倪堅(jiān)軍 周中元 蔡鑫君

結(jié)核病由結(jié)核桿菌感染引起，主要侵襲患者肺部，故又稱為肺結(jié)核[1-2]。肺結(jié)核患者中，約45.5%～63.3%合并支氣管內(nèi)膜結(jié)核，由于臨床表現(xiàn)不明顯，誤診、漏診率高，易造成不可逆性支氣管狹窄，嚴(yán)重者將造成呼吸困難、肺不張及繼發(fā)性肺炎等惡性結(jié)局[3-5]。支氣管結(jié)核病灶伴有廣泛纖維增生，周圍血管分布稀少，血運(yùn)不良，嚴(yán)重影響藥物的滲入，藥物治療效果不佳[6-8]。而原位凝膠不需要有機(jī)溶劑或共聚反應(yīng)試劑，組織相容性良好，具有生物黏附性及溶液-半固態(tài)凝膠轉(zhuǎn)變性質(zhì)等特點(diǎn)，且制作工藝簡(jiǎn)便、應(yīng)用方便、在用藥部位滯留時(shí)間長(zhǎng)及有良好緩釋作用，近年來(lái)已被選擇作為諸多藥物載體[9-10]。異煙肼是抗結(jié)核治療藥物的首選，為克服結(jié)核患部血供不足、藥物難以進(jìn)入、難以達(dá)到抗結(jié)核治療有效藥物濃度的困難[11-12]，本研究以泊洛沙姆188（P188）和泊洛沙姆407（P407）為輔料，制備異煙肼溫敏型原位凝膠，用于經(jīng)纖維支氣管鏡介入治療給藥，以提高異煙肼在結(jié)核病灶中的停留時(shí)間和藥物濃度，為支氣管結(jié)核的臨床治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料BALB/c小鼠，雄性，4～6周齡，（20±2）g；SD大鼠，雄性，約250 g；兩者均購(gòu)自上海斯萊克公司，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一飼養(yǎng)，（22±2）℃，濕度50%～60%，14 h光照/10 h黑暗，換風(fēng)15～20次/h。異煙肼標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100578- 201502；異煙肼原料藥購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：R21A6T1；P188（批號(hào)：WPDI608B）、P407（批號(hào)：WPMI556B）、透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量8 000～14 000，型號(hào)：MD34）購(gòu)自上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司；熒光標(biāo)志物Cy5.5 NHS ester購(gòu)自杭州邦易化工有限公司，批號(hào)：H1824065。

1.2 方法

1.2.1 異煙肼溫敏型原位凝膠制備及膠凝溫度測(cè)定采用冷溶法[13]制備異煙肼溫敏型原位凝膠。稱取處方量的異煙肼、P407和P188，加入適量純化水使溶解，混合均勻；4℃放置24 h，充分溶脹后去除氣泡，得到澄清透明、分散均勻的異煙肼溫敏型原位凝膠。采用倒置法[14]測(cè)定膠凝溫度。制備好的異煙肼溫敏型原位凝膠溶液置于西林瓶中，在水浴中慢慢加熱，水浴溫度從35℃開(kāi)始以1℃/min速度升溫，每升溫1℃即取出西林瓶，倒置觀察是否形成凝膠，直到西林瓶中的所有溶液全部變成凝膠，記錄此時(shí)溫度，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.2 原位凝膠處方的優(yōu)化采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法對(duì)異煙肼溫敏型原位凝膠處方進(jìn)行優(yōu)化。以P407、P188的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為自變量（A和B），取值范圍分別為20%～30%和0～6%；以膠凝溫度（T）為因變量。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理，兩因素一指標(biāo)時(shí)，每個(gè)因素設(shè)5個(gè)水平，分別為±α、±1和0（α=1.414），見(jiàn)表1。采用Design-Expert 10.0.3軟件進(jìn)行二元多項(xiàng)式回歸方程擬合，軟件擬合的回歸方程為T(mén)=132.823-6.464A+1.992B+0.066AB+0.088A2-0.364B2（R2=0.947 1），各項(xiàng)方差分析結(jié)果顯示模型P＜0.01時(shí)認(rèn)為該模型可靠有效。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

采用Design-Expert 10.0.3軟件生成二維等高線圖，得到備選處方；利用1.2.1方法制備異煙肼溫敏型原位凝膠并測(cè)定膠凝溫度，與預(yù)測(cè)值比較，計(jì)算偏差=（預(yù)測(cè)值-實(shí)測(cè)值）/預(yù)測(cè)值×100%。偏差最小的處方確定為最優(yōu)處方。

1.2.3 優(yōu)化處方制備的異煙肼溫敏型原位凝膠中異煙肼含量測(cè)定采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）法測(cè)定異煙肼溫敏型原位凝膠中異煙肼的含量。色譜條件：Agilent SB-C18色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.02 mol/L磷酸氫二鈉（pH 6.0）-甲醇（體積比85∶15），流速1.0 ml/min，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)262 nm，進(jìn)樣量10 μl。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；以350℃氮?dú)庾鳛楦稍餁?，控制流速及霧化器壓力分別為12 ml/min，241.3 kPa，毛細(xì)管及解離能量分別為4 000 V及100 eV，碰撞能量36 eV及28 eV。在多反應(yīng)檢測(cè)模式下檢測(cè)離子濃度，停留時(shí)間設(shè)置為550 ms。利用異煙肼標(biāo)準(zhǔn)品制備1.015 g/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用流動(dòng)相分別稀釋成1015.00、507.50、304.50、203.00、101.50、81.20、60.90、40.60、20.30、10.15 mg/L的異煙肼標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用LC-MS/MS法分別檢測(cè)各標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，建立異煙肼質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用LC-MS/MS方法測(cè)定優(yōu)化處方后制備的異煙肼溫敏型原位凝膠的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算凝膠中異煙肼質(zhì)量濃度。

1.2.4 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)精密移取高（1 000 mg/L）、中（90 mg/L）、低（8 mg/L）3個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用LC-MS/MS測(cè)定各對(duì)照品溶液的峰面積，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。精密配制異煙肼原位凝膠溶液，濃度約為110 mg/L共5份，檢測(cè)每份樣品的峰面積，分析該測(cè)定方法的重復(fù)性。檢測(cè)同一份異煙肼原位凝膠溶液放置0、1、2、4、8、12、24 h后的峰面積，考察異煙肼原位凝膠溶液的穩(wěn)定性。重復(fù)性、精密度等試驗(yàn)要求相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation,RSD）不超過(guò)2.0%。

1.2.5 異煙肼溫敏型原位凝膠體外釋放試驗(yàn)精密吸取5 ml異煙肼溫敏型原位凝膠加入透析袋內(nèi)，扎緊袋口，放入裝有100 ml PBS[pH 7.4，（37±1）℃]溶液的廣口瓶中。采用LC-MS/MS法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)（15、30、45、60、75、90、120、150、180、240、270、300 min）PBS溶液中異煙肼的濃度，計(jì)算相對(duì)累積釋放率。以異煙肼水溶液為對(duì)照。利用零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、Weibull方程等對(duì)異煙肼溫敏型原位凝膠體外溶蝕曲線進(jìn)行擬合。

1.2.6 異煙肼溫敏型原位凝膠藥效學(xué)研究采用小鼠活體成像實(shí)驗(yàn)。取6只BALB/c小鼠，隨機(jī)分成A組和B組，每組3只。A組使用Cy5.5 NHS ester標(biāo)記的異煙肼溫敏型原位凝膠，B組使用Cy5.5 NHS ester標(biāo)記的異煙肼水溶液。利用氣管注射給藥，20 μl/只，具體操作如下：小鼠麻醉后，嘴巴張開(kāi)固定，將Exel SafeletⅣ導(dǎo)管插入氣管，取出導(dǎo)管上的針頭，將小鼠移入生物安全柜，用吸管將異煙肼原位凝膠或異煙肼水溶液注入導(dǎo)管開(kāi)口，小鼠吸入凝膠或水溶液后，取出導(dǎo)管，將小鼠置于加熱燈下恢復(fù)。給藥完成后觀察小鼠狀態(tài)，于0、0.5、1、2、4、7、72 h時(shí)拍攝，檢測(cè)Cy5.5 NHS ester熒光分布、強(qiáng)度及小鼠生理情況。

1.2.7 異煙肼溫敏型原位凝膠藥動(dòng)學(xué)研究取10只SD大鼠隨機(jī)分為A組和B組，每組5只。A組使用異煙肼溫敏型原位凝膠，B組使用異煙肼水溶液，氣管注射給藥，注射劑量為16 mg/kg（按異煙肼劑量計(jì)算），200 μl/只。分別于給藥后15、30、60、120、180、240、360 min時(shí)眼眶取血，離心后取上層血漿，利用LC-MS/MS法檢測(cè)兩組大鼠血漿中異煙肼質(zhì)量濃度，繪制血漿異煙肼質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線圖，利用WinNolin軟件計(jì)算異煙肼溫敏型原位凝膠的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

1.2.8 大鼠血樣中異煙肼含量的測(cè)定利用LC-MS/MS法，色譜條件與1.2.3一致。精密稱取異煙肼標(biāo)準(zhǔn)品10.05 mg，用純化水溶解，定容至10 ml，制成1.005 g/L的儲(chǔ)備液，將儲(chǔ)備液分別稀釋為10.05、20.10、40.20、100.50、201.00、502.50 mg/L的異煙肼標(biāo)準(zhǔn)液。精密量取空白血漿200 μl于離心管，再加l00 μl上述不同濃度的異煙肼標(biāo)準(zhǔn)液，加700 μl甲醇沉淀蛋白，配制成濃度為1.005、2.010、4.020、10.05、20.10、50.25 mg/L的溶液。將上述溶液旋渦混合1 min后，用高速離心機(jī)（5 000 r/min）離心8 min后，取上清液，過(guò)0.22 μm的濾膜后，進(jìn)樣。利用測(cè)得峰面積與配制的異煙肼血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度計(jì)算線性回歸方程。精密量取樣品血漿100 μl于離心管，加400 μl甲醇沉淀蛋白，旋渦混合1 min后，用高速離心機(jī)（5 000 r/min）離心8 min后，取上清液，過(guò)0.22 μm的濾膜。利用LCMS/MS法測(cè)定大鼠血漿的峰面積，計(jì)算大鼠血漿中的異煙肼含量。精密度、重復(fù)性、回收率實(shí)驗(yàn)參考1.2.4。精密度、重復(fù)性、回收率等試驗(yàn)要求RSD不超過(guò)2.0%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t或SNK-q分析。采用Design-Expert 10.0.3軟件繪制自變量與因變量三維曲面圖及等值線圖。采用WinNonlin 6.4軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異煙肼原位凝膠最優(yōu)處方的選擇當(dāng)P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)恒定時(shí)，隨著P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，膠凝溫度逐漸下降；當(dāng)P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)恒定時(shí)，隨著P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，膠凝溫度逐漸升高，見(jiàn)圖1。以略低于人體體溫的35℃作為膠凝溫度，生成3個(gè)優(yōu)化處方：處方1中P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.0%、P188為3.5%；處方2中P407為24.0%、P188為2.2%；處方3中P407為23.0%、P188為1.3%。利用篩選出的3個(gè)處方制備異煙肼溫敏型原位凝膠，測(cè)定膠凝溫度，并利用回歸方程擬合對(duì)應(yīng)的膠凝溫度。結(jié)果顯示，處方1即P407為25.0%、P188為3.5%時(shí)，膠凝溫度偏差最小，即處方1為最優(yōu)處方，見(jiàn)表2。

表2 異煙肼溫敏型原位凝膠處方膠凝溫度驗(yàn)證

圖1 P407、P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)膠凝溫度的影響（a：等高線圖；b：維曲面圖）

2.2 優(yōu)化處方制備的異煙肼溫敏型原位凝膠中異煙肼質(zhì)量濃度測(cè)定LC-MS/MS法測(cè)定優(yōu)化處方后制備的異煙肼溫敏型原位凝膠的含量，以A為峰面積，C為藥物濃度，得到線性回歸方程為A=17.221C-1.949 1（R2=1.000 0）。精密度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高（1 000 mg/L）、中（90 mg/L）、低（8 mg/L）3個(gè)濃度的異煙肼溶液RSD分別為0.103%、0.272%、0.471%；重復(fù)性考察發(fā)現(xiàn)檢測(cè)5份相同濃度的異煙肼溶液的RSD為0.550%，說(shuō)明建立的方法符合方法學(xué)要求。穩(wěn)定性檢查發(fā)現(xiàn)檢測(cè)同一份異煙肼原位凝膠溶液放置0、1、2、4、8、12、24 h后的峰面積RSD為0.210%，表明制備的異煙肼溫敏型原位凝膠的含量在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 優(yōu)化處方制備的異煙肼溫敏型原位凝膠體外釋藥比較異煙肼水溶液在60 min時(shí)藥物已基本釋放完全，累積釋放百分率為94.40%；優(yōu)化處方后制備的異煙肼溫敏型原位凝膠在30 min時(shí)，累積釋放百分率為55.18%，120 min后釋藥曲線漸趨平穩(wěn)，累積釋放百分率為81.90%，300 min時(shí)累積釋放百分率為84.35%，見(jiàn)圖2。

圖2 異煙肼水溶液和異煙肼溫敏型原位凝膠的體外釋放曲線

2.4 異煙肼溫敏型原位凝膠的藥效學(xué)氣管注射后，兩組小鼠狀態(tài)良好，均未出現(xiàn)因阻塞氣道致死的情況。小鼠給藥后0、0.5、1、2、4、7、72 h的活體成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A組小鼠體內(nèi)的Cy5.5 NHS ester熒光信號(hào)較B組小鼠強(qiáng)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，兩組小鼠體內(nèi)的熒光信號(hào)均逐漸降低，但A組降低速度慢于B組。給藥后0.5～4 h兩組小鼠熒光信號(hào)強(qiáng)度差異最大。檢測(cè)熒光信號(hào)分布情況發(fā)現(xiàn)，兩組熒光信號(hào)定位都較為準(zhǔn)確，表明注射的藥物未出現(xiàn)脫離給藥部位情況，見(jiàn)圖3。

2.5 異煙肼溫敏型原位凝膠的藥動(dòng)學(xué)以A為峰面積，C為藥物濃度，使用LC-MS/MS法建立的線性回歸方程為A=28.476C-16.45（R2=0.999），線性范圍為1.005～50.250 mg/L。精密度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高（50.250 mg/L）、中（10.050 mg/L）、低（2.010 mg/L）3個(gè)濃度的異煙肼血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的RSD分別為0.70%、1.20%、0.83%，重復(fù)性考察發(fā)現(xiàn)檢測(cè)5份相同濃度的異煙肼血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的RSD為1.050%，說(shuō)明建立的方法符合方法學(xué)要求?；厥章蕦?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)精密移取適量的高、中、低質(zhì)量濃度的異煙肼血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液，回收率平均為98.26%，RSD為1.610%。說(shuō)明該方法適用于血漿中異煙肼含量的測(cè)定。

LC-MS/MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩組大鼠體內(nèi)異煙肼的藥物濃度均在給藥后30 min達(dá)峰，峰濃度分別為（40.28±0.43）和（6.35±0.63）mg/L（P＜0.05）；隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，兩組大鼠體內(nèi)異煙肼濃度逐漸降低，見(jiàn)圖4。計(jì)算兩組大鼠體內(nèi)異煙肼的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)A組大鼠體內(nèi)異煙肼的AUC0-∞是B組的2.82倍，B組的異煙肼清除率（CL）是A組的1.41倍，見(jiàn)表3。

表3 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

圖4 異煙肼濃度-時(shí)間曲線

3 討論

結(jié)核病中肺結(jié)核最為常見(jiàn)，而其中有近一半為支氣管結(jié)核[15-16]。支氣管結(jié)核由結(jié)核桿菌感染引起，感染途徑分為肺結(jié)核病灶中直接植入支氣管黏膜和通過(guò)支氣管周邊組織直接侵及[17-19]。支氣管結(jié)核病治療周期長(zhǎng)，傳統(tǒng)給藥方式下患者治療依從性較差，使得病菌產(chǎn)生耐藥性，加大治療難度[20-22]。采用原位凝膠進(jìn)行治療，可使藥物緩慢釋放，無(wú)需頻繁給藥，提高治療效果。本研究通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法，以P407和P188為影響因素，膠凝溫度為因變量，對(duì)異煙肼溫敏型原位凝膠處方進(jìn)行了優(yōu)化，彌補(bǔ)了原有凝膠制備方法中膠凝溫度高、毒性大的缺點(diǎn)。相比異煙肼水溶液，優(yōu)化處方后制備的異煙肼原位凝膠在小鼠體內(nèi)具有更高的藥物濃度，且清除率低，具有緩釋的效果，為臨床異煙肼治療支氣管結(jié)核提供了新思路。

P407及P188被用來(lái)優(yōu)化原位凝膠處方，使達(dá)到最佳凝膠溫度[23]。研究表明，凝膠溫度與P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)負(fù)相關(guān)，與P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)正相關(guān)[24-25]，與本研究結(jié)果相似，因此調(diào)節(jié)P407和P188在凝膠處方中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可調(diào)節(jié)凝膠溫度。當(dāng)P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤20%時(shí)，P188用量即使極低，膠凝溫度也高于人體正常體溫（37℃），而當(dāng)P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥30%，P407無(wú)法完全溶脹，且膠凝溫度低于室溫（25℃），需大量P188才能達(dá)到較為理想的膠凝溫度。故本研究中設(shè)定P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～30%，P188為0～6%，避免了溶脹及用量過(guò)大等問(wèn)題。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化異煙肼溫敏型原位凝膠處方并確定最優(yōu)處方中P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.0%、P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%，發(fā)生相轉(zhuǎn)變溫度為34.2℃。該溫度高于環(huán)境溫度且低于人體溫度，為異煙肼溫敏型原位凝膠應(yīng)用提供了前提。

注：A組使用異煙肝溫敏型原位凝膠；B組使用異煙肼水溶液

作為治療支氣管結(jié)核藥物，異煙肼需從溫敏型原位凝膠中釋放，且在病灶部位停留較長(zhǎng)時(shí)間，即藥物需要具備一定緩釋能力。本研究考察了優(yōu)化處方后制備的異煙肼溫敏型原位凝膠體外釋放及滯留能力，結(jié)果顯示給藥后120 min，凝膠中異煙肼累積釋藥率達(dá)84.35%，釋放時(shí)間長(zhǎng)于水溶液（60 min）。異煙肼原位凝膠釋藥曲線符合Weibull方程，與張利竣等[24]研究相似，表明本研究制備的凝膠釋藥緩慢、持久，且釋藥完全。在使用時(shí)可使藥效充分發(fā)揮，減少用藥次數(shù)。小鼠活體成像結(jié)果也顯示該處方制備的異煙肼溫敏型原位凝膠安全性好，在給藥部位滯留時(shí)間長(zhǎng)。藥動(dòng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，采用氣管注射方式給藥，相比水溶液，溫敏型原位凝膠血藥峰濃度較大，消除較慢，藥物代謝時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)支氣管結(jié)核的治療效果也更好[25]。本研究中，凝膠組異煙肼質(zhì)量濃度是水溶液組的6.3倍，之后隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組小鼠體內(nèi)異煙肼濃度逐漸降低，但其具體原因尚未完全明確，還需后續(xù)深入研究，探討其具體機(jī)制。

綜上所述，本研究?jī)?yōu)化處方制備的溫敏型原位凝膠可提高藥物治療濃度，延長(zhǎng)藥物維持時(shí)間，減少用藥次數(shù)，臨床價(jià)值較好，且能避免臨床上用藥不足、不按時(shí)及不足療程等問(wèn)題。