＊鄒小燕 賴金強(qiáng) 丁家豪

（廣州雋沐生物科技股份有限公司 廣東 510400）

鈣拮抗劑，又可以被稱鈣通道阻滯藥，是指選擇性地作用在電壓依賴性的鈣通道，可以選擇性的抑制鈣離子從細(xì)胞外液經(jīng)過(guò)電壓依賴性鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物分子。由于Ca2+在生物細(xì)胞生理及病理中具有很多方面的作用，藥物分子可通過(guò)對(duì)Ca2+活動(dòng)的影響從而發(fā)揮藥理作用，細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多則可引起ATP消耗增多，線粒體中Ca2+濃度過(guò)多，就會(huì)破壞ATP的產(chǎn)生，激活磷脂酶和蛋白酶，從而導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)制的喪失以及形態(tài)的改變[1]。細(xì)胞受到一系列的刺激后，胞漿游離Ca2+離子濃度增高，進(jìn)而引發(fā)一系列生物效應(yīng)，胞漿游離Ca2+增高一般有兩種途徑：一是胞外Ca2+內(nèi)流，二是胞內(nèi)Ca2+釋放。鈣拮抗劑可以選擇性地與Ca2+離子通道結(jié)合，阻滯細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子濃度，從而發(fā)揮藥理作用。鈣拮抗劑（鈣離子通道阻滯劑）的二氫吡啶衍生物，是目前臨床上特異性最高、作用最強(qiáng)的一類鈣離子通道拮抗劑，目前臨床上采用緩釋片用藥。1967年，德國(guó)學(xué)者Fleckenstein首次提出“鈣拮抗劑”，這類藥物的發(fā)展十分迅速，在心腦血管疾病治療領(lǐng)域中占有十分重要的地位與重大意義[2]。鈣拮抗劑在缺血性心臟病的治療上發(fā)揮了其重大的作用，特別是二氫吡啶類藥物（硝苯地平類藥物），涌現(xiàn)了許多新的藥物。硝苯地平類藥物不僅可治療心絞痛、缺血性心臟病、改善心肌缺血，而且可以治療高血壓、腦缺血、充血性心力衰竭及外周血管痙攣，目前，此類化合物已經(jīng)成為治療心率失常及不同程度的高血壓的一線藥物[3-5]。此類藥物的代表為拉西地平（Lacidipine），化學(xué)名稱是（E）-4-{2-[3-（1，1-二甲基乙氧基）-3-氧代-1-丙烯基]-苯基}-1，4-二氫-2，6-二甲基-3，5-吡啶二羧酸二乙酯（圖1）[6]，在臨床使用過(guò)程中，具有降壓效果好、劑量小、長(zhǎng)效、平穩(wěn)等特點(diǎn)[7-8]，可以用于治療中輕度高血壓。

圖1 拉西地平的結(jié)構(gòu)

本品由英國(guó)葛蘭素Glaxo公司開發(fā)，1991年在意大利首次上市，目前已在多個(gè)國(guó)家銷售[9]。拉西地平（Lacidipine）的結(jié)構(gòu)中有一個(gè)疏水性的叔丁基側(cè)鏈片段，這個(gè)較大的叔丁基側(cè)鏈在膜中膽固醇含量較低時(shí)，較大的叔丁基側(cè)鏈能深入到膜的內(nèi)部。并且，拉西地平（Lacidipine）更傾向于靠近在磷脂雙層脂肽鏈末端的甲基部位，這表明它構(gòu)象的低能量取向和膜的這個(gè)區(qū)域在空間容量上的最大化，足以容納具有疏水性作用的二氫吡啶結(jié)構(gòu)。拉西地平與細(xì)胞膜的相互作用是拉西地平（Lacidipine）產(chǎn)生獨(dú)特藥代動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵所在[10]。因此，二氫吡啶的結(jié)構(gòu)破壞了，拉西地平的藥理活性也會(huì)受到影響。

在藥物研究過(guò)程中一定要研究雜質(zhì)的性質(zhì)，確定它是否會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生影響。藥物雜質(zhì)來(lái)源包括兩個(gè)：其中一個(gè)是由于原料不純、反應(yīng)轉(zhuǎn)化率不高、雜質(zhì)未能完全除去等原因?qū)е碌模幬锷a(chǎn)制作過(guò)程中引入的雜質(zhì)分子。另一個(gè)是在貯藏過(guò)程中受外界條件影響，比如受到外界微生物的作用，發(fā)生水解、氧化、分解、晶型轉(zhuǎn)變、聚合和發(fā)霉等變化，產(chǎn)生的雜質(zhì)。藥品研發(fā)與生產(chǎn)相關(guān)企業(yè)必須要對(duì)藥物里面含有的雜質(zhì)來(lái)源、毒性、分子結(jié)構(gòu)、檢測(cè)手段及質(zhì)控限度進(jìn)一步明確。有關(guān)物質(zhì)在藥物的質(zhì)量研究中占有極為重要的位置，根據(jù)有關(guān)物質(zhì)的含量可以計(jì)算出藥物的純度，而達(dá)到一定純度有時(shí)必須依賴某些必要的操作步驟和原料，因此，微量的有毒物質(zhì)是被允許使用的，但對(duì)這類物質(zhì)必須嚴(yán)格控制。以文獻(xiàn)數(shù)據(jù)及安全性的檢測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)來(lái)確認(rèn)雜質(zhì)是否有毒。因此，在仿制藥的合成過(guò)程中，藥物雜質(zhì)的含量控制以及后續(xù)雜質(zhì)的合成是化學(xué)藥物質(zhì)量控制的重要內(nèi)容之一。根據(jù)人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）的規(guī)定，假如，原料藥里面有超過(guò)0.1%含量的雜質(zhì)，就要通過(guò)譜學(xué)等手段鑒定雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)[11-12]。目前，對(duì)于拉西地平雜質(zhì)B的合成少見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為了滿足人們對(duì)拉西地平（Lacidipine）的生產(chǎn)質(zhì)量控制需求，依據(jù)國(guó)際人用藥品注冊(cè)國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）的雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則要求，我們以拉西地平原料藥為原料，通過(guò)一步DDQ氧化反應(yīng)得到雜質(zhì)B，具體合成路線見圖1。

圖2

1.實(shí)驗(yàn)部分

（1）主要儀器及試劑

Bruck AV III 400MHz NMR核磁共振儀（以d6-DMSO為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)）；WRS-1B熔點(diǎn)儀；Thermo Nicolet iS10 FT-IR紅外光譜儀；Agilent 6110 Quadruplie液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

冰醋酸（阿拉丁，AR），乙腈（國(guó)藥試劑，AR），二氯甲烷（國(guó)藥試劑，AR），DDQ（阿拉丁，AR），NaI（阿拉丁，AR），濃硫酸（國(guó)藥試劑，AR），高錳酸鉀（阿拉丁，AR），碘（阿拉丁，AR），碘化鈉（國(guó)藥試劑，AR），雙氧水（阿拉丁，AR），拉西地平（原料購(gòu)于南京康滿林生物科技有限公司，AR）。

(2)具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程

①拉西地平雜質(zhì)B的合成

向裝有磁力攪拌子的100mL單口圓底燒瓶中加入拉西地平1.0g（455.6，2.2mmol），然后加入30mL二氯甲烷溶液，在室溫下以250rpm的速度攪拌，以1.0g/min的速度向圓底燒瓶中加入預(yù)先將3-二氯-5,6-二氰對(duì)苯醌（DDQ）溶解在二氯甲烷溶液中，在室溫下攪拌10min，加入10%的碳酸氫鈉水溶液洗滌，加入飽和食鹽水（NaCl溶液）洗滌，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸餾除去二氯甲烷，得到粗品，將粗品用2mL乙醇超聲溶解，室溫?cái)嚢瑁徛渭尤?mL水，然后室溫?cái)嚢?.5h，過(guò)濾，烘干，得到黃白色固體（雜質(zhì)B），純度100%（HPLC），收率89.1%。m.p.=109℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.93(d,J=2.4Hz,1H),7.91-7.41(m,2H),7.13-7.06(m,2H),6.45(d,J=15.6Hz,1H),3.92-3.87(m,4H),2.54(s,6H),1.41(s,9H),0.78(t,J=7.2Hz,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ166.8,165.7,155.6,144.6,141.1,136.5,132.7,129.9,129.7,129.6,127.2,126.4,121.0,80.5,61.5,33.4,28.2；IR:3435,3392,2976,1730,1703,1636,1556,1480,1368,1319,1260,1150,989,767cm-1；MS:m/z calcd for C26H31NO6,[M]+,453.2；found:453.9。

②拉西地平雜質(zhì)B的合成條件優(yōu)化

對(duì)拉西地平雜質(zhì)B的合成進(jìn)行了條件優(yōu)化，首先我們采用濃硫酸（H2SO4）、高錳酸鉀（K2MnO4）、六水合氯化鐵（FeCl36H2O）、碘（I2）、NaI-H2O2等氧化劑來(lái)代替3-二氯-5,6-二氰對(duì)苯醌（DDQ）；同時(shí)還對(duì)反應(yīng)的溫度和重結(jié)晶的溶劑進(jìn)行優(yōu)化，最后對(duì)重結(jié)晶溶劑的比例進(jìn)行了篩選。

2.結(jié)果與討論

(1)不同氧化劑對(duì)反應(yīng)的影響

在雜質(zhì)B的合成過(guò)程中，需要將二氫吡啶環(huán)氧化得到吡啶環(huán)，完成這個(gè)轉(zhuǎn)化，需要用到氧化劑。考察不同的氧化劑對(duì)反應(yīng)的影響（表1）。通過(guò)采用濃硫酸（H2SO4）來(lái)代替3-二氯-5,6-二氰對(duì)苯醌（DDQ）參與氧化反應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)完全不能發(fā)生，并且還得到了少量的水解的產(chǎn)物，用高錳酸鉀（K2MnO4）、六水合氯化鐵（FeCl36H2O）來(lái)進(jìn)行氧化的時(shí)候，得到了少量的產(chǎn)物，大部分都是原料，沒(méi)有轉(zhuǎn)化完全，分析原因，我們認(rèn)為可能是高錳酸鉀（K2MnO4）作為氧化劑反應(yīng)時(shí)，在二氯甲烷中的溶解度不好；因此，用醋酸:水（1:1）的體系來(lái)代替二氯甲烷，以提高高錳酸鉀在反應(yīng)體系中的含量，但是實(shí)驗(yàn)沒(méi)有得到預(yù)期，收率沒(méi)有明顯改善。當(dāng)采用碘（I2）來(lái)進(jìn)行氧化時(shí)，有21%的收率；用NaI-H2O2氧化劑來(lái)代替3-二氯-5,6-二氰對(duì)苯醌（DDQ）時(shí)，以中等收率得到了產(chǎn)物，氧化能力不強(qiáng)，不足以完全氧化二氫吡啶環(huán)。

表1 不同氧化劑對(duì)反應(yīng)的影響

因此，通過(guò)考察不同的氧化劑，發(fā)現(xiàn)3-二氯-5,6-二氰對(duì)苯醌（DDQ），能夠以75%的收率得到雜質(zhì)B，其他的氧化劑，比如濃硫酸、高錳酸鉀、六水合氯化鐵、碘、NaI-H2O2體系，反應(yīng)效果都不好。

(2)不同溫度對(duì)反應(yīng)的影響

通過(guò)優(yōu)化得到最好的氧化劑是3-二氯-5,6-二氰對(duì)苯醌（DDQ）之后，開始對(duì)反應(yīng)的溫度進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)反應(yīng)的影響比較大。首先，我們發(fā)現(xiàn)升高溫度，反應(yīng)會(huì)變雜，由此推測(cè)：①溫度太高導(dǎo)致反應(yīng)條件太劇烈；②沒(méi)有氬氣保護(hù)的原因，因此通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證我們的推測(cè)。首先，條件在60℃下氬氣（Ar）保護(hù)下的反應(yīng)收率沒(méi)有得到提高，把反應(yīng)溫度降低，也沒(méi)有得到預(yù)期的效果，因此，我們選擇室溫下來(lái)進(jìn)行反應(yīng)（表2）。

表2 不同溫度對(duì)反應(yīng)的影響

(3)不同結(jié)晶溶劑對(duì)產(chǎn)物的影響

在采用3-二氯-5,6-二氰對(duì)苯醌（DDQ）作為氧化劑，在室溫下反應(yīng)，以較好的收率得到雜質(zhì)B之后，如果采用常規(guī)的柱層析的方法來(lái)進(jìn)行分離純化，勢(shì)必會(huì)增加成本。為了工業(yè)化的生產(chǎn)，減少成本，對(duì)反應(yīng)后處理的結(jié)晶溶劑進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，乙醚、丙酮以及丙酮-正己烷溶劑體系都沒(méi)有固體析出來(lái)，二氫吡啶環(huán)被氧化得到的雜質(zhì)B都能很好的溶解在溶劑里面，但是乙醇-水體系有固體析出來(lái)，采用乙醇-水體系來(lái)進(jìn)行重結(jié)晶（表3）。為研究乙醇-水體系的比例對(duì)氧化產(chǎn)物收率的影響，我們對(duì)乙醇-水體系的比例進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。

表3 不同的結(jié)晶溶劑對(duì)反應(yīng)的影響

(4)乙醇－水的比例對(duì)收率的影響

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)，乙醇-水體系的比例對(duì)收率的影響比較大，在乙醇和水的比例在1:2的時(shí)候，收率最高，達(dá)到了89.1%，水的比例增大和減小都會(huì)影響雜質(zhì)B的收率。同時(shí)我們還對(duì)雜質(zhì)B粗品的量進(jìn)行放大，發(fā)現(xiàn)重結(jié)晶的量越大，得到的產(chǎn)物收率越高，最高的收率達(dá)到97.5%。對(duì)得到的雜質(zhì)B，進(jìn)行HPLC的分析，通過(guò)分析，純度達(dá)到100%以上（C18，70%甲醇：30% H2O），符合質(zhì)量要求（圖3）。因此，通過(guò)優(yōu)化重結(jié)晶的溶劑乙醇和水的比例后，得到的最佳的比例條件是1:2。

圖3 雜質(zhì)B的液相譜圖

液相條件：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6mm×250mm，5μm或效能相當(dāng)?shù)纳V柱）；以甲醇-水-三乙胺-磷酸（600:400:5:1.5）用磷酸溶液（1mol/L）調(diào)劑pH值至7.3為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm，進(jìn)樣體積為10μL，仿照高效液相色譜法（通則0512）測(cè)定，避光操作。

3.結(jié)論

通過(guò)對(duì)反應(yīng)的氧化劑、反應(yīng)溫度，重結(jié)晶溶劑的篩選、重結(jié)晶溶劑比例的優(yōu)化，得到的最優(yōu)條件是，采用DDQ作為氧化劑，緩慢滴加入反應(yīng)瓶中，攪拌反應(yīng)10min，采用乙醇-水=1:2的比率重結(jié)晶雜質(zhì)B粗品，上述拉西地平雜質(zhì)B的新合成操作簡(jiǎn)單，工藝路線短，產(chǎn)物易于分離純化，成本低，收率高，適合于工業(yè)化生產(chǎn)的需要。