陳曉宇 朱連勤 陳 甫 張貝貝 朱風(fēng)華*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島266109)

羅伊氏乳桿菌具有增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能的作用。Hou等[1]報(bào)道，羅伊氏乳桿菌I5007可增強(qiáng)T細(xì)胞分化并誘導(dǎo)回腸細(xì)胞因子表達(dá)，表明該菌株可調(diào)節(jié)斷奶仔豬的免疫功能。Yang等[2]給仔豬補(bǔ)充羅伊氏乳桿菌后，提高了仔豬的血漿白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、干擾素-α(interferon-α，IFN-α)、干擾素-β(interferon-β，IFN-β)含量。Tang等[3]認(rèn)為羅伊氏乳桿菌通過調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等的含量，實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)。羅伊氏乳桿菌可增強(qiáng)動(dòng)物抗氧化能力。Hou等[1]報(bào)道，羅伊氏乳桿菌在體外可有效清除自由基，并可用于緩解氧化應(yīng)激；給生長(zhǎng)肥育豬補(bǔ)充羅伊氏乳桿菌可提高血漿超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性，降低丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。Yang等[2]報(bào)道，給仔豬補(bǔ)充羅伊氏乳桿菌可降低血漿MDA含量，提高血漿SOD活性和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)，改善了機(jī)體抗氧化能力。Kolling等[4]發(fā)現(xiàn)，小鼠補(bǔ)充鼠李糖乳桿菌肽聚糖后，顯著提高了呼吸道TNF-α和白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)含量，降低了肺炎球菌的感染，發(fā)揮了明顯的黏膜免疫調(diào)節(jié)作用。也有研究報(bào)道，嗜酸乳桿菌肽聚糖通過激活Toll樣受體2(Toll-like receptors 2，TLR2)信號(hào)識(shí)別，改善調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)/輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)失衡，誘導(dǎo)Treg免疫反應(yīng)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[5]。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，肽聚糖能顯著提高三齒鱟血液SOD活性和T-AOC，并提高了機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的代償能力和自由基代謝狀態(tài)。羅伊氏乳桿菌是通過何種菌體成分或代謝產(chǎn)物發(fā)揮抗氧化損傷和調(diào)節(jié)免疫功能的尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過在蛋雛雞飼糧中添加不同劑量的羅伊氏乳桿菌肽聚糖，研究其對(duì)蛋雛雞生長(zhǎng)性能、免疫功能和抗氧化能力的影響，以期為羅伊氏乳桿菌肽聚糖在生產(chǎn)中應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取96只1日齡健康的海蘭褐蛋雛雞，隨機(jī)分為4個(gè)組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加250、500和1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖。試驗(yàn)期42 d。羅伊氏乳桿菌肽聚糖為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)病與中毒病實(shí)驗(yàn)室制備，其肽聚糖純度為97.75%?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)雞自由采食、飲水。7日齡時(shí)對(duì)試驗(yàn)雞進(jìn)行新城疫Ⅳ系、傳染性支氣管炎H120二聯(lián)弱毒苗滴鼻點(diǎn)眼免疫；14日齡時(shí)對(duì)試驗(yàn)雞進(jìn)行傳染性法氏囊病弱毒疫苗飲水免疫，雙倍量飲水。雞舍溫度在前5 d保持在32～34 ℃，然后每周以2 ℃的速度逐漸下降，最終室溫控制在22～24 ℃。按照消毒程序規(guī)范消毒。每日觀察試驗(yàn)雞的精神狀態(tài)、行為表現(xiàn)、糞便狀況。在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)各組的試驗(yàn)條件保持一致。

1.3 試驗(yàn)材料

GSH-Px、SOD、T-AOC、MDA、免疫球白蛋白A(immunoglobulin A，IgA)、免疫球白蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、免疫球白蛋白M(immunoglobulin M，IgM)、IL-2、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、IL-6和IFN-γ試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；新城疫病毒抗體(Newcastle disease virus antibody，NDV-Ab)和傳染性法氏囊病病毒抗體(infectious bursal disease virus antibody，IBDV-Ab)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自上海勁馬生物科技有限公司。

1.4 儀器設(shè)備

主要儀器包括MK3型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾儀器有限公司)、SPH-211B型控溫?fù)u床(上海世平試驗(yàn)設(shè)備有限公司)、Beta 2-8 LSCbasic型真空冷凍干燥機(jī)(德國Martin Christ公司)、3K15型低溫高速離心機(jī)(美國Sigma公司)。

1.5 樣品采集和指標(biāo)檢測(cè)

分別于試驗(yàn)第1、21和42天早晨空腹稱重，以每個(gè)重復(fù)為單位，計(jì)算試驗(yàn)雞平均日增重，并準(zhǔn)確記錄采食量和剩料量，計(jì)算試驗(yàn)雞平均日采食量和料重比(平均日采食量/平均日增重)。

分別于試驗(yàn)第21和42天，從每個(gè)重復(fù)取3只雞，心臟采血5 mL，分別置于乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)真空采血管和肝素鈉采血管中，EDTA-2Na真空采血管用做血液常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)，肝素鈉采血管3 000 r/min離心10 min分離血漿后用于血漿抗氧化和免疫指標(biāo)的測(cè)定。

1.5.1 血液常規(guī)指標(biāo)的檢測(cè)

用顯微鏡計(jì)數(shù)法檢測(cè)血液白細(xì)胞(white blood cell，WBC)和紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)總數(shù)，沙利氏比色法檢測(cè)血紅蛋白(hemoglobin，HGB)含量，溫氏法檢測(cè)紅細(xì)胞壓積(hematocrit，HCT)。

1.5.2 血漿抗氧化和免疫指標(biāo)的檢測(cè)

按照試劑盒說明書測(cè)定血漿GSH-Px和SOD活性、T-AOC以及MDA、IgG、IgA、IgM、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6含量。采用ELISA試劑盒測(cè)定血漿NDV-Ab和IBDV-Ab水平。

1.5.3 免疫器官指數(shù)測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，按常規(guī)方法進(jìn)行屠宰，屠宰后摘取脾臟、胸腺以及法氏囊，并剔除其表面的脂肪，計(jì)算免疫器官指數(shù)：

免疫器官指數(shù)(g/kg)=免疫器官鮮重(g)/
宰前活重(kg)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件的ANOVA模塊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和多重比較，用ANOVA模塊對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，Waller-Duncan氏法進(jìn)行多重比較，然后對(duì)羅伊氏乳桿菌肽聚糖添加水平進(jìn)行線性(linear)和二次曲線(quadratic)回歸分析。試驗(yàn)的結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié) 果

2.1 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對(duì)蛋雛雞生長(zhǎng)性能的影響

由表2可見，試驗(yàn)第21、42天，1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組平均日增重顯著高于其他各組(P<0.05)，1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組料重比顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。試驗(yàn)第21天，對(duì)照組和250 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組平均日采食量顯著高于500、1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)。

2.2 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對(duì)蛋雛雞血液常規(guī)指標(biāo)的影響

由表3可見，試驗(yàn)第42天，500、1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血液白細(xì)胞總數(shù)顯著高于對(duì)照組和250 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)。試驗(yàn)第21、42天，各組之間血液紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白含量和紅細(xì)胞壓積差異不顯著(P>0.05)。

2.3 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對(duì)蛋雛雞血漿抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可見，試驗(yàn)第21、42天，1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血漿GSH-Px、SOD活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，500、1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血漿T-AOC顯著高于對(duì)照組和250 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)。試驗(yàn)第42天，1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血漿MDA含量顯著低于對(duì)照組及250、500 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)。

2.4 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對(duì)蛋雛雞血漿免疫指標(biāo)的影響

由表5可見，試驗(yàn)第21天，250 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血漿IgG含量顯著高于對(duì)照組及500、1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)，1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血漿IgA、IL-4含量顯著高于對(duì)照組及250、500 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)。試驗(yàn)第42天，500、1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血漿IL-2含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血漿IgA、IgG、IL-4、IL-6和IFN-γ含量顯著高于對(duì)照組及250、500 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)。試驗(yàn)第21、42天，各組之間血漿IgM含量差異不顯著(P>0.05)。

表2 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對(duì)蛋雛雞生長(zhǎng)性能的影響

表3 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對(duì)蛋雛雞血液常規(guī)指標(biāo)的影響

2.5 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對(duì)蛋雛雞血漿NDV-Ab和IBDV-Ab水平的影響

由表6可見，1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血漿NDV-Ab和IBDV-Ab水平顯著高于對(duì)照組及250、500 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)。

2.6 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對(duì)蛋雛雞免疫器官指數(shù)的影響

由表7可見，1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組脾臟指數(shù)顯著高于對(duì)照組及250、500 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)，250、1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組胸腺指數(shù)顯著高于對(duì)照組和500 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)。各組之間的法氏囊指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。

表4 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對(duì)蛋雛雞血漿抗氧化指標(biāo)的影響

表5 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對(duì)蛋雛雞血漿免疫指標(biāo)的影響

5ItemsTimeLactobacillus reuteri peptidoglycan supplemental level/(mg/kg)0 250 500 1 000P P-valueANOVALinearQuadratic-4IL-4/(ng/L)21 Day 21169.56±5.76b159.74±10.16b164.36±11.46b190.17±16.58a0.0150.0250.01042 Day 42263.13±18.03d331.07±6.66c360.21±4.94b436.41±3.76a<0.001<0.0010.428-6IL-6/(ng/L)21 Day 21137.21±2.41148.59±11.47141.59±15.34157.29±18.400.2140.1000.75142 Day 42206.70±6.53c208.69±11.66c228.43±1.23b257.50±10.59a<0.001<0.0010.008-γIFN-γ/(ng/L)21 Day 2198.26±2.32b105.10±0.82b149.99±7.26a161.47±17.91a<0.001<0.0010.64242 Day 42124.29±4.62c127.68±8.40c158.98±2.76b185.21±11.46a<0.001<0.0010.011

表6 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對(duì)蛋雛雞血漿NDV-Ab和IBDV-Ab水平的影響

表7 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對(duì)蛋雛雞免疫器官指數(shù)的影響

3 討 論

3.1 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對(duì)蛋雛雞生長(zhǎng)性能的影響

微生態(tài)制劑尤其是益生菌在家禽飼糧廣泛應(yīng)用，益生菌通過增加有益微生物的數(shù)量和酶活性，改善腸道微生物平衡，從而影響食物的消化、吸收和攝入量，進(jìn)而改善消化過程[7-9]。Yi等[10]給仔豬服用羅伊氏乳桿菌(5×1010CPU/kg)顯著提高了仔豬的體重，與添加抗生素的效果相仿。羅伊氏乳桿菌可以替代抗生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑來改善幼畜的消化吸收功能[11]。在肉雞飼糧中添加羅伊氏乳桿菌可以提高肉雞的平均日增重，降低飼料消耗，飼料轉(zhuǎn)化率降低了6%～7%[12]。羅伊氏乳桿菌提高動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制是比較復(fù)雜的，既有益生菌本身作用，也有各種代謝產(chǎn)物的作用。飼料中添加雙歧桿菌肽聚糖可顯著促進(jìn)日本對(duì)蝦生長(zhǎng)[13]。飼料中添加雙歧桿菌肽聚糖能顯著提高日本刺參的生長(zhǎng)性能[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖能顯著提高蛋雛雞平均日增重，添加250～1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖能顯著降低蛋雛雞料重比。由此可見，羅伊氏乳桿菌肽聚糖可用做雛雞的飼料添加劑，以提高雛雞的生長(zhǎng)性能。

3.2 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對(duì)蛋雛雞血漿抗氧化指標(biāo)的影響

Yang等[2]報(bào)道，給仔豬口服羅伊氏乳桿菌顯著降低了血漿MDA含量，提高了血漿T-AOC及SOD、GSH-Px活性。Tang等[15]給患有壞死性小腸結(jié)腸炎小鼠灌服羅伊氏乳桿菌，顯著提高了患病小鼠腸道組織SOD活性和谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量，顯著降低腸道組織MDA、氧化性谷胱甘肽(glutathione oxidized，GSSG)含量和GSSG/GSH比值。Arcanjo等[16]體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，羅伊氏乳桿菌可能通過由dhaT基因編碼的還原性輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)依賴性氧化還原酶發(fā)揮抗氧化反應(yīng)。關(guān)于乳酸菌提高動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力的機(jī)制前人也進(jìn)行了有價(jià)值的探索。Mantis等[17]研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌肽聚糖能誘導(dǎo)小鼠腸黏膜并形成保護(hù)膜，從而減緩炎癥反映，進(jìn)而增加抗氧化應(yīng)激的能力。Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加枯草芽孢桿菌肽聚糖提高了鯉魚腸上皮細(xì)胞的抗氧化能力。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖可以顯著提高蛋雛雞血漿GSH-Px、SOD活性和T-AOC，并顯著降低血漿MDA含量。羅伊氏乳桿菌肽聚糖與其他益生菌肽聚糖一樣，具有抗氧化應(yīng)激的作用。由此可見，肽聚糖作為羅伊氏乳桿菌細(xì)胞壁的組成成分，在羅伊氏乳桿菌的抗氧化損傷的機(jī)制上扮有重要的角色，肽聚糖抗氧化損傷的機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.3 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對(duì)蛋雛雞血漿免疫指標(biāo)的影響

羅伊氏乳桿菌I5007可增強(qiáng)T細(xì)胞分化并誘導(dǎo)回腸細(xì)胞因子表達(dá)，從而調(diào)節(jié)斷奶仔豬的免疫功能[1]。補(bǔ)充羅伊氏乳桿菌可提高新生仔豬血漿IL-2、IFN-α、IFN-β含量[2]。Gonmei等[19]報(bào)道，飼糧中添加羅伊氏乳桿菌PIA16在一定程度上能夠提高雞的血漿NDV-Ab水平。He等[20]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，低劑量羅伊氏乳桿菌組雌性和雄性小鼠的血漿IL-12含量均顯著升高。Sureshkumar等[21]認(rèn)為羅伊氏乳桿菌通過調(diào)節(jié)IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等含量，實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用。羅伊氏乳桿菌的哪一種代謝產(chǎn)物發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用卻鮮見報(bào)道。Li等[22]報(bào)道，植物乳桿菌細(xì)胞壁肽聚糖可提高IL-4、IL-12、TNF-α和IFN-γ表達(dá)水平，對(duì)小鼠先天免疫和體液免疫功能起到調(diào)節(jié)作用。Kolling等[4]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠補(bǔ)飼肽聚糖時(shí)，顯著提高了支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-10含量，減少肺炎球菌的感染，肽聚糖在小鼠的呼吸道黏膜免疫發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1 000 mg/kg的羅伊氏乳桿菌肽聚糖可顯著提高蛋雛雞血漿IgG、IgA、IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ含量，證明羅伊氏乳桿菌增強(qiáng)免疫作用與其細(xì)胞壁肽聚糖密切相關(guān)。Barinskiǐ等[23]將肽聚糖-160與免活疫苗相結(jié)合，可顯著提高小鼠的蜱傳腦炎(TBE)疫苗的保護(hù)作用。Ridi等[24]以肽聚糖作為免疫佐劑，對(duì)小鼠注射血吸蟲病疫苗產(chǎn)生的抗體效價(jià)具有明顯增強(qiáng)作用。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖能顯著提高蛋雛雞血漿NDV-Ab和IBDV-Ab水平，表明羅伊氏乳桿菌增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫作用的機(jī)制與肽聚糖有關(guān)。關(guān)于肽聚糖增強(qiáng)免疫功能的機(jī)制尚不十分清楚。嗜酸乳桿菌肽聚糖TLR2信號(hào)識(shí)別，誘導(dǎo)Treg免疫反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)Treg/Th17失衡，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[5]。Cross[25]研究指出，地衣芽孢桿菌細(xì)胞壁含有肽聚糖和多糖，能直接活化宿主的巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫系統(tǒng)，進(jìn)而促進(jìn)免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)機(jī)體抵抗致病菌的能力。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加羅伊氏乳桿菌肽聚糖可不同程度地提高胸腺、脾臟指數(shù)，奠定了羅伊氏乳桿菌肽聚糖增強(qiáng)雛雞免疫功能的組織學(xué)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

飼糧中添加1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖可以提高蛋雛雞生長(zhǎng)性能，提高雛雞抗氧化能力，促進(jìn)免疫器官發(fā)育，提高細(xì)胞免疫和體液免疫功能，增強(qiáng)新城疫疫苗和傳染性法氏囊病疫苗的免疫效果。