余佳珍，鄭小玲，王征南，李 玨

（浙江食品藥品檢驗研究院，藥品微生物檢測與預(yù)警重點實驗室，浙江杭州 310052）

培養(yǎng)基富含微生物生長繁殖所需的各類營養(yǎng)物質(zhì)，是微生物試驗的基礎(chǔ)，不恰當?shù)闹苽浞椒?、滅菌程序、貯藏條件等都會影響培養(yǎng)基質(zhì)量，直接影響微生物試驗結(jié)果。因此，適宜的培養(yǎng)基制備方法、合理的儲存條件，以及質(zhì)量控制實驗是提供優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基的保證[1]?！秾嶒炇屹|(zhì)量控制規(guī)范 食品微生物檢測》（GB/T 27405—2008）有明確規(guī)定，自配培養(yǎng)基應(yīng)在已驗證的條件下儲存[2-3]。當前，食品微生物快速檢驗方法發(fā)展如火如荼，但利用培養(yǎng)基對微生物計數(shù)、增菌、分離、鑒定仍是現(xiàn)行法規(guī)標準規(guī)定的主流方法。

脈動真空滅菌器是一種新型的飽和蒸汽滅菌器，由滅菌室腔體、夾套、腔門及密封圈、蒸汽發(fā)生器、管路系統(tǒng)、電氣系統(tǒng)和控制系統(tǒng)組成。該儀器采用飽和水蒸氣作為滅菌介質(zhì)，經(jīng)過反復(fù)抽真空和注入蒸汽[4]，待滅菌腔體達到一定的真空度后，再導(dǎo)入飽和蒸汽，使蒸汽在腔體內(nèi)迅速擴散，并滲透到被滅菌物品的深部，從而達到有效的滅菌效果。相比傳統(tǒng)的高壓飽和蒸汽滅菌器具有蒸汽穿透力強、滅菌效果可靠、滅菌時間短等優(yōu)點[5]。本實驗室購買的ER-2脈動真空滅菌器具有雙扉結(jié)構(gòu)，滅菌完成后，被滅菌物品能通過另一扇門無菌轉(zhuǎn)運到潔凈區(qū)域內(nèi)，常被用于潔凈服、密閉容器、裝有液體培養(yǎng)基的密閉容器或其他液體的滅菌。

適宜的培養(yǎng)基制備方法、貯藏條件和質(zhì)量控制試驗是提供優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基的保證[6]，為適應(yīng)食品微生物檢驗形勢的發(fā)展，提高檢驗效率，確保檢驗質(zhì)量，本研究選取7.5%氯化鈉肉湯、緩沖蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（Lauryl Sulfate Tryptose Broth，LST）這3種食品微生物檢驗常用液體培養(yǎng)基，采用脈動真空滅菌器進行滅菌處理，在儲存期內(nèi)第0 d、第7 d、第14 d、第21 d、第28 d和第35 d共6個時間點對培養(yǎng)基的pH值、無菌性、質(zhì)控指標進行考察，規(guī)范培養(yǎng)基的配制、滅菌和儲存過程，確保實驗室配制的培養(yǎng)基可滿足食品微生物檢驗的要求，旨在為實驗室日常檢驗提供可靠有效的培養(yǎng)基儲存方案，助力食品微生物檢驗高質(zhì)量發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

商品化脫水合成培養(yǎng)基：7.5 %氯化鈉肉湯（20171020）、緩沖蛋白胨水（BPW）（20171031）、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）（20190121），均購于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（1065575），購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

ER-2脈動真空滅菌器（瑞士Getinge）；ME2002E電子天平、S400-B酸度計（瑞士Mettler Toledo）；MLS-3780高 壓 蒸 汽 滅 菌 器（ 日 本Sanyo）；SF450滅菌箱、IF450恒溫培養(yǎng)箱、ICP55低溫培養(yǎng)箱（德國Memmert）；生物安全柜（中國力康）；HYC-1378冰箱（中國海爾）。

1.3 菌種

大腸埃希菌（ATCC 25922）、弗氏檸檬酸桿菌（ATCC 43864）、糞腸球菌（ATCC 29212）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14208）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538），均購于美國菌種保藏中心。

1.4 試驗方法

考察指標包括pH值、無菌性檢查、質(zhì)量控制等指標。

1.4.1 制備菌液

按《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB 4789.28—2013），將標準儲備菌株接種到10 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)24 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液制備10倍系列稀釋的菌懸液。

1.4.2 培養(yǎng)基制備和滅菌

根據(jù)GB 4789系列相關(guān)現(xiàn)行標準要求，結(jié)合培養(yǎng)基使用說明進行制備，使用脈動真空滅菌器121 ℃滅菌15 min，10 mL試管裝月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯采用飽和蒸汽滅菌器121 ℃滅菌15 min。具體內(nèi)容見表1。

表1 食品常用培養(yǎng)基制備、包裝和滅菌方案

1.4.3 儲存期驗證

將滅菌完成的培養(yǎng)基置于2～8 ℃冰箱避光保存，分別于儲存期的第0 d、第7 d、第14 d、第21 d、第28 d、第35 d共6個時間節(jié)點對培養(yǎng)基的pH值、無菌性、質(zhì)控指標進行實驗驗證。

（1）pH值測定。上述各培養(yǎng)基隨機取不少于2份，待恢復(fù)至室溫（25 ℃）進行pH測定。同一個樣品至少進行兩次測定，兩次測定的結(jié)果之差應(yīng)不超過0.1 pH單位，取兩次測定的算數(shù)平均值作為結(jié)果，pH值測定結(jié)果在培養(yǎng)基說明書規(guī)定范圍內(nèi)為合格。7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基配制說明書中規(guī)定的pH范圍為7.3～7.5，緩沖蛋白胨水規(guī)定的pH范圍為7.0～7.4，月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯規(guī)定的pH范圍為6.6～7.0。

（2）無菌性檢查。上述各培養(yǎng)基隨機取不少于5份，置各培養(yǎng)基對應(yīng)標準規(guī)定的溫度培養(yǎng)14 d，結(jié)果應(yīng)為無菌生長，即濁度值應(yīng)為0（不生長）。7.5%氯化鈉肉湯、緩沖蛋白胨水和月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯標準規(guī)定的培養(yǎng)溫度均為（36 ℃±1） ℃。

（3）培養(yǎng)基質(zhì)控指標試驗。質(zhì)控指標試驗的方法及判定依據(jù)為《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB 4789.28—2013）中附錄E《實驗室使用商品化培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量控制標準》。

緩沖蛋白胨水（表E.3《非選擇性增菌培養(yǎng)基質(zhì)量控制標準》）：取每罐裝量為225 mL的緩沖蛋白胨水2罐，接種不大于100 CFU的鼠傷寒沙門氏菌菌懸液，36 ℃培養(yǎng)不超過18 h，目標菌的濁度值應(yīng)為2（嚴重混濁）。

7.5%氯化鈉肉湯（表E.4《選擇性增菌培養(yǎng)基質(zhì)量控制標準》）：取每罐裝量為225 mL的7.5 %氯化鈉肉湯4罐，分別用1 μL接種環(huán)接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌工作用懸液（105～107CFU·mL-1）各兩罐，36 ℃培養(yǎng)不超過18 h。接入金黃色葡萄球菌的濁度值應(yīng)為2，接入大腸埃希菌的濁度值應(yīng)為0（不生長）。

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（表E.5《選擇性液體計數(shù)培養(yǎng)基質(zhì)量控制標準》）：取每管裝量為10 mL的月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯6管，分別用1 μL接種環(huán)接種大腸埃希菌、弗氏檸檬酸桿菌、糞腸球菌工作用懸液（105～ 107CFU·mL-1）各 2管，36 ℃培養(yǎng)24 h。接入大腸埃希菌和弗氏檸檬酸桿菌的濁度值應(yīng)為2，且管內(nèi)有氣體，接入糞腸球菌的濁度值應(yīng)為0（不生長）。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌性檢查試驗結(jié)果

無菌性檢查試驗表明，在35 d內(nèi)6個時間點對上述培養(yǎng)基進行無菌性檢查試驗，培養(yǎng)基在對應(yīng)標準規(guī)定的溫度下培養(yǎng)14 d，結(jié)果均為陰性（濁度值為0，不生長）。見表2。

表2 不同儲存時間點各培養(yǎng)基的無菌性試驗結(jié)果

2.2 pH值測定結(jié)果

pH值測定結(jié)果表明，在35 d內(nèi)6個時間點對上述培養(yǎng)基進行pH值測定，各個培養(yǎng)基的測定結(jié)果均在說明書規(guī)定的pH范圍內(nèi)。見表3。

表3 不同儲存時間點各培養(yǎng)基的pH值測定結(jié)果

2.3 培養(yǎng)基適質(zhì)控指標試驗結(jié)果

培養(yǎng)基適質(zhì)控指標試驗結(jié)果表明，在35 d內(nèi)6個時間點對上述培養(yǎng)基質(zhì)控指標試驗，3種培養(yǎng)基的質(zhì)控指標試驗均符合規(guī)定。見表4。

表4 不同儲存時間點各培養(yǎng)基質(zhì)控指標結(jié)果

3 結(jié)果與分析

3.1 商品化脫水合成培養(yǎng)基的質(zhì)量管理

新采購的商品化脫水合成培養(yǎng)基應(yīng)由培養(yǎng)基管理員或其他專業(yè)人員對其進行驗收和質(zhì)量控制實驗，檢驗合格后，將培養(yǎng)基進行入庫管理[7]。開封后的商品化脫水合成培養(yǎng)基要密封保存，并記錄首次開封日期。每次使用前要對內(nèi)容物進行感官檢查，若發(fā)現(xiàn)粉末受潮或物理性狀發(fā)生改變，則不應(yīng)再使用。配制培養(yǎng)基時，要小心稱量，尤其是具有選擇性的培養(yǎng)基常含有有毒物質(zhì)（如膽鹽或其他選擇劑），必要時佩戴口罩或在通風(fēng)柜操作，防止吸入有害物質(zhì)[3]。生產(chǎn)廠家不同，產(chǎn)品批號不同，培養(yǎng)基的質(zhì)量也會有所不同，培養(yǎng)基的質(zhì)量控制要做到批檢驗。

3.2 培養(yǎng)基的制備、滅菌和儲存

培養(yǎng)基制備分裝完成后，應(yīng)在其包裝容器外表面標明培養(yǎng)基的名稱和配制日期，防止使用時混拿混放或未在儲存期限內(nèi)使用。培養(yǎng)基滅菌后要確保密閉保存。①防止水分流失。水分流失會改變培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)成分的比例、pH和其外觀性狀，影響培養(yǎng)基的使用效果。②避免空氣中微生物進入引起培養(yǎng)基變質(zhì)。變質(zhì)會很大程度改變培養(yǎng)基的有效成分，并破壞培養(yǎng)基的無菌性，變質(zhì)的培養(yǎng)基不得使用[8]。應(yīng)對儲存培養(yǎng)基的醫(yī)用冷藏箱進行溫濕度監(jiān)控和記錄，當溫濕度超過上下限值時，能及時采取控制措施。在儲存有效期內(nèi)的培養(yǎng)基，使用前要先將培養(yǎng)基取出平衡至室溫，并對其進行感官檢查，如發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基變渾濁或性狀發(fā)生變化，應(yīng)停止使用，并按實驗室相關(guān)規(guī)程處置，不得隨意丟棄。

3.3 脈動真空滅菌器操作要點

滅菌設(shè)備及滅菌參數(shù)對培養(yǎng)基有較大影響，對于新安裝的脈動真空滅菌器，應(yīng)對其進行安裝、運行、性能確認，并定期進行檢定及驗證。滅菌參數(shù)要嚴格按照各培養(yǎng)基的使用說明進行設(shè)定[7]。滅菌前，取一瓶培養(yǎng)基放置在滅菌腔體的“最冷點”，將負載溫度探頭放在被滅菌培養(yǎng)基液面的幾何中心點位置，并固定完好。溫度探頭測得的溫度值要反映被滅菌培養(yǎng)基最深部位的溫度，探頭測得的溫度達到設(shè)定的滅菌溫度時，開始進入滅菌階段，待滅菌液體培養(yǎng)基按該裝量及包裝形式的液體培養(yǎng)基經(jīng)過驗證的裝載方式進行裝載。滅菌時，培養(yǎng)基的裝載量不能超過已驗證的最大裝載量，裝載過密會影響滅菌效果[9]。

3.4 小裝量液體培養(yǎng)基滅菌要點

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯在使用脈動真空滅菌器進行滅菌時，滅菌后培養(yǎng)基的顏色存在異常，進行第0 d質(zhì)控指標試驗時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的選擇性效果不明顯。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯的包裝容器是玻璃試管，且裝量少只有10 mL，使得滅菌時溫度探頭難以固定放置，測量溫度不準確，導(dǎo)致實際的滅菌時間和設(shè)定的滅菌時間不符，造成培養(yǎng)基滅菌不徹底或過度滅菌，影響培養(yǎng)基質(zhì)量，所以最終選擇傳統(tǒng)高壓蒸汽滅菌器進行滅菌。保證培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分不被破壞，避免培養(yǎng)基中其他物質(zhì)因高溫發(fā)生反應(yīng)而影響其質(zhì)量[10]。

綜上所述，7.5%氯化鈉肉湯、緩沖蛋白胨水（BPW）、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）這3種食品常用培養(yǎng)基根據(jù)其使用說明及GB 4789系列法規(guī)標準要求制備，使用脈動真空滅菌器121 ℃滅菌15 min（10 mL試管裝月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯采用飽和蒸汽滅菌器121 ℃滅菌15 min），2～8 ℃避光密閉儲存，將儲存期限限定在35 d內(nèi)，培養(yǎng)基的pH值、無菌性及指質(zhì)控指標均符合規(guī)定，可以確保培養(yǎng)基質(zhì)量。