李建華,楊 雯,屈 瑋,呂伯龍,丁 霞,許 暉,何 蕾,姚 麗*

(1.安徽拓維檢測(cè)服務(wù)有限公司，安徽宣城 242000；2.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥 230601)

肥胖問(wèn)題逐漸年輕化，小到幾歲的兒童，太過(guò)肥胖會(huì)影響身體健康，導(dǎo)致三高等并發(fā)癥。越來(lái)越多的人開(kāi)始減肥，但考慮到藥物長(zhǎng)期累積的不安全性，由純植物或中藥制成的保健品成為越來(lái)越多人的選擇，因?yàn)樗鼈兊墓π睾汀?無(wú)副作用產(chǎn)生或副作用小。由于其市場(chǎng)占有率的不斷擴(kuò)大,部分不法商家利用化學(xué)藥劑成分作用效果顯著、快速見(jiàn)效的特點(diǎn)和人們對(duì)純植物、純中藥等健康產(chǎn)品的高度信賴(lài),在這些健康商品中擅自加入說(shuō)明書(shū)中沒(méi)有標(biāo)明的化學(xué)成分，使通常作用緩慢的現(xiàn)代中成藥似乎獲得了速效、快捷的好處，夸大產(chǎn)品作用來(lái)增加商品銷(xiāo)量，謀取不正當(dāng)利益。西布曲明是一種合成類(lèi)減肥藥物，化學(xué)分子式為 CHClN,其減肥的作用機(jī)制一直被認(rèn)為是作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過(guò)抑制再攝取去甲腎上腺素、5-羥色胺和多巴胺，提高去甲腎上腺素、5-羥色胺和多巴胺在突觸間隙的濃度，下丘腦飽食中樞保持興奮，食欲被抑制，碳水化合物的吸收降低，達(dá)到減肥的效果。西布曲明雖有一定減肥功效，但它可能會(huì)帶來(lái)心腦血管還有中樞神經(jīng)系統(tǒng)不可逆的損傷，嚴(yán)重的心血管風(fēng)險(xiǎn)，心率加快，血壓增高，惡心、食欲不振、頭暈，還可能導(dǎo)致中風(fēng)甚至死亡。在我國(guó)早已頒布并實(shí)施的《食品安全法》第38條明確指出“不得非法向食品中添加任何化學(xué)物質(zhì)”。西布曲明是國(guó)家明令禁止添加在保健食品中的一類(lèi)化學(xué)藥物，隨著人們對(duì)食品安全問(wèn)題的廣泛重視，發(fā)展快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏和高選擇性的西布曲明檢測(cè)方法，對(duì)于檢測(cè)保健食品中是否非法添加西布曲明、保障人們食用安全具有重要意義。

對(duì)于西布曲明的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要有超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、表面增強(qiáng)拉曼光譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜法，這些方法雖然靈敏度高、準(zhǔn)確性好，但是需要漫長(zhǎng)的前處理過(guò)程，設(shè)備操作煩瑣，對(duì)操作人員要求高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以滿(mǎn)足市場(chǎng)監(jiān)管時(shí)對(duì)大規(guī)模樣品現(xiàn)場(chǎng)篩查的需求。該試驗(yàn)主要利用抗原抗體免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，制備基于膠體金(gold nanoparticles，GNPs)標(biāo)記的側(cè)向?qū)游鲈嚰?lateral flow strips，LFS)，應(yīng)用于檢測(cè)非法添加在保健食品中的西布曲明，以期為現(xiàn)場(chǎng)對(duì)保健食品中西布曲明的快速篩查提供參考方法。

1 材料與方法

主要試劑。氯金酸、檸檬酸三鈉購(gòu)于百靈威科技有限公司；蔗糖、碳酸鉀、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)、酪蛋白(casein)、酪蛋白鈉(Na-Casein)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；西布曲明標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；西布曲明抗體和包被原購(gòu)于北京勤邦生物技術(shù)有限公司；聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)底板、玻璃纖維素膜、吸水墊、硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter，NC膜)和羊抗鼠二抗購(gòu)于上海捷一生物有限公司。

主要儀器。 高速冷凍離心機(jī)，Heraeus Fresco 17，美國(guó)賽默飛世爾公司；電子天平，JA2003，上海力辰科技有限公司；單反相機(jī)，A6100L，索尼有限公司；磁力加熱攪拌器，JB-3A，上海雷磁有限公司；各量程移液器，芬蘭雷勃公司；恒溫鼓風(fēng)干燥箱， 101-1B，鑫熊發(fā)儀器有限公司；微型旋渦混合儀，SI-0246，美國(guó)SI科技有限公司；試紙條噴膜儀，XYZ-3，美國(guó)BioDot；試紙條切條機(jī)，CM-4000，美國(guó)BioDot。

膠體金的制備。該研究采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金。將250 mL錐形瓶放在磁力加熱攪拌器上煮沸清洗4次，然后向瓶中倒入55 mL雙蒸水，在攪拌狀態(tài)下加入850 μL 5 g/L的氯金酸溶液，加熱至微沸后，保持1 500 r/min的攪拌轉(zhuǎn)速不變，迅速向錐形瓶中加入一定體積5 g/L的檸檬酸三鈉溶液。觀察到瓶中溶液的顏色迅速改變，透明—黑—酒紅色，當(dāng)錐形瓶中液體的顏色不再改變，關(guān)閉加熱開(kāi)關(guān)，繼續(xù)攪拌5 min，冷卻至室溫，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

膠體金-單克隆抗體耦聯(lián)復(fù)合物的制備。取500 μL膠體金溶液于1.5 mL離心管中，用0.1 mol/L的碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)溶液pH為弱堿性，再加入一定體積1 mg/mL的西布曲明單克隆抗體振蕩反應(yīng)1 h后，加入50 μL封閉劑封閉多余的位點(diǎn)，繼續(xù)振蕩反應(yīng)1 h，8 000 r/min離心10 min，產(chǎn)生紅色沉淀；去上清后用重懸液50 μL重懸即可得到西布曲明的金標(biāo)抗體溶液，制備金標(biāo)墊。

膠體金試紙條的組裝。一個(gè)完整的試紙條由支撐底板、樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸水墊5部分組成。首先將玻璃纖維素膜切成寬度為17 mm的條狀，放置在樣品墊處理液中浸泡2 h， 26 ℃烘干備用。然后將西布曲明包被原、羊抗鼠二抗用10 mmol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)分別稀釋至0.8、1.0 mg/mL，依次吸入噴膜儀后噴至NC膜上，作為檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，26 ℃烘2 h至干燥，最后依次將吸水墊、NC膜和樣品墊粘貼在底板上，用切條機(jī)切割成3 mm寬的條狀。

試紙條的檢測(cè)。在膠體金與抗體耦聯(lián)過(guò)程中，優(yōu)化抗體添加量、重懸液的種類(lèi)這2個(gè)關(guān)鍵的試驗(yàn)參數(shù)，確定最合適的抗體耦聯(lián)量、重懸條件。

靈敏度檢測(cè)。將西布曲明標(biāo)準(zhǔn)品溶液用Running buffer緩沖液稀釋到不同質(zhì)量濃度，使西布曲明濃度分別為0、5、10、20、30、40、50、100 ng/mL，分別滴加到試紙條上進(jìn)行測(cè)試，反應(yīng) 10 min后觀察試紙條顯線(xiàn)結(jié)果。

實(shí)際樣品檢測(cè)。向某市售減肥類(lèi)保健食品中添加西布曲明標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使樣品中西布曲明濃度分別為0、5、10、20、30、40、50、100 ng/mL，分別滴加到試紙條上進(jìn)行測(cè)試，反應(yīng)10 min后觀察試紙條顯線(xiàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

西布曲明是小分子物質(zhì)，因此基于競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)原理，利用目標(biāo)物質(zhì)與包被原對(duì)抗體的競(jìng)爭(zhēng)達(dá)到半定量檢測(cè)的目的，其具體的檢測(cè)原理如圖1所示。樣本中的西布曲明標(biāo)準(zhǔn)品和T線(xiàn)上的西布曲明包被原均能與西布曲明抗體特異性結(jié)合并且結(jié)合的位點(diǎn)相同，即二者互相競(jìng)爭(zhēng)西布曲明抗體，但西布曲明標(biāo)準(zhǔn)品比包被原的競(jìng)爭(zhēng)能力更強(qiáng)。當(dāng)待測(cè)樣本中不存在西布曲明時(shí)，樣本流動(dòng)到金標(biāo)墊位置時(shí)西布曲明抗體與金納米粒子的耦聯(lián)復(fù)合物未能與西布曲明結(jié)合，因此西布曲明抗體表面的識(shí)別位點(diǎn)沒(méi)有被占據(jù)，西布曲明抗體與金納米粒子的耦聯(lián)復(fù)合物到達(dá)T線(xiàn)位置時(shí)，與西布曲明包被原結(jié)合，使T線(xiàn)顯現(xiàn)紅色，多余未結(jié)合的耦聯(lián)復(fù)合物繼續(xù)流動(dòng)到達(dá)C線(xiàn)位置，羊抗鼠二抗識(shí)別西布曲明抗體，二者結(jié)合使C線(xiàn)顯現(xiàn)紅色，最終NC膜上C線(xiàn)和T線(xiàn)位置均顯線(xiàn)。當(dāng)待測(cè)樣本中存在西布曲明時(shí)，樣本流動(dòng)到金標(biāo)墊位置時(shí)西布曲明抗體會(huì)與待測(cè)樣本中的西布曲明特異性結(jié)合，西布曲明抗體表面的識(shí)別位點(diǎn)被占據(jù)，因此西布曲明抗體與金納米粒子的耦聯(lián)復(fù)合物到達(dá)T線(xiàn)位置時(shí)，無(wú)法與西布曲明包被原結(jié)合或減少結(jié)合，從而T線(xiàn)顏色削弱或者消失，多余未結(jié)合的耦聯(lián)復(fù)合物繼續(xù)向前流動(dòng)到達(dá)C線(xiàn)位置，羊抗鼠二抗識(shí)別西布曲明抗體，二者結(jié)合使C線(xiàn)顯現(xiàn)紅色，最終T線(xiàn)位置顏色較淺或消失，C線(xiàn)正常顯現(xiàn)紅色。

圖1 西布曲明檢測(cè)原理Fig.1 Sibutramine detection principle

金納米粒子與西布曲明抗體耦聯(lián)復(fù)合物對(duì)試紙條的靈敏度有極顯著的影響，耦聯(lián)的西布曲明抗體量越大，試紙條靈敏度越低；耦聯(lián)的西布曲明抗體量較小時(shí)，靈敏度提高，但也會(huì)影響試紙條C線(xiàn)和T線(xiàn)整體的顯線(xiàn)強(qiáng)度。圖2是與膠體金耦聯(lián)的西布曲明抗體量的優(yōu)化結(jié)果，該試驗(yàn)在500 μL體系中分別選擇0.5、1.0、1.5、2.0 μL的1 mg/mL西布曲明抗體量進(jìn)行標(biāo)記耦聯(lián)，對(duì)制備的4組試紙使用不同濃度的西布曲明進(jìn)行測(cè)試，4組測(cè)試所用西布曲明濃度梯度均為0、5、50、100 ng/mL。可見(jiàn)，抗體體積加入的越大，T線(xiàn)顯線(xiàn)越強(qiáng)，C線(xiàn)變化不明顯，當(dāng)加入0.5和1.0 μL抗體時(shí)，NC膜上T線(xiàn)幾乎看不到，C線(xiàn)也較淺，無(wú)法很好地辨別陽(yáng)性和陰性結(jié)果；當(dāng)加入1.5 μL抗體時(shí)，靈敏度達(dá)到要求，但陰性T線(xiàn)強(qiáng)度仍然較淺；當(dāng)加入2.0 μL抗體時(shí)，陰性T線(xiàn)強(qiáng)度適中，可以很好地區(qū)分陰性和陽(yáng)性。因此最終選擇與膠體金耦聯(lián)的西布曲明抗體量為2.0 μL。

金納米粒子與西布曲明抗體耦聯(lián)結(jié)束后經(jīng)過(guò)離心去上清，余下的沉淀即二者的耦聯(lián)復(fù)合物，需要重新加入重懸液進(jìn)行復(fù)溶，以保證復(fù)溶后耦聯(lián)復(fù)合物的穩(wěn)定性以及耦聯(lián)復(fù)合物中抗體的活性。因此選擇合適的重懸液對(duì)試紙條結(jié)果的穩(wěn)定性極其重要。圖3是耦聯(lián)后使用重懸液的優(yōu)化結(jié)果，該試驗(yàn)分別選擇50 μL 10% BSA溶液、10% HSA溶液、0.5% Casein溶液和0.5% Na-Casein溶液重懸，對(duì)制備的4組試紙使用不同濃度的西布曲明進(jìn)行測(cè)試，4組測(cè)試所用西布曲明濃度梯度均為0、5、50、100 ng/mL?？梢?jiàn)，10% HSA溶液、0.5% Casein溶液和0.5% Na-Casein作為重懸液時(shí)，金標(biāo)墊釋放不完全，導(dǎo)致T線(xiàn)捕獲到的膠體金耦聯(lián)復(fù)合物較少，故顯線(xiàn)不強(qiáng)；10% BSA溶液作為重懸液時(shí)，金標(biāo)墊釋放良好，T線(xiàn)顯強(qiáng)線(xiàn)度適中，靈敏度達(dá)到要求。因此最終選擇10% BSA溶液作為重懸液。

圖2 標(biāo)記抗體量的優(yōu)化Fig.2 Optimization of the volumes of the antibody

膠體金試紙條檢測(cè)西布曲明時(shí)，可以通過(guò)裸眼觀察試紙條的顯線(xiàn)情況實(shí)現(xiàn)西布曲明的半定量檢測(cè)。用相機(jī)將檢測(cè)后的試紙條結(jié)果拍攝下來(lái)，再用軟件掃描圖片，實(shí)現(xiàn)西布曲明的定量檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。

圖3 重懸液的優(yōu)化Fig.3 Optimization of the types of resuspension solution

圖4 西布曲明試紙條濃度梯度檢測(cè)結(jié)果(a)和靈敏度檢測(cè)灰度分析結(jié)果(b)以及西布曲明檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(c)Fig.4 Concentration gradient detection results (a),grayscale analysis results of sensitivity detection (b) of sibutramine test strips,and sibutramine detection standard curve (c)

從西布曲明試紙條檢測(cè)肉眼觀察結(jié)果(圖4a)可以看出,隨著西布曲明濃度逐漸增大，試紙條的T線(xiàn)顏色逐漸變?nèi)?，西布曲明濃度?0 ng/mL時(shí)完全消線(xiàn)。利用Image J軟件對(duì)試紙條測(cè)試結(jié)果圖中C線(xiàn)與T線(xiàn)顯色強(qiáng)度的灰度值分析結(jié)果(圖4b)可以看出C線(xiàn)的峰值穩(wěn)定，T線(xiàn)的峰值與西布曲明濃度呈反比，隨著西布曲明濃度提高而降低，直到50 ng/mL 時(shí)完全平緩。從T線(xiàn)灰度峰面積與西布曲明濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖4c)可以看出,西布曲明濃度在5～50 ng/mL與T線(xiàn)強(qiáng)度之間具有良好的線(xiàn)性關(guān)系(=0967 43)。

考慮到實(shí)際樣品中蛋白、多肽等基質(zhì)會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，先將粉末狀樣品用甲醇溶解提取，然后離心機(jī)6 300 r/min進(jìn)行7 min離心處理，添加西布曲明標(biāo)準(zhǔn)品使樣品中西布曲明濃度分別為0、5、10、20、30、40、50、100 ng/mL，分別滴加到試紙條上進(jìn)行測(cè)試，反應(yīng)10 min后試紙條顯線(xiàn)結(jié)果如圖5a所示，相應(yīng)的圖像中C、T灰度值分析結(jié)果如圖5b所示；此外，根據(jù)T線(xiàn)強(qiáng)度灰度分析結(jié)果與對(duì)應(yīng)西布曲明濃度建立了線(xiàn)性關(guān)系，相應(yīng)關(guān)系如圖5c所示。

隨著西布曲明質(zhì)量濃度的增大，檢測(cè)線(xiàn)的顯線(xiàn)強(qiáng)度不斷減弱，直至50 ng/mL時(shí)檢測(cè)線(xiàn)完全消線(xiàn)(圖5a)，質(zhì)控線(xiàn)顯色均勻，與靈敏度檢測(cè)結(jié)果一致。根據(jù)顯色結(jié)果作出灰度掃描圖，可以看出T線(xiàn)信號(hào)強(qiáng)度峰值隨著西布曲明濃度的增加而不斷降低，直至平緩(圖5b)，根據(jù)T線(xiàn)灰度值與實(shí)際樣本中西布曲明濃度之間建立線(xiàn)性關(guān)系(圖5c)可以看出，西布曲明濃度在5～50 ng/mL具有良好的線(xiàn)性關(guān)系(=0.973 84)，表明該試紙條可應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

3 結(jié)論與討論

膠體金免疫側(cè)向?qū)游龇ㄊ且环N以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)，是現(xiàn)場(chǎng)篩查的有力工具，因其簡(jiǎn)單、便攜、長(zhǎng)期穩(wěn)定性和成本低而在實(shí)際應(yīng)用中越來(lái)越受到關(guān)注。該試驗(yàn)構(gòu)建了國(guó)產(chǎn)蛋白標(biāo)記的試紙條快速檢測(cè)減肥類(lèi)保健食品中違禁添加的西布曲明，樣品無(wú)需任何復(fù)雜的前處理，10 min內(nèi)即可獲得檢測(cè)結(jié)果。與已報(bào)道的代表

圖5 西布曲明實(shí)際樣本試紙條檢測(cè)結(jié)果(a)和試紙條灰度分析結(jié)果(b)以及西布曲明實(shí)際樣品檢測(cè)線(xiàn)性關(guān)系(c)Fig.5 Test results of test strips (a) and grayscale analysis results of test strips (b) of sibutramine actual samples,and the sibutramine actual sample detection linear relationship (c)

性方法相比，LFS法操作簡(jiǎn)單、易于制備，通過(guò)直觀觀察，實(shí)現(xiàn)了低至50 ng/mL的可視化檢測(cè)限，制備的試紙條特異性良好、靈敏性高，可用于實(shí)際樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，為市場(chǎng)監(jiān)管過(guò)程中大批量樣本檢測(cè)需求提供便利。