王 靜，李 瀟，鄧 杰，周長(zhǎng)明

（北京市藥品檢驗(yàn)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

復(fù)方營養(yǎng)混懸劑是一類基質(zhì)復(fù)雜、有效成分較多的特殊用途藥物制劑，主要用于滿足無法通過正常飲食獲得足夠營養(yǎng)需求的患者、癌癥患者和極低出生體重的嬰兒[1-4]。處方中的有效成分達(dá)30余種，其中維生素E有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[5]，影響許多與炎癥、細(xì)胞存活或凋亡、血管生成、腫瘤發(fā)生和衰老等相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑[6]，從而改善血液循環(huán)，促進(jìn)新陳代謝，提高機(jī)體免疫力，延緩衰老。近年，有關(guān)維生素E含量測(cè)定的研究報(bào)道較多[7-10]，但多是以維生素E為主要成分的制劑，而如復(fù)方營養(yǎng)混懸劑這類維生素E所占處方比例相對(duì)較低的藥物，相關(guān)質(zhì)量研究的報(bào)道較少。為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本文建立了高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定復(fù)方營養(yǎng)混懸劑中維生素E的含量。采用此方法可準(zhǔn)確測(cè)定該品種中維生素E含量，為產(chǎn)品質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津公司LC-20AT高效液相色譜儀（LC-20AT泵，SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱，SPD-M20A二極管陣列PDA檢測(cè)器，Lab-solution工作站）；Mettler Toledo公司XA205電子天平；PALL公司純水機(jī)；北京桑翌科技發(fā)展有限公司恒溫培養(yǎng)搖床；BUCHI公司Rotavapor R-3真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 試藥

2個(gè)廠家6批復(fù)方營養(yǎng)混懸劑，企業(yè)A批號(hào)：1709002，1709003，1709004；企業(yè)B批號(hào)：180101，180140，190204；維生素E對(duì)照品，批號(hào)：100062-201811，純度：98.0 %，中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，EMD Millipore公司；石油醚（30～60 ℃）為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Merck Hibar 250-4 LiChrosob RP-18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μl；理論塔板數(shù)按維生素E峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取維生素E對(duì)照品約25 mg，精密稱定，置入50 ml量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取上述溶液1 ml，置入10 ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品約5.0 g，精密稱定，加水25 ml，搖勻，置入錐形瓶中，加乙醇25 ml，并精密量取石油醚（30～60 ℃）20 ml，強(qiáng)力振搖15 min，靜置使分層，再精密量取醚層10 ml，40 ℃下于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干后，精密加入甲醇2.5 ml，振搖使殘?jiān)芙?，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系 取維生素E對(duì)照品20 mg，精密稱定，置入20 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液。精密量取儲(chǔ)備液1，2.5，1，1，1 ml，分別置入于100，100，20，10，5 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.01，0.025，0.05，0.1，0.2 mg/ml系列對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對(duì)照品濃度X （mg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=4 083 412.5X+4805.9，r=0.9999。結(jié)果表明，維生素E進(jìn)樣濃度在0.01～0.2 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5針，峰面積和保留時(shí)間的RSD分別為0.19 %和0.08 %。結(jié)果表明，進(jìn)樣精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液6份，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得含量分別為113.2 %，112.8 %，109.4 %，109.5 %，111.3 %，113.0 %，其RSD為1.57 %。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

2.3.4 檢測(cè)限和定量限 取對(duì)照品溶液適量，用甲醇逐級(jí)稀釋，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。當(dāng)進(jìn)樣濃度為0.45 μg/ml時(shí)，信噪比約為3:1，即檢測(cè)限為0.45 μg/ml；當(dāng)進(jìn)樣濃度為1.75 μg/ml時(shí)，信噪比約為10:1，即定量限為1.75 μg/ml。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品5.0 g，分別精密加入維生素E對(duì)照品溶液0.15，0.25和0.35 mg，制成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的供試品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度制備3份，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.6 專屬性

2.3.6.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液和供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，色譜圖見圖1。理論塔板數(shù)按維生素E峰計(jì)算大于2000。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)HPLC圖

2.3.6.2 破壞試驗(yàn) 取供試品溶液，進(jìn)行如下破壞試驗(yàn)：① 堿破壞：取供試品溶液400 μl，加入1 mmol/L氫氧化鈉溶液10 μl，搖勻，室溫放置30 min，再加入1 mmol/L鹽酸溶液10 μl，搖勻；② 酸破壞：取供試品溶液400 μl，加入1 mmol/L鹽酸溶液10 μl，搖勻，室溫放置30 min，再加入1 mmol/L氫氧化鈉溶液 10 μl，搖勻；③ 氧化破壞：取供試品溶液300 μl，加入1 %的過氧化氫10 μl，搖勻，室溫放置15 min；④ 高溫破壞：取供試品溶液在55℃ 放置1 h，放冷至室溫；⑤ 光照破壞：取供試品溶液，在4000 lx下光照24 h，搖勻，即得。分別取破壞后的溶液各20 μl，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖（圖2）。結(jié)果各破壞條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)峰與維生素E主峰達(dá)到有效的分離，對(duì)測(cè)定無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖2 破壞試驗(yàn)HPLC圖

2.3.7 穩(wěn)定性 取同一份供試品溶液，分別在0，4，8，12，24 h重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，RSD為1.18 %。結(jié)果表明，維生素E供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好（室溫避光條件下）。

2.3.8 耐用性的考察 通過調(diào)節(jié)流速、柱溫和更換不同品牌C18色譜柱，考察維生素E主峰的變化情況。結(jié)果表明，維生素E 峰的理論塔板數(shù)均大于2000，表明該方法耐用性良好。

2.4 樣品含量測(cè)定

取2個(gè)廠家6批樣品共12份，分別按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。按照外標(biāo)法計(jì)算復(fù)方營養(yǎng)混懸劑中維生素E的含量，結(jié)果見表2。維生素E含量在90.6 %～109.5 %。

表2 含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 關(guān)于維生素E的問題

維生素E結(jié)構(gòu)復(fù)雜，同系物多，在不同行業(yè)和不同標(biāo)準(zhǔn)中，其定義也不同[11]。進(jìn)口腸內(nèi)營養(yǎng)類藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中檢測(cè)的維生素E為α-生育酚，分子式是C29H50O2。現(xiàn)行國內(nèi)復(fù)方營養(yǎng)混懸劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中是以維生素E為標(biāo)準(zhǔn)品，其分子式是C31H52O3。此外，《中國藥典》[12]收載的維生素E原料及制劑均以維生素E計(jì)算。本文以現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用的維生素E為對(duì)照品，進(jìn)行維生素E的含量測(cè)定研究。

3.2 樣品提取方法的選擇

在進(jìn)口腸內(nèi)營養(yǎng)類藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，將維生素E皂化成α-生育酚后進(jìn)行檢測(cè)，前處理過程復(fù)雜，不確定因素較多，檢測(cè)結(jié)果偏差較大。本文采用石油醚一步提取維生素E，避免了反復(fù)提取可能造成的損失。實(shí)驗(yàn)中考察了配制供試品溶液時(shí)水和乙醇中維生素E殘留量，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)維生素E色譜峰，色譜圖見圖3，說明石油醚提取維生素E效率高。維生素E溶于石油醚中，兩次量取均采用精密量取的方式，能減少不確定因素，達(dá)到良好的重復(fù)性。

圖3 樣品提取方法考察HPLC圖

3.3 流動(dòng)相的選擇

維生素E屬于脂溶性維生素，極性弱，一般采用反相液相色譜法分離此類極性較弱的樣品。實(shí)驗(yàn)中分別采用甲醇、甲醇-水（98:2）、甲醇-水（95:5）為流動(dòng)相，結(jié)果表明，增加水相比例，維生素E出峰時(shí)間延長(zhǎng)，峰型變寬，檢測(cè)靈敏度降低。所以選擇純有機(jī)相甲醇為流動(dòng)相，也與現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中維生素E鑒別項(xiàng)的流動(dòng)相一致。

3.4 色譜柱的選擇

以甲醇為流動(dòng)相，考察了維生素E對(duì)照品溶液在Merck、Kromasil和Phenomenex 3個(gè)品牌的C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）的出峰情況。色譜圖見圖4，采用Phenomenex色譜柱時(shí)峰形不如其他兩個(gè)色譜柱，采用Merck和Kromasil色譜柱時(shí)主峰峰形良好，且均能達(dá)到理論塔板數(shù)要求，其中Merck色譜柱的理論塔板數(shù)最高，所以綜合峰型和理論塔板數(shù)的要求，最終選擇Merck色譜柱。

圖4 色譜柱考察 HPLC圖

3.5 結(jié)論

本文采用高效液相色譜法建立了復(fù)方營養(yǎng)混懸劑中維生素E含量測(cè)定方法。復(fù)方營養(yǎng)混懸劑有效成分繁多，維生素E在處方中的含量較低，需采用有效的前處理方法和靈敏的檢測(cè)手段進(jìn)行測(cè)定。本研究建立的方法滿足了含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證的要求，為復(fù)方營養(yǎng)混懸劑中維生素E的質(zhì)量控制提供了新的技術(shù)手段。