高 璐，李香格，祁亨年，臧 影，賈良權(quán)，趙光武，唐琦哲，鄭 雯,

（1. 湖州師范學(xué)院 信息工程學(xué)院，浙江 湖州 313000；2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

種子的呼吸作用是指在酶的參與下將種子本身的儲(chǔ)藏物質(zhì)進(jìn)行一系列的氧化分解，同時(shí)釋放二氧化碳、水以及能量的過(guò)程，是種子萌發(fā)過(guò)程中不可或缺的能量來(lái)源，其變化會(huì)直接影響種子的生理現(xiàn)象。種子的呼吸強(qiáng)度又稱(chēng)呼吸速率是衡量其呼吸作用強(qiáng)弱的重要生理指標(biāo)[1]，反映了種子的活力與代謝等生理現(xiàn)象的強(qiáng)弱，與種子的儲(chǔ)藏存在密切關(guān)系。呼吸代謝途徑的順利啟動(dòng)是種子萌發(fā)并健康成長(zhǎng)為幼苗的關(guān)鍵因素，對(duì)植物的后續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響。儲(chǔ)藏過(guò)程中種子的呼吸作用會(huì)改變種子的質(zhì)量和品質(zhì)，影響種子活力，能否控制好種子呼吸是關(guān)系種子儲(chǔ)藏成敗的主要問(wèn)題[2]，因此，對(duì)種子呼吸過(guò)程進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)十分必要。本研究對(duì)種子呼吸檢測(cè)方法及其原理進(jìn)行了綜述，分析了各種檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)與存在的問(wèn)題，討論了種子呼吸檢測(cè)方法在種子呼吸代謝、種子儲(chǔ)藏和種子活力等方面的研究與應(yīng)用。

1 種子呼吸檢測(cè)方法

呼吸強(qiáng)度是種子生命活動(dòng)最重要的指標(biāo)之一，有效檢測(cè)種子呼吸強(qiáng)度是研究種子呼吸作用的重要前提。種子呼吸消耗氧氣(O2)，釋放二氧化碳(CO2)，所以氧氣消耗量或者CO2釋放量可以在一定程度上反映種子的呼吸強(qiáng)度。檢測(cè)種子呼吸耗氧量的方法有瓦氏微量法、Clark氧電極法和氧傳感技術(shù)檢測(cè)法(Q2技術(shù))等；檢測(cè)種子呼吸CO2釋放量的方法有小籃子法、紅外線(xiàn)CO2分析儀法和可調(diào)諧二極管激光吸收光譜(TDLAS)技術(shù)檢測(cè)法等。種子呼吸檢測(cè)方法向著檢測(cè)速度快、效率高、重現(xiàn)性好的方向發(fā)展，并將成為研究熱點(diǎn)。

1.1 小籃子法

小籃子法主要通過(guò)測(cè)量種子在密閉容器中呼吸產(chǎn)生CO2增加量來(lái)測(cè)定種子呼吸的強(qiáng)度。將種子放入小籃子中，密封廣口瓶，利用飽和堿液氫氧化鋇[Ba(OH)2]吸收種子呼吸過(guò)程中產(chǎn)生的CO2。待測(cè)試結(jié)束后，再用草酸溶液滴定殘留的Ba(OH)2，記錄消耗的草酸溶液量為V1，另取空白組滴定記錄草酸溶液量為V0。根據(jù)呼吸過(guò)程中Ba(OH)2減少量可定量測(cè)出種子在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中CO2的增加量?；谛』@子法測(cè)定種子呼吸強(qiáng)度的計(jì)算公式為：種子呼吸強(qiáng)度(mg·g-1·h-1)=(V0-V1)/(mt)，其中：m為種子鮮質(zhì)量(g)，t為測(cè)定時(shí)間(h)。

在不同激素、藥物和生長(zhǎng)環(huán)境下，種子萌發(fā)過(guò)程的呼吸作用會(huì)出現(xiàn)很大差異，利用小籃子法能夠直觀地研究種子在不同外界環(huán)境下呼吸作用的變化情況。張璇等[3]利用小籃子法觀測(cè)到適當(dāng)濃度的赤霉素浸種可以提高香果樹(shù)Emmenopterys henryi種子的呼吸速率；李佳等[4]利用小籃子法測(cè)定經(jīng)不同濃度赤霉素處理后的杜仲Eucommia ulmoides種子的呼吸強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)隨著赤霉素濃度上升，種子的呼吸速率下降；方能虎等[5]采用小籃子法對(duì)水稻Oryza sativa種子進(jìn)行呼吸檢測(cè)，觀察到種子萌發(fā)初期稀土元素對(duì)其呼吸速率動(dòng)態(tài)變化具有影響；楊雪鵬等[6]利用小籃子法研究不同濃度的維生素吡咯喹啉醌對(duì)水芹Oenanthe javanica種子萌發(fā)的影響。上述研究表明：利用小籃子法測(cè)定種子呼吸，能夠簡(jiǎn)單高效地獲取不同浸種環(huán)境下種子的呼吸變化規(guī)律，為不同環(huán)境因素對(duì)種子萌發(fā)生理效應(yīng)的探索奠定了基礎(chǔ)。

小籃子法操作簡(jiǎn)便，但不能完全反映種子呼吸CO2濃度的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，難以避免外界CO2的侵入和干擾，反應(yīng)不敏感，在一定程度上影響了種子呼吸強(qiáng)度檢測(cè)的精度，且計(jì)算相對(duì)復(fù)雜。李海霞等[7]對(duì)此做了改進(jìn)，以利于小籃子法的推廣。

1.2 瓦氏微量法

瓦氏呼吸儀(Warburg Respirometer)是測(cè)定生物因新陳代謝而產(chǎn)生的氣壓變化所用的裝置。其工作原理為在恒溫、恒體積的密閉系統(tǒng)中，用氫氧化鉀(KOH)溶液吸收CO2使得氣體壓力降低，利用測(cè)壓計(jì)顯示壓力值，從而得到種子呼吸過(guò)程中O2消耗量。利用瓦氏呼吸儀測(cè)量種子呼吸時(shí)，首先將種子稱(chēng)量后放入反應(yīng)瓶中，并將反應(yīng)瓶放入恒溫控制器。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后調(diào)節(jié)U型測(cè)壓管底部的旋鈕，使右側(cè)閉管內(nèi)測(cè)壓液的液面保持在h=150 mm，讀取左側(cè)開(kāi)管液面高度值。關(guān)閉三通活塞使壓力計(jì)與反應(yīng)瓶相通，待種子呼吸一段時(shí)間后，將右側(cè)液面仍調(diào)節(jié)至原處，并記錄左側(cè)液面高度，然后關(guān)閉測(cè)壓管。瓦氏微量法具有微量和多組測(cè)定的特點(diǎn)，靈敏度較高，壓力計(jì)上只要有1 mm的測(cè)壓液水柱變化就可以進(jìn)行測(cè)定，比小籃子法的靈敏度和精確度好。

呂洪飛等[8]利用瓦氏呼吸儀對(duì)杉木Cunninghamia lanceolata不同無(wú)性系小孢子葉球的呼吸強(qiáng)度進(jìn)行了測(cè)量，比較不育株與可育株小孢子葉球及其子葉的呼吸強(qiáng)度，并將所測(cè)結(jié)果與Clark氧電極法進(jìn)行比較，2種方法所測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致。黃真池等[9]參照黃學(xué)林等[10]的瓦氏微量法，使用Shw-2型呼吸儀在25 ℃下測(cè)定不同活力等級(jí)的白菜Brassica pekinensis種子在不同吸水時(shí)間下的呼吸速率，發(fā)現(xiàn)了高活力種子和中等活力種子在吸水初期(1～12 h)呼吸速率相差不明顯，低活力種子的呼吸速率在吸水前4 h明顯低于前兩者，但隨著吸水時(shí)間延長(zhǎng)，低活力種子的呼吸速率大小與高、中等級(jí)活力種子的呼吸速率逐漸接近。王亞文等[11]利用瓦氏呼吸儀測(cè)定在暗反應(yīng)與光反應(yīng)條件下黑豆Glycine max種子萌發(fā)時(shí)產(chǎn)生CO2和消耗O2之間的變化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)黑豆種子的呼吸速率變化符合“S”形曲線(xiàn)，存在明顯的呼吸滯緩期。

利用瓦氏呼吸儀測(cè)定種子呼吸強(qiáng)度在一定程度上提高了測(cè)量的靈敏度和準(zhǔn)確性。需要注意的是在瓦氏實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要保持溫度恒定，進(jìn)行溫度校準(zhǔn)，并盡可能采用小的呼吸室。為了避免瓦氏呼吸儀中壓力和溫度對(duì)呼吸室的容積產(chǎn)生影響，瓦氏微量法要求所取樣品體積小，因此，難以用于大粒種子呼吸強(qiáng)度的測(cè)量。此外，Gilson差分呼吸儀和Warburg呼吸計(jì)根據(jù)呼吸作用產(chǎn)生的壓力變化測(cè)得種子的呼吸速率，也屬于瓦氏微量法，但目前Gilson差分呼吸儀在種子呼吸檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用較少。

1.3 Clark氧電極法

Clark氧電極(Clark oxygen electrode)是一種極譜電極，最早用于測(cè)定水溶液中溶解氧的含量，在20世紀(jì)30年代就有人利用裸露的銀-鉑電極研究藻類(lèi)的光合作用。CLARK[12]在1956年提出薄膜氧電極，1983年，日本學(xué)者首次采用微機(jī)械加工技術(shù)將氧電極微型化，使得測(cè)氧技術(shù)更加簡(jiǎn)便穩(wěn)定[13]。Clark氧電極一般是用銀作陽(yáng)極，鉑作陰極，加上一層氧分子可以通過(guò)但液體不能通過(guò)的薄膜以防止電極被污染，充以氯化鉀(KCl)作為電解液。2個(gè)電極之間加上0.07 V左右的恒定電壓，在極化電壓及溫度恒定的條件下，將擴(kuò)散電流的大小作為溶解氧定量測(cè)定的基礎(chǔ)，即電流大小反應(yīng)溶解氧含量。Clark氧電極具有反應(yīng)快、靈敏度高、可連續(xù)測(cè)量、能夠記錄O2的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程等優(yōu)點(diǎn)，因此常用于研究植物根系、芽、種子、果實(shí)、葉片等組織的呼吸速率和耗氧情況，分析糖酵解、三羧酸循環(huán)等呼吸代謝途徑，從而研究植物組織的休眠和休眠解除等變化過(guò)程。

線(xiàn)粒體與種子呼吸直接相關(guān)，是細(xì)胞進(jìn)行三羧酸循環(huán)和生物氧化的場(chǎng)所[14-15]。BENAMAR等[16]在25 ℃下用校準(zhǔn)氧電極檢測(cè)種子碎片和線(xiàn)粒體耗氧量，證實(shí)了線(xiàn)粒體功能與種子品質(zhì)之間具有相關(guān)性。王偉青等[17]利用Clark氧電極分別測(cè)定黃皮Clausena lansium種子胚軸、子葉和線(xiàn)粒體的耗氧速率，研究黃皮種子的脫水敏感性與種子呼吸速率顯著降低的關(guān)系。陶宗婭等[18]采用Clark氧電極測(cè)定大豆Glycine max和豌豆Pisum sativum種子子葉和去子葉胚的耗氧量，研究低溫吸脹對(duì)種子呼吸代謝的影響。

Clark氧電極法實(shí)現(xiàn)了種子呼吸的連續(xù)測(cè)量，提高了測(cè)量精度和靈敏度，但該方法對(duì)溫度變化較為敏感，在測(cè)定中需要維持溫度恒定。除此之外，測(cè)定前需要先從種胚中提取和純化線(xiàn)粒體，操作方法較為繁瑣，且需保持良好的線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)不被其他細(xì)胞器污染，對(duì)操作要求較高。

1.4 紅外線(xiàn)CO2分析儀法

20世紀(jì)50年代，為了克服傳統(tǒng)氣體測(cè)壓方法操作復(fù)雜、難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等缺點(diǎn)，利用CO2氣體能夠強(qiáng)烈吸收紅外線(xiàn)特定波段能量的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)制造了紅外線(xiàn)CO2分析儀(Infrared CO2Analyzer)[19]，其工作原理為：由光源發(fā)出的紅外線(xiàn)經(jīng)反射鏡分成2束能量相等的平行光束，分別通過(guò)參比氣室與分析氣室2個(gè)氣室。由于氣體吸收紅外線(xiàn)能量，使得原來(lái)能量相等的2束紅外線(xiàn)產(chǎn)生了能量差，被電容檢測(cè)器接收后轉(zhuǎn)變成1個(gè)電信號(hào)，從而間接測(cè)量出待測(cè)CO2的濃度。紅外線(xiàn)CO2分析儀具有操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)靈敏，讀數(shù)直觀，數(shù)據(jù)可存儲(chǔ)等優(yōu)點(diǎn)，已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)業(yè)和氣體監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域[20-21]。

諸多學(xué)者利用紅外線(xiàn)CO2分析儀測(cè)定種子呼吸強(qiáng)度，探究種子呼吸與其萌發(fā)過(guò)程之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了很多重要的呼吸現(xiàn)象。如陳潤(rùn)政等[22]利用FQ-W-002型紅外線(xiàn)CO2分析儀對(duì)花生Arachis hypogaea種子呼吸強(qiáng)度進(jìn)行了研究，證實(shí)了種子呼吸強(qiáng)度與其生活力的密切相關(guān)。陳禪友等[23]使用GXH-3010E型便攜式紅外線(xiàn)CO2分析儀測(cè)定黃秋葵Hibiscus esculentus種子在萌發(fā)期間的呼吸速率，發(fā)現(xiàn)其呼吸速率變化曲線(xiàn)符合“快—慢—快”的規(guī)律，并且發(fā)芽率高的種子比發(fā)芽率低的種子呼吸速率更高。劉美[24]利用GXH-305型便攜式紅外線(xiàn)CO2分析儀測(cè)量不同溫度條件下小麥‘山農(nóng)17’Triticum aestivum‘Shannong 17’種子萌發(fā)期間呼吸速率變化，證明了溫度對(duì)種子的萌發(fā)進(jìn)程具有重要影響，溫度過(guò)高或過(guò)低均不利于種子萌發(fā)。

與小籃子法和瓦氏呼吸儀相比，利用紅外線(xiàn)CO2分析儀測(cè)定種子呼吸強(qiáng)度，精度較高，能夠在一定程度上減少人為干涉，提高種子呼吸強(qiáng)度測(cè)量的準(zhǔn)確度。目前，國(guó)內(nèi)紅外線(xiàn)CO2分析儀多是進(jìn)口儀器，價(jià)格較為昂貴，且在測(cè)量過(guò)程中環(huán)境溫度變化會(huì)影響紅外光源的穩(wěn)定，直接影響測(cè)量結(jié)果。

1.5 氧傳感技術(shù)檢測(cè)法(Q2技術(shù))

氧傳感技術(shù)(oxygen sensing technology)檢測(cè)法是在密閉環(huán)境中，通過(guò)測(cè)量種子萌發(fā)過(guò)程中氧氣的消耗情況來(lái)檢測(cè)種子呼吸強(qiáng)度，由荷蘭ASTEC Global公司開(kāi)發(fā)。該技術(shù)基于熒光猝滅原理，由氧傳感檢測(cè)儀向含有熒光材料的種子萌發(fā)試管中釋放藍(lán)光，藍(lán)光被熒光物質(zhì)吸收并發(fā)出紅光返回傳感器。O2分子可以消耗紅光能量(即猝滅效應(yīng))。當(dāng)種子萌發(fā)消耗氧氣時(shí)，試管內(nèi)O2濃度降低，返回的紅光隨之增強(qiáng)，所以紅光的強(qiáng)度與O2分子的濃度成反比。在測(cè)量過(guò)程中，操作軟件會(huì)根據(jù)O2濃度和時(shí)間自動(dòng)繪制成耗氧曲線(xiàn)，測(cè)定種子呼吸時(shí)消耗O2的濃度，得到種子呼吸強(qiáng)度。根據(jù)耗氧曲線(xiàn)的特征，設(shè)定不同的氧代謝值，通過(guò)種子萌發(fā)啟動(dòng)時(shí)間(IMT)、萌發(fā)O2消耗速率(OMR)、臨界O2壓強(qiáng)(COP)、理論萌發(fā)時(shí)間(RGT)和理論萌發(fā)率(RGR)等值，快速區(qū)分不同活力種子。

諸多學(xué)者對(duì)不同植物種子進(jìn)行測(cè)量，分析了氧傳感技術(shù)測(cè)定種子呼吸的原理、測(cè)定方法和測(cè)定結(jié)果，取得了較多研究成果。陳能阜等[25]利用氧傳感技術(shù)測(cè)定了番茄Solanum lycopersicum、辣椒Capsicum annuum、黃瓜Cucumis sativus、茄Solanum melongena、杉木和馬尾松Pinus massoniana等6種植物種子耗氧情況，發(fā)現(xiàn)不同種類(lèi)、活力等級(jí)相同的種子，其耗氧曲線(xiàn)形狀類(lèi)似。利用耗氧曲線(xiàn)分析了IMT、OMR、COP和RGT等參數(shù)，全面分析了種子O2消耗曲線(xiàn)的特征。陳合云[26]選用浙江省主栽的秈稻和粳稻各20個(gè)品種，通過(guò)室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)、田間出苗試驗(yàn)和氧傳感檢測(cè)試驗(yàn)，確定了適用于常規(guī)秈稻種子和粳稻種子最佳氧傳感指標(biāo)分別為RGR和OMR，并且基于氧傳感技術(shù)研究了經(jīng)處理后種子活力的變化情況，表明氧傳感技術(shù)測(cè)定種子呼吸可以有效地將老化處理、未處理與引發(fā)處理的種子區(qū)分開(kāi)。

氧傳感技術(shù)是集生物技術(shù)與信息技術(shù)于一體的自動(dòng)化測(cè)定種子呼吸耗氧能力的新技術(shù)，目前已經(jīng)被應(yīng)用于多種類(lèi)型種子的活力水平測(cè)定[27-28]。該方法可以測(cè)量單粒種子在萌發(fā)過(guò)程中的呼吸速率，然而該方法需要對(duì)種子進(jìn)行萌發(fā)，屬于有損檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，需要每間隔30 min或1 h對(duì)種子呼吸耗氧數(shù)據(jù)進(jìn)行1次采樣，無(wú)法展示種子耗氧曲線(xiàn)的細(xì)節(jié)。

1.6 TDLAS技術(shù)檢測(cè)法

可調(diào)諧二極管激光吸收光譜技術(shù)(tunable diode laser absorption spectroscopy, TDLAS)利用激光器發(fā)出的光被待測(cè)氣體選擇性吸收來(lái)測(cè)量氣體的濃度。HINKLEY[29]和REID等[30]在20世紀(jì)中期最早提出通過(guò)吸收光譜來(lái)檢測(cè)氣體濃度。1981年，REID等[31]利用波長(zhǎng)調(diào)制技術(shù)采集數(shù)據(jù)，最終得到了和氣體濃度成正比的二次諧波表達(dá)式，從而推動(dòng)了TDLAS技術(shù)向高精度氣體濃度檢測(cè)的研究方向發(fā)展。由于TDLAS技術(shù)目前已經(jīng)能夠達(dá)到10-9級(jí)別甚至10-12級(jí)別的檢測(cè)限，因此，很多學(xué)者利用TDLAS技術(shù)檢測(cè)CO2的濃度[32-33]。目前，TDLAS技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究主要包括：土地排放的氣體濃度和通量的檢測(cè)[34]、植物葉片水分蒸騰速率的測(cè)量[35]、農(nóng)產(chǎn)品運(yùn)輸冷藏車(chē)內(nèi)CO2濃度的檢測(cè)[36]等方面，而對(duì)種子呼吸檢測(cè)的研究較少。種子代謝產(chǎn)物成為種子活力檢測(cè)的新思路[37]。

賈良權(quán)等[38]基于TDLAS技術(shù)自主搭建了一套種子呼吸檢測(cè)系統(tǒng)。相較于近紅外光譜技術(shù)、高光譜技術(shù)和 X 光譜技術(shù)，該系統(tǒng)檢測(cè)成本較低，能夠反演出水稻和玉米Zea mays種子呼吸過(guò)程中產(chǎn)生的CO2濃度曲線(xiàn)。通過(guò)與發(fā)芽試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，證明種子呼吸強(qiáng)度與種子活力等級(jí)的之間存在高度相關(guān)性。從水稻和玉米等種子呼吸與活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，TDLAS技術(shù)可以對(duì)種子呼吸強(qiáng)度進(jìn)行連續(xù)實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)，檢測(cè)精度可以達(dá)到10-6。通過(guò)優(yōu)化設(shè)計(jì)光路和選擇合適波長(zhǎng)，可以進(jìn)一步提高檢測(cè)精度，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)單粒種子的呼吸情況?？梢?jiàn)該方法具有較廣闊的發(fā)展前景。此外，理論上TDLAS技術(shù)既可以檢測(cè)CO2，也可以檢測(cè)O2，因此，該方法也可以通過(guò)測(cè)定耗氧量來(lái)檢測(cè)種子的呼吸強(qiáng)度，但在實(shí)際測(cè)量時(shí)參數(shù)選擇會(huì)直接影響最終檢測(cè)結(jié)果，選擇實(shí)驗(yàn)參數(shù)的依據(jù)仍有待完善。

表1歸納了上述幾種種子呼吸檢測(cè)方法的原理及優(yōu)缺點(diǎn)，小籃子法、瓦氏微量法、Clark氧電極法、紅外線(xiàn)CO2分析儀法等由于其檢測(cè)精度限制，只能檢測(cè)批量種子的呼吸強(qiáng)度或者長(zhǎng)時(shí)間累計(jì)種子的呼吸強(qiáng)度。新興技術(shù)如氧傳感技術(shù)檢測(cè)法和TDLAS技術(shù)檢測(cè)法等在種子呼吸檢測(cè)領(lǐng)域具有較好的發(fā)展?jié)摿ΑＦ渲?，小籃子法、瓦氏微量法、Clark氧電極法等單次最小樣本檢測(cè)量通常為1批或數(shù)克，其檢測(cè)精度取決于溶液或滴定反應(yīng)沉淀物稱(chēng)量的準(zhǔn)確性，檢測(cè)時(shí)間取決于人為操作時(shí)間。

表 1 種子呼吸檢測(cè)方法比較Table 1 Comparison of respiration detection methods for seeds

2 種子呼吸及其應(yīng)用研究

2.1 種子呼吸與代謝關(guān)系研究

呼吸代謝是生命活動(dòng)的中心，種子內(nèi)存在多條呼吸代謝途徑，最基本的3條途徑為糖酵解(EMP)途徑、三羧酸(TCA)循環(huán)和磷酸戊糖(PPP)途徑。不同的代謝途徑提供不同的能荷和還原力，在各發(fā)育階段有不同的代謝途徑與之相適應(yīng)。呼吸代謝各途徑的強(qiáng)弱與呼吸速率和種子萌發(fā)密切相關(guān)[40-41]，通過(guò)探索種子的代謝途徑及其各階段呼吸強(qiáng)度的變化，研究呼吸代謝在種子休眠與萌發(fā)中的作用，有助于找到打破種子休眠機(jī)制的依據(jù)，從而控制種子的休眠與萌發(fā)，縮短育種年限，提高育種效率[42]。

在研究種子休眠與萌發(fā)過(guò)程各呼吸代謝途徑的變化規(guī)律中，種子的呼吸速率是重要的測(cè)定指標(biāo)[43]。SIMMONDS等[44]在驗(yàn)證PPP途徑在種子休眠解除起重要作用的研究中，利用Warburg呼吸儀測(cè)量不同后熟期種子0～10 h的呼吸變化。利用此測(cè)定方法只能對(duì)收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，計(jì)算種子呼吸速率，不能實(shí)時(shí)反映種子呼吸連續(xù)變化情況。浦心春等[45]在研究休眠及打破休眠種子的發(fā)芽過(guò)程中加入了各種呼吸抑制劑，得出各代謝途徑呼吸速率占總呼吸速率的比例，分析結(jié)果表明：TCA途徑及PPP途徑?jīng)]有充分活化是導(dǎo)致休眠種子不能發(fā)芽的原因之一。采用小籃子法測(cè)定種子呼吸CO2的釋放速率，雖操作簡(jiǎn)便，但受環(huán)境影響較大，并且只能人工讀取結(jié)果，容易造成誤差。陳麗培等[46]將培養(yǎng)過(guò)程中的油松Pinus tabuliformis種子每隔9 h取出并放入LI-6400光合作用呼吸儀中測(cè)量其呼吸速率，獲得呈“S”形曲線(xiàn)的呼吸速率變化結(jié)果，并結(jié)合代謝途徑關(guān)鍵酶活性的測(cè)定，得出種子在培養(yǎng)初期以EMP途徑為主，而中后期由EMP途徑轉(zhuǎn)向PPP途徑和TCA途徑。該研究采用的LI-6400光合作用呼吸儀基于紅外線(xiàn)CO2測(cè)量原理，可以有效地測(cè)定種子呼吸速率，具有測(cè)量相對(duì)精確、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，但該方法需要間隔較長(zhǎng)時(shí)間(9 h)取出樣品進(jìn)行測(cè)量，時(shí)間分辨率較低，對(duì)獲得的呼吸曲線(xiàn)質(zhì)量有一定影響。

呼吸代謝由EMP/TCA途徑轉(zhuǎn)向PPP途徑對(duì)種子休眠的解除具有重要作用，通過(guò)呼吸速率測(cè)定可以了解種子各代謝途徑的活化程度。為了進(jìn)一步探究種子休眠與萌發(fā)機(jī)制，需要綜合分析多種因素及其相互作用，結(jié)合種子呼吸速率、酶活性和內(nèi)源激素調(diào)控，全面把握種子生理變化，使呼吸代謝的研究具有更大的理論意義和實(shí)際效益。種子呼吸檢測(cè)方法在種子休眠解除與促進(jìn)萌發(fā)的研究中具有關(guān)鍵作用，研究者們采用不同的呼吸代謝檢測(cè)方法對(duì)種子呼吸代謝途徑的呼吸速率進(jìn)行測(cè)定。傳統(tǒng)方法受環(huán)境因素影響較大，靈敏度低，時(shí)間分辨率有限，并且由人工讀取測(cè)量結(jié)果容易造成實(shí)驗(yàn)誤差，合理選取或研究新型高靈敏度且自動(dòng)化程度高的種子呼吸代謝測(cè)定方法有助于提高種子呼吸代謝效率以及結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2 種子呼吸與儲(chǔ)藏關(guān)系研究

種子儲(chǔ)藏是種質(zhì)資源離體保存、年度間用種余缺調(diào)劑與應(yīng)急用種的有效措施[47]。種子的呼吸作用是種子儲(chǔ)藏期間的重要生理活動(dòng)，控制好種子的呼吸作用，減少儲(chǔ)藏物質(zhì)的消耗，保持種子旺盛的生命力，才能達(dá)到種子安全儲(chǔ)藏的目的[48]。測(cè)定種子的呼吸強(qiáng)度可以衡量其呼吸作用的強(qiáng)弱，有利于了解儲(chǔ)藏過(guò)程中種子生理狀態(tài)、環(huán)境影響因素與種子呼吸強(qiáng)度之間的關(guān)系，為改善儲(chǔ)藏條件提供必要數(shù)據(jù)支撐。胡小榮等[49]將儲(chǔ)藏12個(gè)月的大蔥Allium fistulosum和油菜Brassica campestris種子分別存于50、35、20和-18 ℃環(huán)境下，并利用GC-7AG氣相色譜儀測(cè)定種子呼吸速率，研究發(fā)現(xiàn)：隨著儲(chǔ)藏溫度的升高，大蔥和油菜種子的CO2釋放量增大，同一儲(chǔ)藏溫度下，隨著含水量的降低，種子CO2釋放量減少。LIU等[50]在常溫與低溫2種環(huán)境下，用小籃子法測(cè)定儲(chǔ)藏第4年的馬尾松種子的呼吸強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)在常溫開(kāi)放儲(chǔ)藏環(huán)境下，種子呼吸旺盛、養(yǎng)分消耗快，易喪失生活力，而采用低溫密封法可以較好地保持種子的生活力?？梢?jiàn)，在一定范圍內(nèi)，呼吸作用的強(qiáng)度會(huì)隨溫度的上升而增強(qiáng)。在儲(chǔ)藏期間，溫度變化導(dǎo)致的種子呼吸變化還可能影響種子的感官品質(zhì)。王道營(yíng)等[51]將玉米種子在不同溫度條件下儲(chǔ)藏一段時(shí)間后，取出放入密閉玻璃瓶中，通過(guò)GXH-3010D型紅外CO2分析儀測(cè)定一段時(shí)間內(nèi)種子的呼吸變化情況，發(fā)現(xiàn)在不同溫度下含糖量遞減速率隨溫度的升高而加大，在較低儲(chǔ)藏溫度下甜玉米含糖量較高，呼吸強(qiáng)度和失水量較低，能夠保持較高的食用品質(zhì)。種子的水分含量與空氣成分同樣是種子呼吸的重要影響因素。王若蘭等[52]取適量預(yù)處理后的小麥種子放入SKW-3儀器的呼吸瓶?jī)?nèi)，測(cè)定在不同溫度、水分和氧氣濃度下小麥種子呼吸速率的變化。結(jié)果表明：在一定條件下，小麥種子呼吸作用的強(qiáng)度隨著溫度或水分的升高而加強(qiáng)，隨著氧氣濃度的降低而逐漸被抑制。

部分學(xué)者指出：種子呼吸作用在儲(chǔ)藏期間受溫度、濕度及環(huán)境中O2、CO2等因素的影響[53]，通過(guò)降溫、干燥、缺氧儲(chǔ)藏等手段能夠有效抑制種子的呼吸作用[54]，使種子處于極微弱的呼吸狀態(tài)，保持種子品質(zhì)，延長(zhǎng)儲(chǔ)藏時(shí)間，減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的經(jīng)濟(jì)損失。然而在不同環(huán)境中，部分呼吸檢測(cè)儀器同樣會(huì)受到環(huán)境因素變化的影響，如小籃子法難以避免外界CO2氣體的干擾，且僅能測(cè)量取出后儲(chǔ)藏種子的呼吸強(qiáng)度，無(wú)法及時(shí)反映不同儲(chǔ)藏環(huán)境下種子的呼吸情況；Gilson差分呼吸儀和Warburg呼吸計(jì)2種儀器對(duì)壓強(qiáng)或溫度變化都極為敏感，設(shè)置不同溫度與O2濃度環(huán)境，都需要對(duì)儀器進(jìn)行平衡，且耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)；紅外線(xiàn)CO2分析儀和TDLAS技術(shù)等方法可以通過(guò)調(diào)節(jié)氣室環(huán)境來(lái)測(cè)量不同溫度、氣體濃度下種子的呼吸作用，能有效避免環(huán)境因素對(duì)儀器產(chǎn)生的影響。可見(jiàn)，在儲(chǔ)藏環(huán)境因素對(duì)種子呼吸強(qiáng)度影響的研究中，所采用的種子呼吸檢測(cè)方法不僅要結(jié)果精確、自動(dòng)化程度高，還需盡量減少環(huán)境因素干擾，才可以實(shí)時(shí)反映不同儲(chǔ)藏環(huán)境下種子的呼吸變化情況。

2.3 種子呼吸與活力關(guān)系研究

種子活力作為衡量種子質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和自然環(huán)境等民生問(wèn)題有著重要影響[55]。種子的呼吸強(qiáng)度與其活力存在一定的正相關(guān)性[56-57]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者嘗試采用不同的檢測(cè)技術(shù)對(duì)種子呼吸過(guò)程中O2的消耗量或產(chǎn)生的CO2量進(jìn)行檢測(cè)，研究種子呼吸與活力相關(guān)性。在種子活力研究中采用測(cè)定耗氧量的方法有：Gilson差分呼吸儀法、瓦氏微量法、Clark氧電極法[58]和氧傳感技術(shù)檢測(cè)法等。

WOODSTOCK等[59]將玉米種子置于裝有5 mL水的反應(yīng)瓶中并連接Gilson差分呼吸儀，測(cè)量種子吸水開(kāi)始后2～30 h的耗氧情況，得出在空氣環(huán)境下種子的呼吸速率與根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)的相關(guān)系數(shù)分別為0.82和0.79，表明種子呼吸速率與發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)之間呈顯著正相關(guān)。趙光武等[37]探討了氧傳感測(cè)定指標(biāo)與杉木種子發(fā)芽測(cè)定指標(biāo)之間的相關(guān)性，應(yīng)用氧傳感技術(shù)軟件自動(dòng)繪制耗氧曲線(xiàn)并計(jì)算，得到COP，指出呼吸強(qiáng)度開(kāi)始降低時(shí)O2濃度與發(fā)芽率呈顯著負(fù)相關(guān)。鐘希瓊等[60]在水稻種子萌發(fā)進(jìn)行到80～88 h時(shí)，用滴定法(同小籃子法)測(cè)定種子呼吸速率，研究發(fā)現(xiàn)：其生活力、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均與呼吸速率呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.847、0.931、0.937和0.870。賈良權(quán)等[38]基于TDLAS檢測(cè)技術(shù)選取3個(gè)活力等級(jí)的甜玉米種子，將預(yù)處理后的種子放入基于TDLAS技術(shù)的種子呼吸容器中，啟動(dòng)設(shè)備自動(dòng)存儲(chǔ)數(shù)據(jù)并繪制呼吸產(chǎn)生的CO2濃度曲線(xiàn)圖，計(jì)算得到第3～8小時(shí)各時(shí)刻種子的呼吸強(qiáng)度與活力指數(shù)的相關(guān)系數(shù)均大于0.900。這表明種子的呼吸強(qiáng)度可以快速反映種子的活力水平。

上述研究結(jié)果表明：玉米、水稻、杉木等種子的呼吸強(qiáng)度與其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)等呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性。但目前還存在一些科學(xué)問(wèn)題尚未解決，如在同一遺傳品系內(nèi)部種子呼吸強(qiáng)度與種子活力的定量關(guān)系，以及不同遺傳品系間種子的活力與呼吸強(qiáng)度相關(guān)度等具體問(wèn)題。針對(duì)上述問(wèn)題，可通過(guò)種子呼吸檢測(cè)及發(fā)芽試驗(yàn)，定量研究種子呼吸強(qiáng)度與種子活力之間的相關(guān)關(guān)系，以期通過(guò)呼吸強(qiáng)度的檢測(cè)來(lái)準(zhǔn)確判定種子活力的高低，從而提高制種效率。氧傳感技術(shù)與TDLAS技術(shù)在種子呼吸檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用，使得種子活力檢測(cè)向著快速、準(zhǔn)確且自動(dòng)化程度高的方向發(fā)展。相比發(fā)芽、田間出苗等試驗(yàn)，氧傳感技術(shù)與TDLAS技術(shù)操作更加簡(jiǎn)便、耗時(shí)較短、效率更高，可將呼吸強(qiáng)度作為鑒定種子活力的生理指標(biāo)，并在種子選擇、檢驗(yàn)、儲(chǔ)藏等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

3 展望

種子呼吸強(qiáng)度的檢測(cè)可以用于研究種子休眠解除過(guò)程中各代謝途徑，了解種子的活力情況及收獲后的生理狀態(tài)，指導(dǎo)選用和生產(chǎn)高活力種子，在研究種子呼吸代謝、種子活力和種子儲(chǔ)藏等方面具有重要的意義與價(jià)值。結(jié)合目前種子呼吸檢測(cè)方法和應(yīng)用領(lǐng)域的研究進(jìn)展，筆者認(rèn)為應(yīng)著力從以下幾個(gè)方面開(kāi)展進(jìn)一步研究：①小籃子法、瓦氏微量法等目前常用的種子呼吸檢測(cè)方法多數(shù)存在不能實(shí)時(shí)反映種子呼吸變化等缺陷且屬于有損檢測(cè)。新型技術(shù)如紅外線(xiàn)CO2分析儀法、氧傳感技術(shù)法等近年得到了較好的應(yīng)用與發(fā)展，這些方法能夠獲得種子呼吸檢測(cè)的變化曲線(xiàn)，然而這些方法多針對(duì)批量種子長(zhǎng)時(shí)間呼吸積累量進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)單粒種子以及種子萌發(fā)前的呼吸檢測(cè)尚無(wú)能為力，因此具有一定的應(yīng)用局限?？傮w種子呼吸檢測(cè)方法的研究進(jìn)展緩慢，對(duì)種子生理生化的深入研究產(chǎn)生了一定的影響。以TDLAS技術(shù)為代表的新型光學(xué)檢測(cè)方法具有高靈敏度、快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，其檢測(cè)精度能夠達(dá)10-6以下，通過(guò)選用強(qiáng)吸收線(xiàn)的激光器光源并配合長(zhǎng)光程種子吸收池，種子呼吸CO2檢測(cè)精度甚至可以達(dá)到10-9，種子呼吸消耗O2檢測(cè)精度達(dá)10-6級(jí)別?？梢?jiàn)，TDLAS技術(shù)是一種頗具前途的種子呼吸檢測(cè)方法，能夠有效地避免上述問(wèn)題，且TDLAS技術(shù)可以進(jìn)行CO2和O2等多種氣體的同步監(jiān)測(cè)，能夠全面掌握種子呼吸代謝過(guò)程變化情況。因此，隨著種子呼吸與生理生化、儲(chǔ)藏環(huán)境等相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，基于TDLAS等光學(xué)檢測(cè)技術(shù)的研究，同時(shí)開(kāi)展呼吸代謝中CO2和O2的同步監(jiān)測(cè)，研究出靈敏度更高、操作更為簡(jiǎn)單的種子呼吸檢測(cè)方法及裝備具有可行性。②目前，種子呼吸研究主要集中在種子呼吸代謝與休眠、萌發(fā)、代謝途徑等相關(guān)領(lǐng)域。隨著技術(shù)手段的提升，可以進(jìn)一步加強(qiáng)種子休眠、種子早期萌發(fā)機(jī)制以及鹽堿、溫度等環(huán)境脅迫與種子呼吸代謝關(guān)系研究，深入分析種子呼吸代謝及其影響因素的關(guān)系，從而完善種子呼吸代謝相關(guān)理論。③保持種子儲(chǔ)藏活力的關(guān)鍵因素之一在于降低種子的呼吸強(qiáng)度和減緩劣變進(jìn)程。在種子儲(chǔ)藏倉(cāng)庫(kù)中除了設(shè)置測(cè)溫儀、水分測(cè)定儀、發(fā)芽箱等設(shè)備，還應(yīng)該增加呼吸檢測(cè)儀器，監(jiān)測(cè)儲(chǔ)藏過(guò)程中種子的呼吸強(qiáng)度，及時(shí)了解種子的生理活動(dòng)狀態(tài)。開(kāi)展低成本種子儲(chǔ)藏呼吸CO2在線(xiàn)氣體監(jiān)測(cè)系統(tǒng)研制具有重要價(jià)值。④目前種子呼吸與種子活力的研究主要為定性研究，定量研究還相對(duì)較少。兩者定量關(guān)系模型的研究和建立可為利用種子呼吸進(jìn)行種子活力檢測(cè)提供重要的理論支撐。此外，在種子呼吸與種子活力關(guān)系研究中，應(yīng)將種子呼吸指標(biāo)和種子活力參數(shù)(種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù))以及種子發(fā)育過(guò)程中內(nèi)含物的變化情況相結(jié)合，全面分析種子呼吸強(qiáng)度與種子活力的定量關(guān)系，并以此為依據(jù)，探尋能夠?qū)⒎N子呼吸強(qiáng)度作為有效判定種子活力的方法，特別應(yīng)加強(qiáng)種子萌發(fā)前的呼吸與活力相關(guān)指標(biāo)的研究。