性分級(jí)
2.4 同一時(shí)間不同浸提液對(duì)細(xì)胞增殖的影響 浸提1 d,Unicem組的細(xì)胞RGR最高,顯著高于SAC組、PermaCem組和陰性對(duì)照組(P<0.05),其余各組組間比較差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5A)。浸提3 d,Unicem組、SAC組和Duo-Link組的細(xì)胞RGR顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.05),其中Unicem組最低(圖5B)。浸提5 d,所有實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞RGR均顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.05,圖5C)。浸提7 d,各組間差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5D)。
2.5 同一浸提液在不同時(shí)間下對(duì)細(xì)胞作用的影響 Unicem組3 d浸提液的RGR最低,顯著低于1和7 d(P<0.05);5 d的RGR較低,顯著低于1 d(P<0.05,圖6A)。SAC組1 d浸提液的RGR最高,3、5、7 d均顯著低于1 d(P<0.05),而3、5、7 d之間兩兩比較,差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖6B)。Duo-Link組浸提3和5 d的RGR均顯著低于1 d(P<0.05,圖6C)。PermaCem組浸提3和5 d的RGR均顯著低于1 d (P<0.05,圖6D)。
臨床上,即使再精密的修復(fù)體,如果粘接材料發(fā)生了體積收縮或溶解,冠邊緣就會(huì)發(fā)生微滲漏,使得粘接劑暴露于口腔環(huán)境。AUGSTI等[8]發(fā)現(xiàn),在體外對(duì)氧化鋯進(jìn)行清潔,無(wú)論使用何種類(lèi)型粘接劑,在所有氧化鋯的冠邊緣,特別是在鄰接區(qū)附近,仍然發(fā)現(xiàn)了粘接劑殘留。而不同的樹(shù)脂水門(mén)汀在固化以及口腔唾液的作用下,會(huì)有不同的成分(如游離單體及金屬離子等)析出[9],從而對(duì)牙周組織產(chǎn)生影響。
A:浸提3 d的Unicem組;B:浸提3 d的SAC組;C:浸提3 d的Duo-Link組;D:浸提5 d的SAC組;E:浸提7 d的Unicem組;F:浸提7 d的SAC組。圖4 浸提3、5和7 d的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察Fig.4 Morphological observation of cells in the experimental group after 3, 5 and 7 days of leaching
RGR:相對(duì)增殖率。A:1 d;B:3 d;C:5 d;D:7 d。圖5 不同時(shí)間浸提液處理后各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞RGR比較Fig.5 Comparison of RGR between the experimental groups and the control group after treatment with the extract at different times
RGR:相對(duì)增殖率。A:Unicem;B:SAC;C:Duo-Link;D:PermaCem。圖6 4種自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀浸提不同時(shí)間的細(xì)胞RGR比較Fig.6 Comparison of RGR of cells extracted with four kinds of self-adhesive resin cements at different times
細(xì)胞毒性試驗(yàn)為評(píng)估材料生物相容性的初步篩選試驗(yàn),其中CCK-8法具有方便、靈敏、重復(fù)性高及細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。以往大多數(shù)細(xì)胞毒性的體外研究主要集中在對(duì)小鼠或人類(lèi)牙髓細(xì)胞或牙齦成纖維細(xì)胞等的影響。然而,牙周組織相關(guān)細(xì)胞與粘接劑的接觸更密切。因此,本研究選用的是HPDLFs,其在牙周膜中膠原的更新與重建及牙周組織的修復(fù)和再生中起重要作用[10],參與鄰近牙槽骨和牙骨質(zhì)的改建及修復(fù)再生[11]。盡管細(xì)胞系可能有助于在不同研究中建立更統(tǒng)一的結(jié)果,但使用原代培養(yǎng)物進(jìn)行研究更接近臨床實(shí)際情況。在早期傳代中使用的原代HPDLFs細(xì)胞具有保持原始組織特征的表型和功能異質(zhì)性的優(yōu)勢(shì),能更好地模擬HPDLFs的情況[5]。
自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀因其將酸性成分和偶聯(lián)劑混合一起,無(wú)需對(duì)牙面做任何特殊處理,也無(wú)需使用粘接劑,即可在牙體和修復(fù)體之間形成良好的化學(xué)粘接,臨床操作簡(jiǎn)便,粘接強(qiáng)度穩(wěn)定、美觀(guān),得到廣大口腔臨床醫(yī)生的喜愛(ài),臨床應(yīng)用廣泛。自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀結(jié)合了光固化粘接劑和化學(xué)固化粘接劑的部分特點(diǎn),雙固化的優(yōu)點(diǎn)是允許粘接劑在光照不能到達(dá)的深層區(qū)域進(jìn)一步進(jìn)行化學(xué)固化[12]。因此,本研究選用了4種臨床上常見(jiàn)的自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀,并比較了它們對(duì)HPDLFs增殖的影響,以期為臨床醫(yī)生選擇合適的粘接材料提供一定的思路。
樹(shù)脂水門(mén)汀在細(xì)胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出毒性反應(yīng),主要是由材料釋放的單體引發(fā)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,第1天 4種材料均無(wú)毒性,第3天出現(xiàn)細(xì)胞抑制,第7天無(wú)細(xì)胞毒性。KAWAHARA等[13]使用高效液相色譜法檢測(cè)固化樹(shù)脂的殘留單體釋放時(shí)間,發(fā)現(xiàn)超過(guò)50%的單體在3 h內(nèi)從固化樹(shù)脂中洗脫出來(lái),殘留單體逐漸浸出長(zhǎng)達(dá)3 d,隨后保持不變,鄰苯二甲酸酯的釋放在7 d后保持不變。自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀比傳統(tǒng)樹(shù)脂具有更高的吸水性和溶解性[14]。為了實(shí)現(xiàn)與空間的黏合,自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀含有高濃度的酸性單體,過(guò)高的酸度增加了這些單體的親水性,增強(qiáng)了它們的浸出能力[15]。因此第1天4種自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀未出現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的抑制,可能與在無(wú)隔離屏障下進(jìn)行較為充分的光固化以及浸提液中釋放的單體量較少有關(guān)。而第3天出現(xiàn)明顯的細(xì)胞抑制,可能與單體釋放3 d的毒性累積效應(yīng)有關(guān)。
FRASHERI等[16]對(duì)自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀和常規(guī)樹(shù)脂與牙周膜細(xì)胞直接共培養(yǎng)的細(xì)胞毒性比較發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)至第21天仍有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性(Panavia >Smart Cem >RelyX Unicem> Variolink,P<0.000 1)。牙周膜細(xì)胞通常不會(huì)與修復(fù)體邊緣直接接觸,主要受齦溝液的間接影響。因此,本研究采用自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀的浸提液進(jìn)行檢測(cè)。NOCCA等[17]發(fā)現(xiàn),在無(wú)隔離屏障的情況下,從固化的自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀中釋放的單體量明顯低于在有陶瓷或復(fù)合屏障的情況下釋放的單體量。文獻(xiàn)[13]的結(jié)果顯示,Unicem、Multilink Speed自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀在第2天表現(xiàn)出最大的細(xì)胞毒性,常規(guī)樹(shù)脂則表現(xiàn)為刺激后即刻的細(xì)胞毒性,且在第7天達(dá)到最低水平。OGUZ等[18]的研究得到了相似的結(jié)果,他們檢測(cè)了兩種傳統(tǒng)的雙聚合(RelyX ARC和VariolinkN)和兩種自粘接(RelyX Unicem和Multilink Speed)樣品水門(mén)汀的細(xì)胞毒性,在第7天達(dá)到最低水平,殘留單體釋放在7 d內(nèi)完成[2]。本研究發(fā)現(xiàn),浸泡7 d的4種自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀均無(wú)細(xì)胞毒性,且細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),形態(tài)未見(jiàn)明顯異常,結(jié)果與上述文獻(xiàn)一致。
最近,一項(xiàng)有關(guān)牙齦成纖維細(xì)胞毒性的研究發(fā)現(xiàn),固化類(lèi)型不是細(xì)胞毒性的決定因素,更重要的是材料的組成[19]。筆者對(duì)4種水門(mén)汀的主要成分進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)Unicem組、SAC組和PermaCem組單體的主要成分中均含有雙酚a-甲基丙烯酸縮水甘油酯(BisGMA),Duo-link組的主要單體為三甘醇二甲基丙烯酸酯(TEGDMA)。在主要單體中,尤其是BisGMA和二甲基丙烯酸氨基乙酯(UDMA)比TEGDMA和甲基丙烯酸2-羥乙基酯(HEMA)具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,浸提3 d時(shí),Unicem組、SAC組和Duo-Link組表現(xiàn)為輕中度細(xì)胞毒性,鏡下觀(guān)察,Unicem組和SAC組的細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少,細(xì)胞形態(tài)貼壁生長(zhǎng),未見(jiàn)明顯變化。本實(shí)驗(yàn)第7天時(shí),受試的樹(shù)脂水門(mén)汀均無(wú)細(xì)胞毒性。因此認(rèn)為4種自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀都是良好的可供選擇的粘接劑,相比較下,PermaCem的生物相容性更好些。
本實(shí)驗(yàn)作為目前臨床常用自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀材料毒性的初探,應(yīng)考慮體外研究的局限性。第一,光聚合在降低細(xì)胞毒性作用中起重要作用,在存在陶瓷屏障的情況下,雙固化樹(shù)脂水門(mén)汀會(huì)釋放出更多的單體,當(dāng)使用厚度不超過(guò)2 mm的陶瓷或樹(shù)脂納米陶瓷修復(fù)體時(shí),被測(cè)材料的細(xì)胞毒性水平并不顯著[20]。而本實(shí)驗(yàn)自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀采用無(wú)屏障作用下體外光固化,并不能很好地模擬臨床上存在屏障的情況下的固化。因此,臨床實(shí)際雙固化的轉(zhuǎn)化率情況還與屏障物的材料厚度和醫(yī)師的操作有關(guān)。第二,口內(nèi)的環(huán)境復(fù)雜,細(xì)胞種類(lèi)繁多,而本實(shí)驗(yàn)研究的是HPDLFs單一的細(xì)胞群,存在一定的局限性。有研究者將12種不同的樹(shù)脂粘接劑制成的盤(pán)狀標(biāo)本,通過(guò)Transwell細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)直接刺激5種不同的人類(lèi)細(xì)胞系,所有測(cè)試的粘接劑均導(dǎo)致細(xì)胞活力下降,但在一定程度上取決于細(xì)胞類(lèi)型,其中在成骨細(xì)胞系中檢測(cè)到最高的細(xì)胞毒性作用[21]。第三,粘接劑殘留在口腔內(nèi)是個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程,本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的觀(guān)察時(shí)間為7 d,長(zhǎng)期的生物效應(yīng)尚未確定。
目前,臨床上可供選擇的粘接劑較多,如何選擇更可靠、更便捷的產(chǎn)品是臨床醫(yī)生普遍關(guān)心的問(wèn)題??谇徊牧先招略庐悾哉辰訕?shù)脂水門(mén)汀也在不斷改進(jìn)升級(jí)中,使得牙科粘接樹(shù)脂的自我修復(fù)成為可能。胡格等[22]在自粘接樹(shù)脂水門(mén)汀中加入納米抗菌無(wú)機(jī)填料,以提高材料的抗菌及自我修復(fù)功能。臨床醫(yī)師也應(yīng)該按照雙固化操作流程提高樹(shù)脂水門(mén)汀固化轉(zhuǎn)化率,減少游離單體溢出,去除粘接劑,減少粘接劑殘留,有利于修復(fù)體、種植體及牙周組織健康。