沈翀 閻家駿 任煜

膀胱癌（bladder cancer,BC）是世界范圍內(nèi)常見腫瘤之一。隨著人口增長(zhǎng)和老齡化的增加，BC發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，每年新增約55萬病例[1]。根據(jù)腫瘤侵犯是否超過膀胱肌層可將BC分為肌層浸潤(rùn)型和非肌層浸潤(rùn)型，隨著醫(yī)療科技水平的提高，不同類型BC的治療方式都有了很大改進(jìn)，術(shù)后患者生存率也有了極大提高[2-3]。但BC的進(jìn)展預(yù)測(cè)和術(shù)后復(fù)發(fā)仍是目前臨床難點(diǎn)，亟需尋找新的臨床標(biāo)志物或治療策略。微小RNA（micro-RNA,miR）是一類非編碼RNA，能在腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路中起信號(hào)阻遏或激活作用，并調(diào)控腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解[4-6]?，F(xiàn)階段研究認(rèn)為，miR的異常表達(dá)與泌尿系統(tǒng)腫瘤發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)[7-8]，故極有潛力作為BC的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物。研究表明，miR-142-3p在BC細(xì)胞及組織內(nèi)低表達(dá)，與BC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力增強(qiáng)有關(guān)[9-11]，但miR-142-3p對(duì)BC的有氧糖酵解作用未知。本研究利用體外BC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-142-3p，以明確miR-142-3p對(duì)BC細(xì)胞增殖和糖酵解的影響，并探究其可能的作用靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人輸尿管上皮細(xì)胞株SV-HUC-1和人BC細(xì)胞株SW780、UMUC3、T24、BIU87均購(gòu)自賽百慷生物技術(shù)有限公司；使用含10 % FBS的培養(yǎng)基，在37℃、5%二氧化碳（CO2）條件下培養(yǎng)。每1～2 d進(jìn)行細(xì)胞傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：AE29 163439；CCK-8試劑盒購(gòu)自美國(guó)MCE公司，批號(hào)：092820 210318；葡萄糖和乳酸含量微量法檢測(cè)試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白定量試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為20210711、20210813、20210623、20 210808；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase,CDK）4、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）A、磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity公司，批號(hào)分別為38f4541、47o1025、25s1685；細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，批號(hào)：9 312877；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自中國(guó)康為世紀(jì)科技股份有限公司，批號(hào)：36320；2-NBDG葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：GR3347285-12。

1.2 方法

1.2.1 5組細(xì)胞miR-142-3p表達(dá)的檢測(cè)采用qPCR法。5組細(xì)胞分別加入Trizol勻漿管中裂解，提取RNA。42℃，15 min；85℃，5 min，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。miR-142-3p引 物 為F：5'-CAAACTCAAGGAGCAACACCG-3'，R：5'-TAAGTGTAGTAAACCACTCGTG-3'；U6引物為F：5'-GATTATCGGGACCATTCCACTG-3'，R：5'-GATCTGGTTCCCAATGACTGTG-3'。95℃，10 min變性；95℃，15 s；60℃，60 s條件下循環(huán)40次。U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析計(jì)算各組細(xì)胞miR-142-3p相對(duì)表達(dá)量。選取極低表達(dá)miR-142-3p的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 miR-142-3p質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及表達(dá)檢測(cè)美國(guó)國(guó)家生物信息中心（national center for biotechnology information,NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)獲取miR-142-3p基因序列，PCR法擴(kuò)增序列，雙酶切法將基因片段和空白質(zhì)粒連接構(gòu)建miR-142-3p質(zhì)粒。將空白質(zhì)粒和miR-142-3p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至選取的細(xì)胞內(nèi)，5種細(xì)胞均各分為質(zhì)粒對(duì)照組和miR-142-3p轉(zhuǎn)染組，正常培養(yǎng)24～48 h。采用qPCR法測(cè)定各組細(xì)胞miR-142-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 細(xì)胞克隆的檢測(cè)采用平板克隆實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液，接種于含30%FBS的完全培養(yǎng)基的12孔板中?？字袉慰寺〖?xì)胞數(shù)量＞50個(gè)時(shí)，PBS洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定1 h。PBS清洗細(xì)胞，純凈結(jié)晶紫染液染色2 min，拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)量。

1.2.4 細(xì)胞活性的檢測(cè)采用CCK-8法。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞制備懸液，接種于96孔板中培養(yǎng)24 h。按照CCK-8試劑盒方法加入CCK-8試劑，繼續(xù)于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。完成后取出，檢測(cè)450 nm處各孔細(xì)胞吸光度（optical density，OD），根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD450-空白組OD450）/（對(duì)照組OD450-空白組OD450）。

1.2.5 細(xì)胞周期檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)。PBS清洗轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，消化細(xì)胞，待消化結(jié)束時(shí)血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。1 000 r/min離心3 min，棄上清液。1 ml PBS重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心3 min，棄上清液。500 μl DNA染液和5 μl破膜劑，室溫避光孵育細(xì)胞30 min，離心，吸棄300 μl上清液。PBS重懸細(xì)胞，過300目濾膜，移至新離心管。使用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)不同周期的細(xì)胞數(shù)量及比例。

1.2.6 細(xì)胞糖酵解的檢測(cè)（1）細(xì)胞葡萄糖攝取能力的檢測(cè)：采用2-NBDG攝取實(shí)驗(yàn)，按照葡萄糖檢測(cè)試劑盒方法，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于96孔板孵育48 h后，加入2-NBDG孵育10 min。在激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)（Ex/Em）為488/520的條件下測(cè)定熒光值。以各組熒光強(qiáng)度/空白值表示細(xì)胞葡萄糖消耗量。（2）細(xì)胞乳酸生成量的檢測(cè)：按照乳酸含量檢測(cè)試劑盒方法檢測(cè)細(xì)胞的乳酸生成量。

1.2.7 miR-142-3p與CDK4、LDHA靶向性預(yù)測(cè)及驗(yàn)證使用Target Scan（https://www.targetscan.org/）進(jìn)行miR-142-3p與野生（wild-type,WT）型和變異（mutate,Mut）型的CDK4、LDHA基因靶向預(yù)測(cè)。采用雙熒光酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行靶向性驗(yàn)證。miR-142-3p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞預(yù)先鋪板培養(yǎng)16 h，構(gòu)建WT、Mut型的CDK4-3'端非翻譯區(qū)（3'UTR）和LDHA-3'UTR的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至鋪板細(xì)胞中，6 h更換1次培養(yǎng)基。48 h后，裂解細(xì)胞并加至黑色酶標(biāo)板中，加入檢測(cè)反應(yīng)液共培養(yǎng)30 min，測(cè)定報(bào)告質(zhì)粒熒光值，進(jìn)行miR-142-3p與CDK4、LDHA的靶向性驗(yàn)證。

1.2.8 CDK4與LDHA表達(dá)的檢測(cè)采用Western blot法。PBS清洗并收集低表達(dá)miR-142-3p細(xì)胞及miR-142-3p轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞。使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，4℃，12 000 g離心5 min，提取上清液。按照BCA蛋白定量試劑盒方法檢測(cè)樣品中總蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚氟乙烯膜（PVDF），5%脫脂奶粉振蕩孵育2 h，洗滌緩沖液清洗。將PVDF膜放入含有CDK4與LDHA抗體的稀釋液中，4℃振蕩過夜。TBST清洗，加二抗。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影，chemi capture軟件拍照并分析，計(jì)算各組細(xì)胞中CDK4與LDHA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.9 CDK4與LDHA的質(zhì)粒構(gòu)建、過表達(dá)及相應(yīng)檢測(cè)采用PCR法擴(kuò)增CDK4和LDHA基因序列，構(gòu)建CDK4、LDHA質(zhì)粒。miR-142-3p轉(zhuǎn)染的BC細(xì)胞分為miR-142-3p+空白載體組、miR-142-3p+CDK4組、miR-142-3p+LDHA組，將空白質(zhì)粒、CDK4過表達(dá)質(zhì)粒和LDHA過表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至對(duì)應(yīng)組別細(xì)胞中，培養(yǎng)24～48 h。采用2-NBDG攝取實(shí)驗(yàn)，有氧糖酵解產(chǎn)物檢測(cè)，CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組細(xì)胞2-NBDG熒光值、葡萄糖消耗量、乳酸生產(chǎn)量和細(xì)胞活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-142-3p在5組細(xì)胞中表達(dá)的比較與SVHUC-1細(xì)胞相比，miR-142-3p在BIU87、SW780細(xì)胞中顯著低表達(dá)（均P＜0.05），在UMUC3細(xì)胞和T24細(xì)胞中極顯著低表達(dá)（均P＜0.01），見表1。故本研究選取T24、UMUC3細(xì)胞構(gòu)建過表達(dá)miR-142-3p的BC細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 miR-142-3p在5組細(xì)胞中表達(dá)的比較

2.2 miR-142-3p對(duì)UMUC3和T24細(xì)胞增殖影響的比較與質(zhì)粒對(duì)照組相比，miR-142-3p轉(zhuǎn)染組的T24和UMUC3細(xì)胞miR-142-3p相對(duì)表達(dá)量顯著升高（均P＜0.01），細(xì)胞克隆數(shù)顯著減少（均P＜0.01），細(xì)胞存活率在24 h及之后顯著下降（P＜0.05），見圖1。

2.3 miR-142-3p轉(zhuǎn)染對(duì)UMUC3和T24細(xì)胞周期影響的比較與質(zhì)粒對(duì)照組相比，miR-142-3p轉(zhuǎn)染組的T24和UMUC3細(xì)胞滯于G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加（均P＜0.01），而滯于S期和G2/M期的細(xì)胞比例明顯下降（P＜0.05），見圖2。

圖2 過表達(dá)miR-142-3p對(duì)2種BC細(xì)胞周期的影響（a：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期；b：過表達(dá)miR-142-3p的2種BC細(xì)胞不同細(xì)胞周期細(xì)胞比例）

2.4 miR-142-3p對(duì)UMUC3和T24細(xì)胞有氧糖酵解影響的比較與質(zhì)粒對(duì)照組相比，miR-142-3p轉(zhuǎn)染組T24、UMUC3細(xì)胞的2-NBGD熒光強(qiáng)度顯著減弱、葡萄糖消耗量顯著下降（均P＜0.01），乳酸生成量顯著下降（P＜0.01），見圖3。

圖3 過表達(dá)miR-142-3p對(duì)2種BC細(xì)胞有氧糖酵解的影響（a：過表達(dá)miR-142-3p對(duì)2種BC細(xì)胞2-NBDG熒光強(qiáng)度的影響；b：過表達(dá)miR-142-3p對(duì)2種BC細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響；c：過表達(dá)miR-142-3p對(duì)2種BC細(xì)胞乳酸生成量的影響）

2.5 miR-142-3p與不同型CDK4和LDHA基因靶向性預(yù)測(cè)及驗(yàn)證miR-142-3p與野生型的CDK4和野生型LDHA基因的部分基因序列靶向關(guān)聯(lián)。與質(zhì)粒對(duì)照組相比，miR-142-3p轉(zhuǎn)染組的野生型CDK4和LDHA熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶相對(duì)活性顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），而變異型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的熒光酶相對(duì)活性無明顯變化（均P＞0.05），見圖4。

圖4 miR-142-3p與不同型CDK4和LDHA基因序列的靶向預(yù)測(cè)及驗(yàn)證（a：miR-142-3p與不同型CDK4和LDHA基因的預(yù)測(cè)結(jié)果；b：不同型CDK4或LDHA與miR-142-3p結(jié)合后熒光素酶活性的影響）

注：miR為微小RNA；BC為膀胱癌；*P＜0.05，**P＜0.01

2.6 miR-142-3p對(duì)UMUC3和T24細(xì) 胞CDK4和LDHA蛋白表達(dá)的影響與質(zhì)粒對(duì)照組相比，miR-142-3p轉(zhuǎn)染組T24和UMUC3細(xì)胞CDK4和LDHA蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖5。

圖5 過表達(dá)miR-142-3p對(duì)2種BC細(xì)胞有氧糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（a1和b1：蛋白電泳圖；a2和b2：過表達(dá)miR-142-3p對(duì)2種BC細(xì)胞CDK4、LDHA蛋白表達(dá)的影響）

2.7 CDK4和LDHA過表達(dá)對(duì)miR-142-3p轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞的影響與miR-142-3p+空白載體組相比，miR-142-3p+CDK4組和miR-142-3p+LDHA組細(xì)胞的2-NBDG熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P＜0.01）、葡萄糖消耗量顯著上升（P＜0.01），乳酸生成量顯著上升（P＜0.01），48 h及之后細(xì)胞存活率顯著上升（P＜0.01），見圖6。

圖6 過表達(dá)CDK4或LDHA對(duì)miR-142-3p轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞糖酵解、增殖的影響（a：過表達(dá)CDK4或LDHA對(duì)miR-142-3p轉(zhuǎn)的T24細(xì)胞2-NBDG熒光強(qiáng)度的影響；b：過表達(dá)CDK4或LDHA對(duì)miR-142-3p轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響；c：過表達(dá)miR-142-3p對(duì)2種BC細(xì)胞乳酸生成量的影響；d：過表達(dá)CDK4或LDHA對(duì)miR-142-3p轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞存活率的影響）

3 討論

“瓦博格效應(yīng)”為腫瘤細(xì)胞優(yōu)先選擇低效產(chǎn)能的糖酵解途徑來滿足快速代謝需求，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞需攝取更多葡萄糖，生成更多乳酸，而過量的乳酸能夠提供腫瘤細(xì)胞增殖和線粒體代謝[12-13]。據(jù)此，靶向有氧糖酵解途徑的各種關(guān)鍵酶及相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以抑制腫瘤細(xì)胞增殖為腫瘤治療帶來了新的方向[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-142-3p在BC細(xì)胞中顯著低表達(dá)，提示miR142-3p在BC細(xì)胞中極可能具有抑癌作用。

既往研究表明，miR-142-3p通過調(diào)控BC細(xì)胞周期變化、誘導(dǎo)凋亡，抑制細(xì)胞的增殖和侵襲[8-10]。本研究將構(gòu)建的miR-142-3p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BC細(xì)胞系的T24和UMUC3細(xì)胞后，2種BC細(xì)胞活性及克隆增殖能力均顯著下降，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，驗(yàn)證了miR-142-3p具有調(diào)控BC細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖的作用。本研究發(fā)現(xiàn)miR-142-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能夠減弱BC細(xì)胞的2-NBDG葡萄糖熒光強(qiáng)度，減少細(xì)胞葡萄糖消耗及乳酸生成，提示miR-142-3具有抑制BC細(xì)胞攝取葡萄糖、調(diào)控有氧糖酵解的作用。

腫瘤細(xì)胞的快速增殖依賴于大量能量物質(zhì)，而糖酵解正是腫瘤細(xì)胞異常能量需求的主要來源[14，16]。研究顯示miR-142-3p能夠通過調(diào)節(jié)有氧糖酵解抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力[17]。生物體內(nèi)的有氧糖酵解途徑涉及多過程，并有多種酶的參，LDHA是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，還可參與腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)控，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展極為密切[5，18]。研究表明，LDHA可在miR的調(diào)控下影響腫瘤細(xì)胞糖代謝，起到抑制細(xì)胞增殖的作用[19]。Hua等[20]發(fā)現(xiàn)miR-142-3p可以靶向LDHA調(diào)控有氧糖酵解抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。CDK4是調(diào)控是腫瘤細(xì)胞從G1期進(jìn)入下一細(xì)胞周期的重要信號(hào)分子，而有氧糖酵解可為腫瘤細(xì)胞周期改變提供所需能量[21]。研究顯示，乳腺癌細(xì)胞對(duì)CDK4抑制劑的耐藥性增加可導(dǎo)致細(xì)胞的有氧糖酵解加強(qiáng)[22]。研究表明，miR-142-3p能夠靶向CDK4調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期[23]?；蚨鄳B(tài)性與癌癥相關(guān)[24]，野生型基因是自然界中最常見的基因類型。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p能與野生型的CDK4和野生型的LDHA基因結(jié)合，且過表達(dá)miR-142-3p可抑制BC細(xì)胞CDK4和LDHA的蛋白表達(dá)，提示CDK4和LDHA是miR-142-3p的作用靶點(diǎn)。如前所述，CDK4或LDHA的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，LDHA可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞糖酵解[20]，而LDHA和CDK4對(duì)BC細(xì)胞糖酵解的作用還未明確。本研究比較了過表達(dá)CDK4或LDHA對(duì)miR-142-3p轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞有氧糖酵解和活性的影響，結(jié)果顯示，CDK4或LDHA過表達(dá)能夠上調(diào)miR142-3p轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞的葡萄糖攝取能力，增加細(xì)胞的葡萄糖消耗量和乳酸生成量，并促進(jìn)細(xì)胞的活性，表明CDK4或LDHA表達(dá)可促進(jìn)BC細(xì)胞的有氧糖酵解和增殖、逆轉(zhuǎn)miR-142-3p對(duì)BC細(xì)胞糖酵解和增殖的抑制。而miR-142-3p可抑制BC細(xì)胞CDK4和LDHA蛋白的表達(dá)，故通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)miR-142-3p通過靶向抑制CDK4和LDHA表達(dá)發(fā)揮對(duì)BC細(xì)胞增殖和糖酵解的抑制作用。

綜上所述，本研究明確了miR-142-3p可通過靶向LDHA和CDK4抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和有氧糖酵解，為miR-142-3p可作為抑制BC細(xì)胞有氧糖酵解的治療靶點(diǎn)提供了潛在依據(jù)。但本研究?jī)H在體外開展了初步研究，后續(xù)還需要更多研究進(jìn)一步明確miR-142-3p對(duì)膀胱癌的治療作用，以及預(yù)后價(jià)值。