孫東蘭，王少雄，張 晶，彭園園，喬彥霞，胡亞芳，張 靜

線粒體12S核糖體核糖核酸(ribosomal rbonucleic acid，rRNA)基因位于人類線粒體DNA編碼區(qū)，是線粒體核糖體的重要組件，負責完成線粒體內(nèi)的翻譯，參與線粒體相關(guān)蛋白質(zhì)的合成。線粒體12S rRNA基因是藥物性耳聾相關(guān)的突變熱點區(qū)域，攜帶此基因突變的個體對氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides antibiotic，AmAn)高度敏感，接觸AmAn可導(dǎo)致不可逆的聽力損傷。因此，對新生兒進行線粒體DNA(mtDNA)12S rRNA的A1555G、C1494T藥物敏感突變位點篩查，對安全用藥具有重要的指導(dǎo)意義。本研究應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對新生兒進行上述基因突變位點篩查，依據(jù)結(jié)果給予用藥指導(dǎo)和后代遺傳性耳聾發(fā)病的風(fēng)險評估，并對陽性個體進行疫苗預(yù)防接種隨訪分析。

1 對象與方法

1.1 對象 2018-12至2021-10在石家莊市第四醫(yī)院出生的46 376例新生兒為研究對象，男女比例1.12∶1。全部新生兒均于出生后2～3 d通過TEOAE和AABR進行了聽力篩查，參與藥物性聾基因檢測者由其監(jiān)護人簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 藥物性聾基因檢測試劑盒(熒光PCR法)(英盛，濟南)，ABI 7500擴增儀(Thermo Fisher，美國)，ND 2000紫外分光光度計(Thermo Fisher，美國)。

1.2.2 樣本采集和DNA提取 新生兒出生后采集臍帶血滴血片，或在生后2～3 d采取足跟末梢血3～4滴，自然晾干后從血斑提取基因組DNA，取2 μl用紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度。

1.2.3 熒光定量PCR PCR反應(yīng)液完全解凍后放置室溫30 min，充分混勻并短暫離心。每個PCR反應(yīng)管分裝23 μl待測位點的PCR反應(yīng)液，加入2 μl待檢DNA后上ABI 7500擴增儀擴增。擴增程序按試劑盒說明書進行。

1.2.4 結(jié)果判定 FAM曲線成S形，且Ct值小于35，HEX(VIC)曲線無擴增或Ct值大于37，結(jié)果為野生型。HEX(VIC)曲線成S形，且Ct值小于35，F(xiàn)AM曲線無擴增或Ct值大于37，結(jié)果為均質(zhì)突變型。FAM曲線成S形，且Ct值小于35，HEX(VIC)曲線成S形，且Ct值小于35，結(jié)果為異質(zhì)突變型。

1.2.5 隨訪 對攜帶12S rRNA A1555G或C1494T突變的個體(年齡：5～32月齡)進行電話隨訪，主要內(nèi)容包括家族史，藥物應(yīng)用史，孩子是否常規(guī)預(yù)防接種疫苗，聽力情況，言語發(fā)育等。并對同期生育的嬰幼兒(攜帶者2倍)進行是否常規(guī)預(yù)防接種疫苗的隨訪。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。采用檢驗的方法比較攜帶突變嬰幼兒組與未攜帶組疫苗接種率的情況，以<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 新生兒聽力篩查結(jié)果 46 376例新生兒均通過了TEOAE和AABR的聽力篩查，未檢出聽力異常新生兒。

2.2 藥物性聾基因篩查結(jié)果

2.2.1 基因突變數(shù)據(jù)分析 線粒體12S rRNA基因檢測結(jié)果中共發(fā)現(xiàn)突變94例，突變攜帶率為0.20%。其中12S rRNA A1555G均質(zhì)突變76例(80.85%)，40例男嬰，36例女嬰；異質(zhì)突變14例(14.89%)，12例男嬰，2例女嬰。C1494T均質(zhì)突變3例(3.19%)，1例男嬰，2例女嬰；異質(zhì)突變1例(1.06%)男嬰。

2.2.2 突變個體家系隨訪分析 94例家系成員無耳聾家族史，無藥物致聾史，攜帶者母親孕期無有毒有害物質(zhì)接觸史。經(jīng)隨訪72例A1555G 均質(zhì)突變(其他4例拒絕)新生兒的母親知情同意后接受了該項檢測進行驗證，72例均遺傳于母親。11例12S rRNA A1555G異質(zhì)突變(其他3例拒絕)，1例C1494T異質(zhì)突變新生兒的母親知情同意后接受了該項檢測，其中10例A1555G異質(zhì)突變和1例C1494T異質(zhì)突變遺傳于母親。1例男嬰12S rRNA A1555G 異質(zhì)突變?yōu)樾掳l(fā)，其母親12S rRNA A1555G為野生型，經(jīng)耳聾基因芯片及測序均證實。

2.3 疫苗接種病例對照隨訪分析 攜帶突變嬰幼兒隨訪到88例，失訪6例，隨訪年齡5～32月齡，88例嬰幼兒家長均知曉禁用氨基糖苷類抗生素，78例按月齡常規(guī)預(yù)防接種疫苗，10例接種部分疫苗(2例幼兒家長擔心致聾未接種，8例幼兒判定為接種禁忌證)，正常接種率88.64%。隨訪同期生育的未攜帶突變的嬰幼兒160例，160例嬰幼兒基本按常規(guī)接種時間接種疫苗(部分嬰幼兒因感冒發(fā)燒的推遲接種)。攜帶突變個體正常疫苗接種率與未攜帶者之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(=16.123，<0.01)。所有隨訪到的嬰幼兒聽力未見異常，言語發(fā)育在同齡水平。

3 討 論

3.1 常規(guī)篩查的意義 常規(guī)的新生兒聽力篩查可以檢出部分聽力障礙患兒，但尚有部分遲發(fā)型聾患者可以通過聽力篩查，當遇到某些誘發(fā)因素時導(dǎo)致聽力受損，比如藥物性聾患者，出生時大部分聽力無異常，只是在生長過程中由于使用氨基糖苷類抗生素導(dǎo)致聽力障礙。因此，為了更加完善聽力篩查工作，早發(fā)現(xiàn)，早預(yù)防，除了進行常規(guī)物理篩查外，聯(lián)合耳聾基因篩查十分必要。研究顯示聯(lián)合篩查可降低聽力障礙漏診率，尤其是提高藥物性、遲發(fā)型聾的檢出率。

mtDNA是人體細胞內(nèi)唯一的核外遺傳物質(zhì)，是細胞能量代謝的來源，亦是氧化磷酸化的中心，對保持細胞正常功能起重要作用。在遺傳性非綜合征性聾中，線粒體遺傳約占2%，其中12S rRNA上的C1494T和A1555G和藥物性聾密切相關(guān)。Prezant等在1例阿拉伯-以色列非綜合征型聾家系中研究指出：1555位于高度保守的小rRNA結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域被2個保守的莖環(huán)切割，當發(fā)生A1555G突變時會破壞小rRNA結(jié)構(gòu)，影響線粒體核糖體的翻譯能力，ATP產(chǎn)量下降，細胞內(nèi)外離子濃度失衡，最終導(dǎo)致線粒體功能障礙。在耳蝸的外毛細胞、支持細胞和血管紋中含有大量的線粒體。在耳蝸底轉(zhuǎn)的外毛細胞含量更多，所以線粒體的功能異常更易影響高頻聽力。

線粒體DNA 12S rRNA A1555G和C1494T位點(分別對應(yīng)E.coli 16S rRNA的1491位點和1409位點)位置相對但并不配對。當發(fā)生A1555G突變或C1494T 突變時， 線粒體核糖體A位形成了一個新的1494-1555G-C或 A-U堿基配對， 使得線粒體12S rRNA基因與E.coli 16S rRNA相應(yīng)解碼區(qū)更加相似， 增強了氨基糖苷類藥物在12S rRNA A位的結(jié)合力。因此，使用氨基糖苷類藥物會導(dǎo)致或加重攜帶A1555G 或 C1494T突變個體的聽力喪失。美國的研究顯示12S rRNA基因 A1555G 突變可以增加耳蝸對氨基糖苷類藥物的敏感性。西班牙的非綜合征型家系調(diào)查研究顯示A1555G 突變與15%～20%的家族性非綜合征型聽力損失有關(guān)，許多年老的家族成員即使沒有使用氨基糖苷類藥物也可發(fā)生聽力下降。在中國群體的研究發(fā)現(xiàn)12S rRNA A1555G和C1494T 突變與藥物性聾有關(guān)。

藥物性聾患者基本都能通過聽力篩查，如果個體攜帶與細菌的核糖體更加相似的1555G 或 1494T突變，則對氨基糖苷類藥物超敏感，當使用氨基糖苷類藥物時導(dǎo)致聾。而且線粒體DNA 12S rRNA突變?yōu)槟赶颠z傳，女性的子代均為突變基因攜帶者，男性個體為攜帶者但不會遺傳給下一代。本研究對46376例在本院分娩的新生兒進行藥物性聾基因篩查發(fā)現(xiàn)A1555G和C1494T突變率為0.20%，雖然低于山西長治(0.35%)，北京市(0.27%)，浙江省長興縣(0.28%)，廣東東莞地區(qū)(0.22%)等地的藥物致聾基因突變率，但高于邯鄲(0.15%)，紹興(0.12%)及廣東省江陽市(0.11%)等地區(qū)。鄭錦等發(fā)現(xiàn)，河南洛陽地區(qū)線粒體DNA 12S rRNA基因變異的陽性攜帶率為0.23%，最常見變異類型為A1555G異質(zhì)性變異；本研究結(jié)果顯示最常見的變異是A1555G 均質(zhì)突變，占80.85%，這也提示突變率和變異類型均可能存在地域差異性。

本研究還發(fā)現(xiàn)10例12S rRNA A1555G異質(zhì)突變(其他3例拒絕)，1例C1494T異質(zhì)突變均遺傳于母親。發(fā)現(xiàn)1例新發(fā)12S rRNA A1555G異質(zhì)突變，其母親在孕期聾基因篩查顯示12S rRNA A1555G為野生型，胎兒出生后做藥物性聾基因檢測為12S rRNA A1555G異質(zhì)突變，并通過聾基因芯片及Sanger測序檢測驗證。首先，目前關(guān)于導(dǎo)致12S rRNA A1555G突變的分子機制尚不明確，因此尚需通過動物實驗、線粒體的功能實驗等研究進一步探索引起12S rRNA A1555G新發(fā)突變的影響因素及相關(guān)機制；其次，目前關(guān)于12S rRNA A1555G新發(fā)突變的發(fā)生率尚無確切數(shù)據(jù)，尚需通過臨床研究進行統(tǒng)計分析；再次，12S rRNA A1555G突變在代代傳遞時是否存在異質(zhì)率增加的情況，比如本例胎兒的母親可能也存在12S rRNA A1555G異質(zhì)突變，但異質(zhì)率尚未達到現(xiàn)有檢測的下限。最后，是否存在生殖腺嵌合？我們將帶著這些疑問開展后期的研究探索。

3.2 隨訪攜帶突變的陽性個體的疫苗接種情況 本研究還對88例陽性個體(6例失訪)進行電話隨訪，隨訪年齡為5～32月齡。88例嬰幼兒家長均已接受用藥指導(dǎo)，78例(88.64%)嬰幼兒已常規(guī)預(yù)防接種疫苗，10例(11.36%)只接種了部分疫苗。隨訪同期生育的未攜帶突變的嬰幼兒160例，均接種疫苗。文獻[20]報道攜帶A1555G等突變的具有遺傳易感性的患者即使用常規(guī)劑量或極小劑量的AmAn即可發(fā)生耳毒性反應(yīng)，可能造成極重度且不可逆轉(zhuǎn)聾；對于兒童而言， 即使輕度聽力損失也會對其言語發(fā)育及心理社會發(fā)育產(chǎn)生不良影響。給藥途徑及局部給藥部位對AmAn耳毒性作用亦有影響，椎管內(nèi)給藥最危險，其次為靜脈和肌內(nèi)注射。鄧水秋等發(fā)現(xiàn)，對于適齡的線粒體A1555G基因突變攜帶女童，最好禁止使用含氨基糖苷類抗生素的疫苗。部分父母擔心孩子注射含有氨基糖苷類抗生素的疫苗會影響孩子聽力，在尚無公開的的指導(dǎo)意見或?qū)＜夜沧R的前提下，選擇放棄接種疫苗。文獻[23]對以往研究進行綜述，尚不能推斷疫苗中痕量的抗生素會導(dǎo)致聾。AEFIIMS數(shù)據(jù)亦未呈現(xiàn)出線粒體12S rRNA位點突變兒童接種疫苗后引起兒童聾的報道。腎臟是氨基糖苷類抗生素排泄的唯一途徑，對于腎臟功能正常的人群，耳毒性抗生素以正常的排泄速率被排出到體外。疫苗中氨基糖苷類抗生素的最大殘留量很低，遠遠低于臨床常規(guī)劑量，在嬰幼兒腎功能正常的前提下，接種疫苗應(yīng)該是相對安全的。本研究隨訪結(jié)果也提示，接種疫苗是相對安全的，若能開展痕量AmAn耳毒性的研究，明確其耳毒性閾值，將有利于指導(dǎo)疫苗中抗生素的殘留量，進一步提高接種疫苗的安全性。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過線粒體聾基因篩查，可從分子水平發(fā)現(xiàn)有可能發(fā)生聽力損傷的新生兒，對藥物性聾高?；純旱慕K生用藥提供指導(dǎo)，避免遲發(fā)聾的發(fā)生，具有重要的社會效益，同時也進一步證實了該疫苗的安全性，為相關(guān)指南的出臺提供臨床依據(jù)。