賈鑫，王鋒，劉寶輝，楊凱強，王玉玖，董圣軍

(濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東 濱州 256600)

主動脈夾層(aortic dissection,AD)是主動脈壁的急性病變，伴有由于破裂或壁內(nèi)血腫引起的中膜分離[1]。主動脈夾層的發(fā)病率為每年每百萬人5至30例。急性主動脈夾層是一種高度致命的心血管急癥，未經(jīng)治療的患者在癥狀發(fā)作后每小時的致死率為1%～2%[2]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)主動脈夾層等大血管疾病的發(fā)病機制與血管壁結(jié)構(gòu)破壞、中層血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)大量消失及血管壁的重塑有關(guān)，而VSMCs表型轉(zhuǎn)化和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解是導致這一病理過程的重要因素[3]。因此，深入了解VSMCs表型轉(zhuǎn)化的發(fā)病機制，尋找更有效、更安全的干預(yù)目標，對AD的防治具有重要的臨床價值和社會意義。仙茅屬植物為仙茅科天門冬目，其中仙茅苷(curculigoside，Cur)是仙茅的主要活性成分。目前已有研究發(fā)現(xiàn)仙茅苷對心血管系統(tǒng)有明顯的保護作用[4-5]。但其在血管平滑肌細胞中的影響和機制方面的研究相對較少。

此次研究使用體外方式進行實驗，先對大鼠的胸主動脈的平滑肌細胞進行培養(yǎng)，將其通過脂多糖誘導血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化，探討仙茅苷對主動脈血管平滑肌細胞增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化的作用及其機制。旨在為仙茅苷臨床用于主動脈夾層的治療提供理論依據(jù)和新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 從濟南朋月實驗動物繁育有限公司購買30只無特定病原體的雄性SD大鼠(體質(zhì)量180～210 g)。許可證號：SYXK(魯)20190003。所有大鼠在濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院動物房內(nèi)飼養(yǎng)和訓練，許可證號：SYXK(魯)20180022。飼養(yǎng)期間所有大鼠自由飲食，室內(nèi)溫度20～25 ℃，濕度45%～55%。

1.2 試劑與儀器 噻唑藍(MTT，北京索萊寶公司)；仙茅苷標準品(上海鼎瑞化工有限公司)。兔源抗大鼠MMP-9、α-SMA、NF-κB和β-actin 抗體(美國Abcam公司)；羊抗鼠IgG(美國Abcam公司)；細胞裂解蛋白提取液、BCA試劑盒以及蛋白酶抑制劑(上海碧云天生物公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Biopac公司)；電泳、濕轉(zhuǎn)移槽以及Western blot發(fā)光照相系統(tǒng)(美國Rio-Red公司)；酶標儀(美國Biotech公司)；生物顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 血管平滑肌細胞培養(yǎng) 將實驗所需大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞通過組織貼塊法進行培養(yǎng)[6]。實驗大鼠處死后將其胸主動脈小心取出并除去其外周殘存的結(jié)締組織，然后將其剪成1 mm大小的組織塊，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，使其瓶底向上，在其中添加細胞培養(yǎng)基5 mL，置于培養(yǎng)箱中，在30 ℃ 5% CO2條件下進行3 h孵育處理，在培養(yǎng)瓶中組織塊完全與培養(yǎng)瓶底貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)，以保證其中組織塊能夠被培養(yǎng)基完全覆蓋，培養(yǎng)7 d后將培養(yǎng)瓶取出更換其中的培養(yǎng)基，對VSMCs的繁殖情況進行觀察，然后每隔一天對培養(yǎng)基進行更換到細胞完全融合成片為止。

1.3.2 細胞分組及處理 原代VSMCs傳代培養(yǎng)4-6代，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長現(xiàn)象，當細胞密度>90%，且形態(tài)良好時則可進行分組干預(yù)：①對照(control)組：DMSO 溶劑對照組(0.1%)培養(yǎng)24 h；②脂多糖(LPS)組：給予1 μg·mL-1LPS培養(yǎng)24 h；③脂多糖+仙茅苷(LPS+Cur)組：加入Cur(2.5、5、10 μmol·L-1)0.5 h后再加入1 μg·mL-1LPS培養(yǎng)24 h；④Cur組：加入10 μmol·L-1的Cur進行干預(yù)后培養(yǎng)24 h。

1.3.3 MTT法檢測細胞增殖率 將各組VSMCs通過添加10%胎牛血清的培養(yǎng)液進行處理，得到相應(yīng)的單個細胞懸液，然后按照每孔1 000～10 000個細胞的接種量，200 μL/孔的標準將其加入96孔板中，然后進行相應(yīng)干預(yù)，每組設(shè)置6個復孔，接種完成后，將其置于環(huán)境為37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進行48 h的細胞培養(yǎng)，之后取出96孔板，棄去其中剩余培養(yǎng)液，按照每孔20 μL向其中添加5 mg·mL-1的MTT溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后將孔內(nèi)剩余的培養(yǎng)上清液小心清除。按照每孔150 μL的要求向其中添加DMSO，然后振蕩10 min，確保其中的結(jié)晶物能夠完全融解。將所得液體置于酶聯(lián)免疫檢測儀中，在490 nm波長下檢測并記錄各孔的光吸收值，然后根據(jù)所得結(jié)果繪制橫縱坐標分別為時間和吸光值的細胞生長曲線。重復進行3次。增殖抑制率=(對照組OD值-各組實驗組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.3.4 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移率 詳細實驗操作基于相關(guān)參考文獻確定[7]。傳代處理血管平滑肌細胞后，按照5×105的規(guī)格將其接種到6孔板中，對其進行相應(yīng)處理后，通過潔凈槍頭在板表面垂直劃平行的3條劃痕。以此計時為0 h，拍照后將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h取出拍照，根據(jù)劃痕寬度變化計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.3.5 通過Western blot法對細胞中MMP-9、α-SMA以及NF-κB蛋白的表達情況進行檢驗 各組細胞經(jīng)上述干預(yù)因素處理48 h后提取細胞蛋白，并根據(jù)BCA法所測蛋白濃度調(diào)整加入各組蛋白樣品的體積，保證各組蛋白上樣樣品質(zhì)量一致。依次通過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，滴加一抗α-SMA、MMP-9、NF-κB(1∶1 000稀釋)4℃過夜，洗膜、孵育對應(yīng)二抗、再次洗膜后用現(xiàn)配發(fā)光液進行曝光顯影，Bio-Rad照相系統(tǒng)進行照相并分析蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學分析 將所得實驗數(shù)據(jù)通過SPSS 20.0軟件進行處理分析，所得結(jié)果均通過加減標準差的形式進行表示，在比較不同組情況時，將兩兩間的比較t檢驗進行驗證，多組間的比較通過One-way ANOVA方法進行驗證，若檢驗結(jié)果顯示P<0.05，則組間差異顯著，存在統(tǒng)計價值。

2 結(jié)果

2.1 仙茅苷影響血管平滑肌細胞增殖率的情況 根據(jù)MTT比色法對其進行處理，發(fā)現(xiàn)LPS組相較于控制組而言，在給予細胞LPS處理后，其OD值出現(xiàn)明顯提高(P<0.001)；而比較LPS組細胞OD值和LPS+Cur組細胞OD值，發(fā)現(xiàn)后者的OD值顯著下降(P<0.01)；Cur組細胞增殖率與對照組相比無統(tǒng)計學差異。表明LPS預(yù)處理血管平滑肌細胞可明顯增加血管平滑肌細胞增殖，而仙茅苷可明顯抑制脂多糖對血管平滑肌細胞的增殖作用(見表1)。

表1 仙茅苷對血管平滑肌細胞增殖率的影響

2.2 仙茅苷對血管平滑肌細胞遷移率的影響 與對照組相比，LPS誘導的主動脈血管平滑肌細胞遷移率升高(P<0.001)；而與LPS組相比，LPS+Cur組主動脈血管平滑肌細胞遷移率降低(P<0.01)；Cur組與對照組相比細胞遷移率無明顯統(tǒng)計學差異。表明給予大鼠主動脈血管平滑肌細胞仙茅苷能夠抑制因LPS刺激引起的細胞遷移(見表2)。

表2 仙茅苷對血管平滑肌細胞遷移率的影響

2.3 仙茅苷對血管平滑肌細胞相關(guān)蛋白表達水平的影響 與對照組相比，LPS組細胞內(nèi)MMP-9及NF-κB蛋白表達量明顯增加，而α-SMA蛋白表達量顯著減少(P<0.01)；LPS+Cur組細胞內(nèi)MMP-9及NF-κB蛋白表達量與LPS組相比減少明顯，α-SMA蛋白表達量顯著增加(P<0.05)；Cur組與對照組相比無明顯統(tǒng)計學差異。表明仙茅苷可抑制脂多糖誘導的血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)，且其機制可能與NF-κB信號通路有關(guān)(見圖1)。

圖1 仙茅苷對血管平滑肌細胞α-SMA、MMP-9以及NF-κB蛋白表達水平的影響

3 討論

主動脈夾層(AD)是常見的危及生命的疾病。由諸如馬凡綜合癥狀基因突變引起的AD被稱為可遺傳的AD，自發(fā)發(fā)生而沒有已知基因突變的AD被稱為散發(fā)的AD，并且與高齡、性別、吸煙、高血壓和血脂異常等危險因素相關(guān)[8]。遺傳性和散發(fā)性AD具有以下共同的組織學特征:血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化、彈性纖維破壞和損耗及炎性細胞浸潤等，以上因素導致主動脈壁弱化、主動脈擴張、剝離和最終破裂[1]。其中主動脈壁中層血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化在AD發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的作用。

血管平滑肌細胞(VSMCs)是動脈中層的基本組成部分，對動脈生理和病理學至關(guān)重要。血管平滑肌細胞和其他處于終末分化期的細胞不同，其表現(xiàn)出十分有效的可塑性。當機體處于健康狀態(tài)時不會使得血管平滑肌細胞受到刺激，其不會出現(xiàn)大量的遷移或者增殖并且細胞保有較強的收縮能力，在這一狀態(tài)下其會表達包括平滑肌α肌動蛋白(α-SMA)以及平滑肌22α蛋白(SM22α)等具有特定功能的收縮蛋白和細胞骨架蛋白以維持細胞正常形態(tài)功能。但是若改變細胞所處環(huán)境，將可能對血管平滑肌細胞產(chǎn)生刺激，血管平滑肌細胞轉(zhuǎn)化成去分泌表型細胞，此狀態(tài)下細胞的收縮能力會大大降低，并且表現(xiàn)出較強的遷移和增殖能力，并表達基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)等特異性標志物[9-10]。因此抑制VSMCs的表型轉(zhuǎn)化及其所致的異常增殖與遷移對于防治AD等血管相關(guān)疾病具有重要意義。

仙茅是石蒜科多年生草本植物，富含多糖、皂苷、酚類、酚苷、萜類等多種重要的生物活性物質(zhì)。仙茅苷是仙茅的主要活性化合物，其具有抗氧化、抗抑郁、防止骨質(zhì)疏松等多種藥理作用[5]。近年來Cur在心血管領(lǐng)域研究逐漸成為熱點，尤其對心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞均有保護作用[11-12]，而其在血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化中的作用尚未見報道，仍需進一步研究。

本研究結(jié)果顯示,脂多糖作用于VSMCs后,可顯著增加VSMCs增殖率、遷移率及MMP-9的蛋白表達量，降低細胞內(nèi)α-SMA蛋白表達量；進一步提示脂多糖可誘導血管平滑肌細胞從收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化，進而導致增殖率、遷移率明顯升高。而與LPS組相比,LPS+Cur組血管平滑肌細胞的增殖率、遷移率以及MMP-9的蛋白表達量明顯減低，細胞內(nèi)α-SMA蛋白表達量明顯升高，進一步提示仙茅苷可抑制由脂多糖誘導血管平滑肌細胞增殖、遷移及細胞表型轉(zhuǎn)化的改變。而在進一步研究我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS組細胞內(nèi)NF-κB蛋白表達量明顯升高；而LPS+Cur組血管平滑肌細胞內(nèi)NF-κB蛋白表達量顯著降低于LPS組。表明仙茅苷可抑制由脂多糖誘導的血管平滑肌細胞NF-κB蛋白表達升高。因此，仙茅苷在逆轉(zhuǎn)VSMCs由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化的過程可能是通過抑制NF-κB分子以及其介導的相關(guān)信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)仙茅苷可明顯抑制由脂多糖誘導的血管平滑肌細胞表型自收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化，進而抑制血管平滑肌細胞的增殖率與遷移率，其作用機制可能通過抑制NF-κB信號通路實現(xiàn)，或可為臨床治療主動脈夾層等心血管疾病提供理論基礎(chǔ)。本研究局限性在于僅初步探討仙茅苷抑制血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的分子機制，其對于主動脈夾層等心血管疾病的防治作用還待進一步研究。