周亞楠 馮宇哲 楊得玉 王 音 李積蘭 劉書杰 崔占鴻

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海省牦牛工程技術(shù)研究中心，青海省高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810016)

牦牛是青藏高原地區(qū)的優(yōu)勢(shì)反芻家畜品種，是該地區(qū)重要的生產(chǎn)和生活資料來(lái)源之一[1]。犢牛期是幼齡牦牛生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，對(duì)成年后牦牛的生產(chǎn)表現(xiàn)至關(guān)重要[2]。但是牦牛放牧條件下環(huán)境惡劣、牧草質(zhì)量低下，母牛的能量攝入不足，哺乳量明顯降低，加之犢牛對(duì)牧草消化能力不足，犢牛營(yíng)養(yǎng)攝入缺乏問(wèn)題十分突出，不利于其早期生長(zhǎng)發(fā)育，從而導(dǎo)致?tīng)倥０l(fā)育緩慢[3]。犢牛出生后，在哺乳條件下各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)水平都能達(dá)到犢牛所需時(shí)，到犢牛斷奶，犢牛各組織器官能夠快速發(fā)育完善[4-5]；而營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，會(huì)造成牦牛犢牛發(fā)育不良，生長(zhǎng)緩慢，嚴(yán)重時(shí)會(huì)形成僵牛，延長(zhǎng)牦牛的生長(zhǎng)周期[6]。因此，犢牛出生后初乳和過(guò)渡期開食料的采食量是犢牛培育計(jì)劃中的2個(gè)重要環(huán)節(jié)[2]。研究表明，出生前幾周僅飼喂牛奶或代乳粉的犢牛會(huì)阻礙瘤胃的發(fā)育，不利于犢牛斷奶和利用谷物及粗飼料[7]。大量研究表明，適時(shí)采食一定量精飼料相較于牛奶和干草更加能促進(jìn)犢牛的生長(zhǎng)發(fā)育[8-10]。目前，本團(tuán)隊(duì)王音等[11]關(guān)于哺乳期補(bǔ)飼開食料對(duì)牦牛犢牛瘤胃發(fā)育已做研究，而關(guān)于補(bǔ)飼開食料對(duì)哺乳期牦牛犢牛皺胃形態(tài)與功能發(fā)育的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，以牦牛犢牛為對(duì)象，研究補(bǔ)飼開食料對(duì)牦牛犢牛生長(zhǎng)性能和皺胃形態(tài)與功能的影響，以及對(duì)皺胃組織的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(FATP4)、小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(PepT1)基因的調(diào)控作用，從分子水平探究哺乳期補(bǔ)飼開食料對(duì)牦牛犢牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的影響，預(yù)期結(jié)果能為哺乳期牦牛犢牛營(yíng)養(yǎng)調(diào)控技術(shù)研究提供理論依據(jù)和重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地方

試驗(yàn)時(shí)間為2020年7月至2020年11月。牦牛犢牛飼養(yǎng)試驗(yàn)在青海省海北州海晏縣高原現(xiàn)代生態(tài)畜牧業(yè)科技試驗(yàn)示范園管委會(huì)完成。樣品測(cè)定在青海省牦牛工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼糧

選取20頭健康、體重相近的1月齡公牦牛犢牛，隨機(jī)分為2組，每組10頭。對(duì)照組飼喂代乳粉+苜蓿干草，試驗(yàn)組飼喂代乳粉+苜蓿干草+開食料。對(duì)照組和試驗(yàn)組代乳粉飼喂量相同，總的干物質(zhì)采食量保持一致，代乳粉、開食料均來(lái)自北京標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究中心，苜蓿干草購(gòu)自甘肅省張掖市。代乳粉和開食料組成參見(jiàn)本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[12]，營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

牦牛犢牛(公)單欄飼養(yǎng)，代乳粉早、中、晚飼喂3次，飼喂時(shí)間分別為08:30、12:30、16:30，沸水冷卻至42 ℃，代乳粉和溫水按1∶5比例配制，灌入奶瓶，牦牛犢牛主動(dòng)吮吸；將試驗(yàn)組開食料和苜蓿干草干物質(zhì)比例調(diào)整為1∶1，開食料和苜蓿干草分開進(jìn)行飼喂，且每天對(duì)剩料進(jìn)行稱量、記錄試驗(yàn)，飼養(yǎng)管理具體方法參見(jiàn)本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[12]。預(yù)試期14 d，正試期120 d。

表1 試驗(yàn)飼糧營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.4 樣品采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，牦牛犢牛前1天16:00之后斷食斷水，于清晨屠宰，取皺胃內(nèi)容物于5 mL凍存管中，立即置入液氮罐中保存，用于皺胃消化酶活性以及功能發(fā)育基因表達(dá)的測(cè)定。在皺胃胃體部取組織塊約2 cm×2 cm，固定于4%的多聚甲醛溶液，連續(xù)換液，直至多聚甲醛溶液澄清透明，用于后續(xù)組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能

分別在試驗(yàn)初期和試驗(yàn)?zāi)┢诜Q重，測(cè)量體高、體斜長(zhǎng)、管圍、胸圍，具體測(cè)量方法參考郭文杰[12]，計(jì)算平均日增重(ADG)，公式如下：

平均日增重=(終末體重-初始體重)/試驗(yàn)天數(shù)。

1.5.2 皺胃組織形態(tài)發(fā)育

將固定于4%多聚甲醛中的樣品取出，采用蘇木精-伊紅(HE)染色法制備組織切片[11]，制備組織切片的順序?yàn)椋菏炃衅撓炛了?，蘇木精和伊紅分別染細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)，不同濃度的酒精脫水封片，利用電子顯微鏡對(duì)皺胃進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.5.3 消化酶活性

測(cè)定皺胃內(nèi)容物中主要消化酶(纖維素酶、淀粉酶、胃蛋白酶、葡萄糖苷酶、脂肪酶)活性。測(cè)定之前稱取0.5 g皺胃內(nèi)容物，質(zhì)量體積比為1∶9(g/mL)，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.4)，將其研磨并勻漿充分，低溫離心10 min，仔細(xì)收集上清液。分裝多份，其中1份單獨(dú)放置，用于試劑盒檢測(cè)，其余放置低溫冷凍備用。消化酶活性使用酶標(biāo)儀測(cè)定，試劑盒購(gòu)于江蘇酶標(biāo)科技有限公司，試驗(yàn)流程嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5.4 營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定皺胃組織中的GLUT1、PepT1、FATP4基因相對(duì)表達(dá)量。按照RNA提取試劑盒(Servicebio)說(shuō)明書進(jìn)行操作，將皺胃組織中研磨充分，用于提取總RNA，使用Nanodrop 2000儀器檢測(cè)RNA濃度及純度用于后續(xù)試驗(yàn)。其中，判斷皺胃組織的RNA是否降解采用的是1%瓊脂糖凝膠電泳法。采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成時(shí)應(yīng)保證試驗(yàn)于冰上進(jìn)行，使其處于低溫環(huán)境?？偡磻?yīng)體系為20 μL，其中5×Reaction Buffer為4 μL、Oligo (dT)18Primer (100 μmol/L)為0.5 μL、Random Hexamer primer (100 μmol/L)為0.5 μL、Servicebio?RT Enzyme Mix為1 μL、Total RNA為1 μL，最后RNase free water添加至20 μL。所用儀器為熒光定量PCR儀(Stepone plus，ABI)。采用三步法測(cè)定，第1步：預(yù)變性，95 ℃，10 min；第2步：首先95 ℃，15 s條件下變性，其次60 ℃，30 s 條件下退火/延伸；第3步：生成熔解曲線，60 ℃→95 ℃，每升溫0.3 ℃，采集1次熒光信號(hào)。引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI中查找到的GLUT1、PepT1、FATP4基因序列，由武漢賽維爾生物科技有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列見(jiàn)表2，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先經(jīng)Excel 2016初步處理后，采用SPSS 20.0軟件的one-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 哺乳期補(bǔ)飼開食料對(duì)牦牛犢牛生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，對(duì)照組和試驗(yàn)組牦牛犢牛初始體重、體斜長(zhǎng)、胸圍均差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)組干物質(zhì)采食量、終末體重、平均日增重、體高均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

2.2 哺乳期補(bǔ)飼開食料對(duì)牦牛犢牛皺胃組織形態(tài)發(fā)育的影響

圖1為補(bǔ)飼開食料哺乳期牦牛犢牛的皺胃冷凍切片。由表4可知，對(duì)照組和試驗(yàn)組黏膜上皮、黏膜肌層、漿膜層厚度均差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)組黏膜下層、肌層厚度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3 哺乳期補(bǔ)飼開食料對(duì)牦牛犢牛皺胃主要消化酶活性的影響

由表5可知，試驗(yàn)組牦牛犢牛皺胃葡萄糖苷酶、纖維素酶活性極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；試驗(yàn)組皺胃內(nèi)淀粉酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；皺胃胃蛋白酶、脂肪酶活性2組間差異均不顯著(P>0.05)，但試驗(yàn)組略高于對(duì)照組。

表3 哺乳期補(bǔ)飼開食料對(duì)牦牛犢牛干物質(zhì)采食量、體重、體尺的影響

表4 哺乳期補(bǔ)飼開食料對(duì)牦牛犢牛皺胃組織形態(tài)發(fā)育的影響

a:對(duì)照組 control group；b：試驗(yàn)組 test group；c：試驗(yàn)組 test group；A：黏膜上皮 mucosal epithelium；B：黏膜肌層 mucosal muscle layer；C：黏膜下層 submucous layer；D：肌層 muscular layer；E：漿膜層 plasma membrane layer。

2.4 哺乳期補(bǔ)飼開食料對(duì)牦牛犢牛皺胃組織營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響

由表6可知，試驗(yàn)組皺胃的GLUT1、PepT1基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；試驗(yàn)組皺胃的FATP4基因相對(duì)表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

3 討 論

3.1 哺乳期補(bǔ)飼開食料對(duì)牦牛犢牛生長(zhǎng)性能的影響

哺乳期牦牛犢牛的復(fù)胃發(fā)育和功能還未健全，對(duì)粗纖維飼糧的消化功能極有限，在哺乳期補(bǔ)飼開食料可以促進(jìn)牦牛犢?？焖侔l(fā)育。早期精料補(bǔ)飼很多優(yōu)勢(shì)，例如瘤胃發(fā)育和飼料利用率的提高[13-14]，促進(jìn)斷奶時(shí)犢牛體重和胴體重增加，肌肉更加發(fā)達(dá)[15]；王琦[16]研究發(fā)現(xiàn)，給哺乳期羔羊補(bǔ)飼精料，羔羊的增重效果較好。本研究中，試驗(yàn)組平均日增重極顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明早期補(bǔ)飼開食料能有效改善哺乳期牦牛犢牛營(yíng)養(yǎng)采食狀況，提高犢牛生長(zhǎng)性能和發(fā)育質(zhì)量，這與Suárez等[17]研究結(jié)果一致。開食料為高精料，僅飼喂開食料將導(dǎo)致?tīng)倥Ａ鑫杆嶂卸?，?guó)外研究者認(rèn)為，在開食料基礎(chǔ)上增加粗飼料供給才能提高犢牛的生長(zhǎng)、體增重和健康狀況[17-19]，故合理的營(yíng)養(yǎng)供給能加速斷奶前犢牛的瘤胃發(fā)育，降低飼糧消耗，提高生長(zhǎng)速率、斷奶重和健康水平[20-26]。本研究以哺乳期牦牛犢牛為對(duì)象，在飼喂代乳粉和苜蓿草的基礎(chǔ)上繼續(xù)補(bǔ)飼優(yōu)質(zhì)的飼料(開食料)，開食料主要為牦牛犢牛提供精料，形狀為顆粒飼料，即通過(guò)固體飼料早期適量飼喂促進(jìn)了牦牛犢牛生長(zhǎng)性能發(fā)揮，實(shí)現(xiàn)了犢牛飼糧的營(yíng)養(yǎng)合理組合搭配利用，對(duì)挖掘哺乳期牦牛犢牛的生長(zhǎng)性能產(chǎn)生了積極調(diào)控作用。

表5 哺乳期補(bǔ)飼開食料對(duì)牦牛犢牛皺胃主要消化酶活性的影響

表6 哺乳期補(bǔ)飼開食料對(duì)牦牛犢牛皺胃組織營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響

3.2 哺乳期補(bǔ)飼開食料對(duì)牦牛犢牛皺胃組織形態(tài)發(fā)育的影響

皺胃是典型的管狀器官[27]，是反芻動(dòng)物的腺胃，又被稱為真胃[28]。反芻動(dòng)物皺胃運(yùn)動(dòng)與單胃相似但也有所不同，雖受迷走神經(jīng)支配，但將其切斷后，仍可發(fā)生推進(jìn)性運(yùn)動(dòng)，在條件反射和非條件反射的作用下引起胃部運(yùn)動(dòng)，剛出生犢牛的消化運(yùn)動(dòng)功能主要依靠皺胃[28]，而液體飼料可直接由食管溝到達(dá)皺胃，對(duì)于哺乳期反芻動(dòng)物而言，前期由犢牛攝入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)其消化吸收主要依賴于皺胃組織[29]。在本試驗(yàn)中，哺乳期牦牛犢牛在補(bǔ)飼開食料后，黏膜下層、肌層發(fā)育明顯優(yōu)于未補(bǔ)飼開食料牦牛犢牛，且黏膜上皮、黏膜肌層、漿膜層發(fā)育略好。飼喂足量的精料，皺胃肌層較為發(fā)達(dá)，皺胃黏膜肌層發(fā)育則不明顯；王斯琴塔娜[30]研究結(jié)果表明，飼喂高質(zhì)量飼糧皺胃肌層的發(fā)育要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于低質(zhì)量飼糧。同時(shí)，趙瑋[31]研究也發(fā)現(xiàn)，山羊飼喂含有高質(zhì)量易消化的飼糧皺胃發(fā)育更好，這一結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致。由此可見(jiàn)，哺乳期補(bǔ)飼開食料有利于牦牛犢牛皺胃發(fā)育，促進(jìn)皺胃的蠕動(dòng)，從而影響牦牛犢牛對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育。

3.3 哺乳期補(bǔ)飼開食料對(duì)牦牛犢牛皺胃主要消化酶活性的影響

皺胃分為賁門腺部、胃底腺部、幽門腺部3個(gè)部分，胃底腺胃液pH相較于瘤胃酸性更強(qiáng)，為2.1～4.0；幽門腺呈堿性或者中性[30]，胃腺由4部分細(xì)胞構(gòu)成，與前胃明顯不同，造成了它的特殊性，主細(xì)胞、壁細(xì)胞和頸黏液細(xì)胞以及少量的內(nèi)分泌細(xì)胞都有其各自的功能[32]。通過(guò)一系列胃部運(yùn)動(dòng)，皺胃分泌各種消化酶，其中包括鹽酸、淀粉酶、葡萄糖苷酶、胃蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶，而未經(jīng)過(guò)前胃消化的物質(zhì)，可被葡萄糖苷酶、纖維素酶消化；鹽酸破壞來(lái)自瘤胃的微生物，胃脂肪酶可以分解脂類物質(zhì)[33]；胃蛋白酶可以通過(guò)分解微生物蛋白從而產(chǎn)生氨基酸，直接供犢牛吸收。飼糧中加入精料可以提高胃蛋白酶和脂肪酶的活性[34]；Taniguchi等[35]研究表明，增加開食料攝入量，提高皺胃和小腸對(duì)淀粉的消化量，從而進(jìn)一步促進(jìn)淀粉酶分泌；Ash[36]發(fā)現(xiàn)前胃未消化的物質(zhì)可刺激皺胃分泌消化酶，對(duì)于哺乳期牦牛犢牛，前胃發(fā)育不完全，主要由皺胃與小腸分泌的消化酶來(lái)消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[37]。本試驗(yàn)補(bǔ)飼開食料后哺乳期牦牛犢牛皺胃葡萄糖苷酶、纖維素酶活性顯著升高，表明補(bǔ)飼開食料有助于提高牦牛犢牛皺胃消化酶的分泌和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力。補(bǔ)飼開食料后牦牛犢牛皺胃內(nèi)淀粉酶活性提高，與Taniguchi等[35]研究結(jié)果相似；試驗(yàn)組皺胃內(nèi)胃蛋白酶、脂肪酶活性略高于對(duì)照組，也與前人研究結(jié)果一致。

3.4 哺乳期補(bǔ)飼開食料對(duì)牦牛犢牛皺胃營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響

皺胃可消化的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包含葡萄糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等，GLUT1是反芻動(dòng)物促進(jìn)葡萄糖吸收的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以促進(jìn)對(duì)葡萄糖的攝入[38]；FATP4是機(jī)體調(diào)控吸收脂肪酸的主要因子，能夠促進(jìn)機(jī)體對(duì)脂肪的吸收；PepT1參與小肽的跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)，可直接促進(jìn)動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收[39]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在補(bǔ)飼開食料的情況下，哺乳期牦牛犢牛皺胃GLUT1、PepT1基因相對(duì)表達(dá)量顯著增加，且皺胃FATP4基因相對(duì)表達(dá)量極顯著升高，這與潘巧[40]、占今舜等[41]研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明補(bǔ)飼精料更有利于牦牛犢牛對(duì)葡萄糖、脂肪、蛋白質(zhì)的消化吸收，但國(guó)內(nèi)外對(duì)于牦牛犢牛皺胃營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的研究極少，其更深的影響機(jī)理亟需進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

綜上所述，哺乳期補(bǔ)飼開食料有利于牦牛犢牛的生長(zhǎng)性能發(fā)揮，正向調(diào)控其皺胃形態(tài)與功能發(fā)育，進(jìn)而提高對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率。