謝玉春，閔莉

福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122

膽囊膽固醇結(jié)石是臨床常見(jiàn)病和高發(fā)病，多發(fā)于女性、肥胖及中老年人群。飲食不規(guī)律、偏嗜高油高脂飲食等是目前我國(guó)膽囊膽固醇結(jié)石呈高發(fā)病率的主要原因[1-2]。常見(jiàn)的建立膽固醇結(jié)石動(dòng)物模型方法包括控制動(dòng)物飲食成分、縮窄及梗阻動(dòng)物膽道、異物植入膽囊等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期高脂致石飲食喂養(yǎng)可導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)高血脂、肝臟脂肪性變、膽汁膽固醇過(guò)飽和，最終出現(xiàn)膽囊膽固醇結(jié)石，該方法成石率高、安全可靠，且表現(xiàn)的病理生理學(xué)變化與膽囊膽固醇結(jié)石患者相似[4]，是制備膽囊膽固醇結(jié)石動(dòng)物模型的常用方法。膽囊膽固醇結(jié)石與肝膽系統(tǒng)結(jié)構(gòu)功能異常、脂代謝失衡和免疫功能障礙等病理變化相關(guān)，制備可靠、高效的膽囊膽固醇結(jié)石模型是研究防治膽囊膽固醇結(jié)石的基礎(chǔ)，意義重大[5]。高脂致石飲食可成功制備疾病模型，但不同致石飼料的選用會(huì)影響模型建立的周期與效果。本研究通過(guò)對(duì)比相同喂養(yǎng)周期下不同飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型的效果，探討制備高效、可靠膽囊膽固醇結(jié)石動(dòng)物模型的方法。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物36只5周齡SPF級(jí)ICR雄性小鼠，體質(zhì)量(18±2) g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005。所有小鼠飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障系統(tǒng)，室溫(20±2) ℃，濕度50%～55%，12 h周期性光照環(huán)境，經(jīng)普通顆粒飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，無(wú)不良反應(yīng)且飲食、飲水正常者納入實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)，倫理批號(hào)：FJTCM IACUC2021067。

1.2 藥物與試劑小鼠總膽固醇(total cholesterol，TC)、總膽汁酸(total bile acids，TBA)、磷脂(phospholipid，PL)、膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)ELISA試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：MM-0632M2、MM-44537M2、MM-1001M2、MM-0028M1)。

1.3 儀器EG1150H型生物組織包埋機(jī)、RM2245型石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；SB80型攤片機(jī)、SW85型烤片機(jī)(德國(guó)Microm公司)；SZ66型體視顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限公司)；Axio Imager A2型顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與模型制備將36只5周齡SPF級(jí)ICR雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、2%高脂組、1%膽固醇組，每組12只。對(duì)照組采用普通顆粒飼料(60%碳水化合物、22%蛋白質(zhì)、10%脂肪、8%纖維)喂養(yǎng)；2%高脂組采用2%高脂飼料(每1 kg含全價(jià)飼料粉料825 g，膽固醇20 g，膽酸5 g，牛油150 g)喂養(yǎng)[6-7]；1%膽固醇組采用1%膽固醇致石飼料(0.5%膽酸鹽、1%膽固醇、56%碳水化合物、10%乳脂、18%蛋白質(zhì))喂養(yǎng)[8]，自由攝食16周后，通過(guò)查看小鼠膽囊結(jié)石的大小和數(shù)量、膽囊體積、膽汁渾濁度及透光性等評(píng)估模型。

2.2 小鼠存活率、成石率及結(jié)石形成情況觀察飼養(yǎng)過(guò)程中動(dòng)態(tài)觀察小鼠精神狀態(tài)、飲食及飲水情況，記錄各組小鼠的死亡數(shù)量，計(jì)算存活率。小鼠處死后，觀察并記錄各組造模成功的小鼠數(shù)量及膽囊體積大小、膽汁的渾濁度、透光性等。

2.3 肝臟、膽囊HE染色喂養(yǎng)16周后，小鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射麻醉后摘眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，打開(kāi)腹腔，完整剝離膽囊并清理表面血液，體視鏡拍照后將膽汁吸取放入EP管保存?zhèn)溆?，膽囊組織放入固定液中保存。在肝大葉處取一塊大小約為5 mm×5 mm的肝組織放入40 ng·L-1多聚甲醛固定，脫水、透明、包埋、切片、染色、封片后在顯微鏡下觀察膽囊、肝臟組織的形態(tài)變化。

2.4 膽汁中TC、TBA、PL、CCK的測(cè)定嚴(yán)格根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行操作，檢測(cè)膽囊中膽汁相關(guān)成分的含量。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠存活率、成石率及膽汁情況比較對(duì)照組小鼠無(wú)死亡，膽囊大小正常，膽汁澄清透亮，透光性好，膽囊內(nèi)無(wú)沉淀。2%高脂組小鼠死亡1只，膽汁呈渾濁狀態(tài)，透光性變差，8只小鼠膽囊可見(jiàn)固體沉淀，成石率為67%。1%膽固醇組小鼠死亡1只，膽囊體積明顯增大，膽汁呈褐色渾濁狀態(tài)，透光性差，有10只小鼠膽囊出現(xiàn)明顯的固體沉淀，成石率約為83%。見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組小鼠存活率、成石率比較 只

圖1 各組小鼠膽囊結(jié)石情況

3.2 各組小鼠膽囊膽汁脂類成分含量及CCK水平比較與對(duì)照組比較，2%高脂組和1%膽固醇組膽汁內(nèi)TC含量升高，膽汁TBA、PL、CCK含量降低；與2%高脂組比較，1%膽固醇組膽汁TC、CCK含量降低，膽汁內(nèi)TB、PL含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。2%高脂組和1%膽固醇組膽汁中TC、TBA、PL三者比例失衡，膽汁內(nèi)膽固醇溶解率低，膽汁具有成石趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠膽囊膽汁脂類成分含量及CCK水平比較

3.3 各組小鼠肝臟、膽囊病理學(xué)改變肝臟HE染色顯示，對(duì)照組肝臟細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整；2%高脂組小鼠肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，可見(jiàn)大量脂質(zhì)空泡，肝臟存在明顯的脂肪變性；1%膽固醇組肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，肝臟出現(xiàn)小的脂質(zhì)空泡。膽囊HE染色顯示，對(duì)照組膽囊壁結(jié)構(gòu)正常；2%高脂組膽囊壁肌層變厚，漿膜結(jié)構(gòu)及形態(tài)破壞；1%膽固醇組膽囊壁肌層毛糙、增厚，漿膜結(jié)構(gòu)及形態(tài)破壞嚴(yán)重。見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 各組小鼠肝臟病理組織圖(HE，×150)

圖3 各組小鼠膽囊病理組織圖(HE，×200)

4 討論

膽囊膽固醇結(jié)石的發(fā)病涉及一系列復(fù)雜病理變化，年齡、性別、飲食習(xí)慣等相關(guān)危險(xiǎn)因素[9]通過(guò)影響脂質(zhì)代謝[10]、膽囊功能運(yùn)動(dòng)[11]致使膽汁化學(xué)成分異常[12]、膽汁淤積、細(xì)菌感染等誘發(fā)膽囊膽固醇結(jié)石。膽固醇為膽囊膽固醇結(jié)石的主要成分，膽汁膽固醇過(guò)飽和是膽固醇結(jié)石形成的首要條件[13]。正常膽汁中含有膽固醇、膽汁酸、磷脂三種脂類[14-16]。肝臟調(diào)控機(jī)體膽固醇的合成、分解、吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，膽汁中膽固醇來(lái)源于肝細(xì)胞攝取的血漿脂蛋白膽固醇和肝細(xì)胞合成的膽固醇[17]。膽酸循環(huán)是清除類固醇物質(zhì)的主要途徑，膽汁內(nèi)膽固醇溶于膽鹽形成的微膠粒中，肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇異常代謝引起膽汁酸、磷脂等三種脂類比例失調(diào)是膽囊膽固醇結(jié)石重要的病理基礎(chǔ)[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，2%高脂和1%膽固醇飲食喂養(yǎng)的兩組小鼠肝臟可見(jiàn)脂質(zhì)空泡，膽汁TC水平升高，而TBA及PL水平下降，膽囊內(nèi)膽汁渾濁，透光性差，且可見(jiàn)固體沉淀。膽固醇的攝入導(dǎo)致肝臟分泌到膽汁的膽固醇過(guò)多，產(chǎn)生的膽汁酸和磷脂過(guò)少，膽汁內(nèi)脂類比例失調(diào)，膽汁膽固醇含量增高，過(guò)多膽固醇附著在膽囊黏膜表面最終形成膽囊膽固醇結(jié)石，即含膽固醇飲食誘導(dǎo)膽囊膽固醇結(jié)石模型的方法可靠。

研究表明，膽汁中的膽固醇飽和狀態(tài)不是形成膽固醇結(jié)石的唯一條件[19]，膽囊動(dòng)力損傷可加速過(guò)飽和膽固醇結(jié)晶析出成石過(guò)程。膽囊膽固醇結(jié)石產(chǎn)生于膽囊，膽囊規(guī)律性的收縮和舒張運(yùn)動(dòng)促進(jìn)膽汁的排出，可防止膽結(jié)石的發(fā)生。CCK介導(dǎo)膽囊收縮及胰酶分泌[20]，是調(diào)節(jié)膽囊運(yùn)動(dòng)最主要的激素，可評(píng)估膽囊功能[21]。動(dòng)物模型和臨床研究提示，膽囊壁CCK受體在膽石癥膽囊收縮損害中起重要作用[22]。膽囊結(jié)石患者血漿CCK水平明顯降低[23]，血液循環(huán)中CCK與膽囊壁CCK受體結(jié)合可觸發(fā)膽囊收縮，將膽汁釋放到十二指腸，因此，CCK水平可間接反映膽囊壁CCK受體活性。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與2%高脂組相比，1%膽固醇組CCK水平明顯降低，膽囊體積明顯增大，膽囊內(nèi)有較大的固體沉淀，膽汁褐色渾濁，透光性差，膽囊壁毛糙、增厚嚴(yán)重。1%膽固醇組小鼠低水平CCK含量導(dǎo)致膽囊壁CCK與受體結(jié)合減弱，膽囊動(dòng)力不足致使膽汁淤積于膽囊，膽囊體積增大；膽汁過(guò)度濃縮致使膽汁內(nèi)成分發(fā)生改變，膽汁呈褐色渾濁狀態(tài)。CCK水平差異及膽囊結(jié)構(gòu)病理變化導(dǎo)致膽囊動(dòng)力減弱，為成石膽汁中過(guò)飽和的膽固醇成核、析出提供充足的時(shí)間和空間。

綜上所述，膽固醇飲食是建立膽囊膽固醇結(jié)石動(dòng)物模型的重要因素，長(zhǎng)期喂養(yǎng)含膽固醇致石飼料可導(dǎo)致肝臟脂肪性變，膽汁內(nèi)三種脂類比例失調(diào)，膽固醇成核析出。但膽固醇對(duì)膽石癥的貢獻(xiàn)度受脂質(zhì)代謝的內(nèi)在差異影響[24]，致石飼料中膽固醇含量的高低并不是影響模型效果的唯一或者決定性條件。膽囊膽固醇結(jié)石是多因素共同作用的結(jié)果，1%膽固醇組與2%高脂組模型成功建立與攝入含膽固醇飲食導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)代謝異常有關(guān)，而兩組的模型效果差異可能與兩組CCK水平及膽囊形態(tài)結(jié)構(gòu)差異影響的膽囊動(dòng)力密切相關(guān)。2%高膽固醇飼料為課題組前期構(gòu)建膽石癥“病”模型主要方法，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比1%膽固醇飼料與2%高膽固醇飼料喂養(yǎng)建立模型的差異發(fā)現(xiàn)，同一條件下，1%膽固醇飼料制備膽石癥模型效果優(yōu)于2%高膽固醇飼料，即1%膽固醇飼料可作為制備膽囊膽固醇結(jié)石模型的備選，為課題組后期探討中醫(yī)藥防治膽石癥分子機(jī)制研究及其他相關(guān)研究提供模型支持。不同成分配比的致石飲食構(gòu)建的模型效果存在差異，本研究?jī)H對(duì)比了兩種致石飼料的模型差異，研究范圍較局限，對(duì)構(gòu)建模型方法的選用有一定的參考價(jià)值，但未篩選出最優(yōu)的造模方法。1%膽固醇組與2%高脂組CCK水平及膽囊形態(tài)改變與“病”模型差異具有一致性，但本研究未進(jìn)行膽囊收縮功能相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明模型差異與膽囊動(dòng)力的相關(guān)性。除飲食成分外，膽石癥模型效果與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬[25]、品系[26-27]、性別[28]等因素密切相關(guān)，構(gòu)建成石率高、造模周期較短、動(dòng)物存活率高的簡(jiǎn)單、可復(fù)制理想模型仍需進(jìn)一步研究探索。