田慧勇，李曉娜*，楊宇燕，黃藤波，李廣鵬，甘慧

（1.深圳市通量檢測(cè)科技有限公司，廣東 深圳 518102；2.廣東省檢迅檢測(cè)科技有限公司，廣東 東莞 523843；3.深圳市深業(yè)航天食品與環(huán)境檢測(cè)科技有限公司，廣東 深圳 518100；4.深圳市匯知科技有限公司，廣東 深圳 518101）

氟喹諾酮類(lèi)藥物（FQs）是人造非甾體抗生素[1]。諾氟沙星（NOR）用于治療由彎曲桿菌、大腸桿菌、志賀氏菌和霍亂弧菌引起的疾病，也可治療淋病、眼部感染和尿路感染[2]。環(huán)丙沙星（CIP）則用于治療全身感染，包括尿路、呼吸道、胃腸道和皮膚感染，其通過(guò)抑制細(xì)菌DNA螺旋酶的一個(gè)亞蛋白來(lái)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖[3]。這些喹諾酮類(lèi)藥物也經(jīng)常被用作飼料添加劑[4]，其廣泛使用對(duì)人類(lèi)的健康構(gòu)成潛在危害，如耐藥菌株的出現(xiàn)或可誘發(fā)癌癥[5]。對(duì)藥物殘留進(jìn)入食物鏈并導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的擔(dān)憂促使歐盟和中國(guó)建立了各類(lèi)抗生素的最大殘留水平[6]。

近年來(lái)已報(bào)道了幾種測(cè)定諾氟沙星和環(huán)丙沙星的方法，其中包括高效液相色譜法[7]、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法[8]、電化學(xué)方法[9]和分光光度法[10]。高效液相色譜法系統(tǒng)復(fù)雜、維護(hù)復(fù)雜、樣品用量大、試劑昂貴限制了其應(yīng)用。化學(xué)發(fā)光法和分光光度法不能用于測(cè)定復(fù)雜生物樣品中的氟喹諾酮類(lèi)藥物，因?yàn)樗鼈兎蛛x效率太低。近年來(lái)毛細(xì)管電泳法因其簡(jiǎn)單、高效、對(duì)溶劑和樣品的要求不高、成本相對(duì)較低，在生物樣品的定量分析中引起了廣泛關(guān)注[11]。通過(guò)液-液萃取或固相萃?。⊿PE）的方法處理樣品，過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)且需要大量有機(jī)溶劑?；|(zhì)固相分散前處理方法（MSPD）基于SPE，其中基質(zhì)的均勻分散體與合適的固體吸附劑（硅膠、硅藻土、氧化鋁、C18等）混合。該方法已成功從魚(yú)肉組織中提取諾氟沙星和環(huán)丙沙星，與其他方法相比MSPD需要的分析時(shí)間更短、樣本量更小、消耗溶劑更少[12]。

本試驗(yàn)建立了一種同時(shí)測(cè)定魚(yú)肉組織中諾氟沙星和環(huán)丙沙星殘留的毛細(xì)管電泳（CZE）方法。MSPD用于從魚(yú)肉組織中提取諾氟沙星和環(huán)丙沙星。本試驗(yàn)重點(diǎn)是MSPD前處理及毛細(xì)管電泳分離效率的參數(shù)優(yōu)化，最后將該方法用于實(shí)際樣品中諾氟沙星和環(huán)丙沙星的分析，取得了較好的結(jié)果。

1 材料和儀器

1.1 主要試劑與材料

諾氟沙星和環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。甲醇（AR）、甲苯（AR）、氯仿（AR）和乙腈（AR）夠自北京化工廠，硼酸（H3BO3）（AR）和氫氧化鈉（NaOH）（AR）購(gòu)自天津化學(xué)試劑總廠，硅藻土（Florisil，200目）、二氧化硅（200目）購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥生物制品研究所。YWG-C18-（C18-）和YWG-C8-（C8-）鍵合二氧化硅材料（表面積300 m2/g、平均孔徑10μm）購(gòu)自中科安泰科技有限公司。草魚(yú)購(gòu)自深圳市寶安區(qū)某超市。

1.2 主要儀器設(shè)備

冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)eppendorf；M3 basic渦旋儀和Topolino磁力攪拌購(gòu)自德國(guó)IKA；TP-213 電子天平購(gòu)自美國(guó) DENVER Instrument；DHG-9140A 電熱恒溫干燥箱購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DF-101S恒溫加熱器購(gòu)自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；毛細(xì)管電泳儀（型號(hào)：PA800）購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter；該儀器配備紫外線（UV）檢測(cè)器，自帶32K 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和儀器控制。Milli-Q水凈化系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Millipore，18.2 MΩ·cm超純水經(jīng)0.22μm過(guò)濾膜過(guò)濾使用。

2 試驗(yàn)方法

2.1 固相萃取材料的制備

先將Florisil、二氧化硅、C18和C8在650℃下烘焙后干燥5小時(shí)，再于100℃下干燥2小時(shí)后，儲(chǔ)存于干燥器中以備將來(lái)使用。

2.2 MSPD方法前處理

MSPD的步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。約0.02 g草魚(yú)腹部肉在2 mL NaCl（1 mol/L）中均質(zhì)，轉(zhuǎn)移到玻璃砂漿中，然后浸泡在適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液中。10分鐘后將1.0 g C18（分散吸附劑）與樣品混合。將均勻混合物裝入預(yù)先包裝有0.2 g C18顆粒的針筒中。用3.0 mL甲醇-H2O（1∶19，v/v）沖洗針筒，并用3.0 mL乙腈洗脫。洗脫液在50℃下氮?dú)庑D(zhuǎn)蒸發(fā)。干殘?jiān)?00 μL流動(dòng)相緩沖液復(fù)溶后，上機(jī)待測(cè)。

2.3 CE色譜條件

未處理的的石英毛細(xì)管（60 cm×75 μm）需進(jìn)行活化，用0.1 mol/L NaOH溶液沖洗30分鐘，Milli-Q純凈水沖洗30分鐘，然后用流動(dòng)相緩沖液浸泡30分鐘。40 mmol/L的硼酸溶液用NaOH調(diào)節(jié)至pH 8.5作為流動(dòng)相，施加16 kV的電壓進(jìn)行分離。通過(guò)液體冷卻系統(tǒng)使毛細(xì)管的溫度保持在25℃。在1.0 psi的壓力下2 秒鐘將緩沖液注射，在280 nm紫外檢測(cè)器中進(jìn)行檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 MSPD前處理優(yōu)化

在萃取前將諾氟沙星和環(huán)丙沙星添加到空白的魚(yú)肉組織中，使其終濃度為10 μg/g。均質(zhì)、混合后研究四種吸附材料（Florisil、二氧化硅、C8和C18）的回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。四種吸附劑性能的比較表明，C18的吸附效率顯著優(yōu)于二氧化硅、Florisil和C8，其原因可能為C18的極性與目標(biāo)分析物相似。C18作為分散吸附劑時(shí)，兩種目標(biāo)分析物的回收率最高，分別為87.8%和92.3%。當(dāng)使用其他吸附劑時(shí)，兩種目標(biāo)分析物的回收率較低，且干擾分析物檢測(cè)的峰較多。因此，選擇C18作為最佳分散吸附劑。

表1 不同吸附劑對(duì)諾氟沙星和環(huán)丙沙星回收率的影響(n＝3)

由于MSPD前處理是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，并且根據(jù)樣品的性質(zhì)，如極性、溶解度、pKa等，應(yīng)仔細(xì)選擇洗滌和洗脫溶劑。以甲苯、氯仿、甲醇和水為備選洗滌溶劑，研究了MSPD中的洗滌步驟，以提高M(jìn)SPD的選擇性并降低交叉反應(yīng)。以甲醇-H2O（1∶19，v/v）為洗滌溶劑時(shí)，洗滌效果最好。當(dāng)甲醇-H2O的體積小于3.0 mL時(shí)，觀察到內(nèi)源性成分的干擾。然而當(dāng)甲醇-H2O的體積大于3.0 mL時(shí)回收率降低。因此選擇3.0 mL甲醇-H2O（1∶19，v/v）為洗滌劑。此外還研究了水、甲醇和乙腈等洗脫溶液，以3.0 mL乙腈為洗脫液，諾氟沙星和環(huán)丙沙星的回收率最佳。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

電解質(zhì)濃度對(duì)分離性能有顯著影響，因?yàn)樗鼤?huì)影響焦耳熱、電滲流量、離子強(qiáng)度、電解質(zhì)粘度以及毛細(xì)管中產(chǎn)生的電流。因此電解質(zhì)濃度會(huì)影響保留時(shí)間和峰面積。對(duì)不同硼酸鹽濃度（10 ～70 mmol/L）進(jìn)行了研究，結(jié)果見(jiàn)圖1。將緩沖溶液的pH值調(diào)整至8.5，并將兩種目的分析物的濃度為10.0 μg/g時(shí)，當(dāng)硼酸鹽濃度從10 mmol/L變化至40 mmol/L，分析物的峰面積逐漸增加；當(dāng)硼酸鹽濃度高于40 mmol/L時(shí)，峰面積顯著減小，分析時(shí)間顯著增加，保留時(shí)間延長(zhǎng)。因此最佳硼酸鹽濃度為40 mmol/L。

圖1 緩沖液濃度對(duì)峰面積的影響

由于諾氟沙星（pKa1 6.1，pKa2 8.5）和環(huán)丙沙星（pKa1 6.1，pKa2 8.7）是兩性離子化合物[20]，緩沖液pH不僅影響電滲流量，還會(huì)影響兩種分析物的存在形式。本試驗(yàn)研究了緩沖液pH值對(duì)兩種分析物分離的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)硼酸鹽的濃度為40 mmol/L時(shí)，兩種分析物的濃度為10.0 μg/g時(shí)，結(jié)果表明峰面積隨著pH值從6.5～8.5增加而增加。然而當(dāng)pH值大于8.5時(shí)，峰面積幾乎不變，但保留時(shí)間延長(zhǎng)，原因是分析物以陰離子的形式存在。當(dāng)pH值高于8.5時(shí)，它們?cè)?80 nm波長(zhǎng)處具有最大的吸光度。因此在后續(xù)研究中緩沖液流動(dòng)相的pH值為8.5。

圖2 緩沖液pH值對(duì)峰面積的影響

在10～20 kV范圍內(nèi)對(duì)電壓的優(yōu)化。隨著外加電壓的增加，保留時(shí)間縮短，峰面積增加，但分辨率降低，實(shí)驗(yàn)選擇了16 kv的外加電壓，該電壓下具有良好的靈敏度和保留時(shí)間。

表2 諾氟沙星和環(huán)丙沙星在魚(yú)肉組織中的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

通過(guò)在空白魚(yú)肉組織樣品中添加不同濃度的諾氟沙星和環(huán)丙沙星來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0.10～500 μg/g的濃度范圍內(nèi)，獲得了魚(yú)肉組織中諾氟沙星和環(huán)丙沙星的線性校準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9994和0.9986。諾氟沙星和環(huán)丙沙星的檢出限（LOD）（信噪比為3，S/N＝3）分別為0.04 μg/g和0.03 μg/g，諾氟沙星和環(huán)丙沙星的定量限（LOQ）（信噪比為3，S/N＝10）分別為0.12 μg/g和0.10 μg/g。歐盟確定在肉類(lèi)中的諾氟沙星和環(huán)丙沙星的最大殘留限量為100 μg/kg[14]。因此，該方法具有足夠的靈敏度，可以應(yīng)用于魚(yú)肉組織中。

3.4 樣本分析

將不同濃度（0.50 μg/g、2.00 μg/g和10.00 μg/g）的諾氟沙星和環(huán)丙沙星加標(biāo)到空白魚(yú)肉組織中，考察了該方法的回收率和精密度。表3總結(jié)了日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在本試驗(yàn)中，諾氟沙星的精密度在中濃度和高濃度水平下通常小于5.6%，在低濃度水平下不超過(guò)6.8%，回收率始終在86.4%到105.2%之間。環(huán)丙沙星在中、高濃度水平下的精密度＜5.1%，在低濃度水平下的精密度不超過(guò)6.2%，回收率在90.1%～103.6%之間。該方法的回收率和精密度都優(yōu)于ELISA方法。圖3顯示了從空白和加標(biāo)魚(yú)肉組織樣品中的毛細(xì)管電泳譜圖。

圖3 毛細(xì)管電泳譜圖

表3 諾氟沙星和環(huán)丙沙星在魚(yú)肉組織中的精密度和回收率（n=9）

4 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了一種利用MSPD前處理方法并通過(guò)毛細(xì)管電泳法測(cè)定魚(yú)肉組織中諾氟沙星和環(huán)丙沙星的方法，研究了樣品前處理方法的條件。對(duì)毛細(xì)管電泳條件也進(jìn)行了參數(shù)優(yōu)化：選擇合適的緩沖液濃度、pH值和電壓等；并對(duì)方法的線性關(guān)系、檢出限、加標(biāo)回收等進(jìn)行了系統(tǒng)的考察。試驗(yàn)表明：該方法具有前處理簡(jiǎn)單、污染小、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠等優(yōu)點(diǎn)，可以用于大批量魚(yú)肉制品中諾氟沙星和環(huán)丙沙星殘留的檢測(cè)，為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定提供技術(shù)參考。