張魏，單莉，朱夢(mèng)情，劉曉闖，高家榮

·論著·

基于UPLC-Q-TOF-MSE與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究黃地安消膠囊干預(yù)2型糖尿病的主要物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制

張魏，單莉，朱夢(mèng)情，劉曉闖，高家榮

230031 合肥，安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部（張魏、單莉、朱夢(mèng)情、劉曉闖、高家榮）；230012 合肥，安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（張魏），中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（高家榮）

運(yùn)用 UPLC-Q-TOF-MSE結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索黃地安消膠囊治療 2 型糖尿病（T2DM）的主要物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。采用 UPLC-Q-TOF-MSE對(duì) 2 型糖尿病模型大鼠灌胃黃地安消膠囊后的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，確定藥物的入血成分，并通過 Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫檢索作用靶點(diǎn)，在 GeneCards 數(shù)據(jù)庫和 DrugBank 數(shù)據(jù)庫中檢索 T2DM 相關(guān)作用靶點(diǎn)。所得成分疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行 GO 功能和 KEGG 通路富集分析并進(jìn)行可視化分析。黃地安消膠囊 28 個(gè)入血原型成分作用于 495 個(gè)靶點(diǎn)，與782 個(gè) T2DM 相關(guān)靶點(diǎn)交集獲得黃地安消膠囊治療T2DM 的潛在作用靶點(diǎn)基因 141 個(gè)；PPI 進(jìn)一步篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn) VEGFA、AKT1、SRC、EGFR 等。GO 富集分析中生物學(xué)過程條目 5050 個(gè)，細(xì)胞組分條目 431 個(gè)，分子功能條目 802 個(gè)；KEGG 富集分析獲得與關(guān)鍵靶點(diǎn)相關(guān)通路 19 條。RT-qPCR 和 Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃地安消膠囊含藥血清可調(diào)控 HUVECs 中 VEGFA、AKT1、SRC、EGFR 的表達(dá)。黃地安消膠囊 28 個(gè)入血成分中木蘭花堿、高良姜素、槲皮素等可能通過作用于 VEGFA、AKT1、SRC、EGFR 調(diào)控 AGE-RAGE 糖尿病并發(fā)癥和 AMPK 等信號(hào)通路，從而發(fā)揮治療作用。

黃地安消膠囊； 2 型糖尿?。?UPLC-Q-TOF-MSE； 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)； 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種由于胰島 β 細(xì)胞分泌胰島素減少和胰島素抵抗導(dǎo)致胰島素缺乏而引起的伴有多種并發(fā)癥的代謝紊亂性疾病[1-2]。據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會(huì)估計(jì)，2019 年全球糖尿病的總患病人數(shù)約 4.63 億，其中 T2DM 患者約占糖尿病患者總?cè)藬?shù)的九成[3]。中醫(yī)藥多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的治療特點(diǎn)在 T2DM 及其并發(fā)癥的治療方面具有安全有效、副作用少的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

黃地安消膠囊臨床應(yīng)用多年，療效確切。課題組前期研究黃地安消膠囊可通過降低糖尿病認(rèn)知功能障礙（DCD）大鼠的血糖，改善 DCD 大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷和 Aβ 沉積[4]；在二甲雙胍基礎(chǔ)上配合黃地安消膠囊治療后，明顯改善患者胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）、空腹血糖（FBG）水平，改善胰島素抵抗[5]；此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，黃地安消膠囊單獨(dú)用藥時(shí)，降低 FBG、隨機(jī)血糖（RBG）、胰島素受體底物-1（IRS-1）水平，GK 大鼠胰島功能得到明顯改善，從而治療 T2DM[6-7]，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和可能的作用機(jī)制并不明確。因此本研究采用 UPLC-Q-TOF-MSE技術(shù)對(duì)口服給藥各模型大鼠的入血成分進(jìn)行分析鑒定，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)各成分對(duì)應(yīng)的疾病靶點(diǎn)，通過構(gòu)建成分-疾病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析黃地安消膠囊治療T2DM 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 PTC-200 型 PCR 儀購自美國國Bio-Rad 公司；LX300 型低速迷你離心機(jī)購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；S-1-150S 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購自鄭州宏華儀器有限公司；微量移液器購自德國 Eppendorf 公司；StepOnePlus 熒光定量 PCR 儀購自美國 ABI 公司；MINI-P25 微孔板迷你離心機(jī)購自杭州奧盛儀器有限公司；OD1000+ 超微量分光光度計(jì)購自南京五義科技有限公司；JW-3021HR 高速冷凍離心機(jī)購自安徽嘉文儀器裝備有限公司；DHG-9070 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海散發(fā)科學(xué)儀器有限公司；JJ-79-1 磁力加熱攪拌器購自常州市人和儀器廠；JS-M6P 自動(dòng)曝光儀購自上海培清科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Trizol 購自美國 ThermoFisher 公司；氯仿購自上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇購自上海廣諾化學(xué)科技有限公司；異丙醇購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；引物均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；RIPA 裂解液、PMSF 均購自合肥蘭杰柯公司；SDS、Glycine、PAGE 膠促凝劑、Tris、吐溫-20、甲叉雙丙烯酰胺均購自北京索萊寶科技有限公司；ECL 超敏發(fā)光試劑盒購自美國 Thermo 公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性 GK 大鼠，體質(zhì)量（310.8 ± 11.3）g，62 日齡，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。在室溫 20 ～ 25 ℃，相對(duì)濕度 40% ～ 60%，12 h 光暗交替環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 黃地安消膠囊含藥血清的制備 將 GK 大鼠飼養(yǎng)至 5 月齡，以血糖> 11.1 mmol/L 作為 T2DM 模型造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[8-9]，隨機(jī)分為對(duì)照組（n = 5）和給藥組（n = 5）。給藥組每次以 15 g/kg的劑量進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃 3 d，每天兩次；對(duì)照組灌胃相應(yīng)體積蒸餾水。末次給藥 4 h 后胸主動(dòng)脈采血，室溫靜置，10 000 r/min離心 5 min，取上清液，即得黃地安消膠囊含藥血清（HDAXC）。

1.2.2 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析 課題組前期質(zhì)譜鑒定出的 28 個(gè)黃地安消膠囊入血原型成分，在 chem 2014 軟件中轉(zhuǎn)換成簡(jiǎn)化分子線性輸入規(guī)范（simplified molecular input line entry specification，SMILES）輸入 Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行成分作用靶點(diǎn)的檢索。在 GeneCards（http://www.genecards. org/）數(shù)據(jù)庫和 DrugBank（https://go.drugbank. com/drugs）數(shù)據(jù)庫輸入關(guān)鍵詞“Type 2 Diabetes Mellitus”檢索T2DM 相關(guān)靶點(diǎn)。將入血成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與 T2DM 相關(guān)靶點(diǎn)取交集，所得交集靶點(diǎn)即為黃地安消膠囊作用于 T2DM 的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2 軟件，對(duì)“入血成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯Y選黃地安消膠囊作用于T2DM 的關(guān)鍵化合物。

1.2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 將得到的藥物成分-疾病共同靶點(diǎn)上傳至 STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，下載 PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2 軟件對(duì) PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，選取度值（degree）、介數(shù)（betweenness centrality，BC）和中心性（closeness centrality，CC）排名前十的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2.4 GO 功能富集分析和 KEGG 通路注釋 將黃地安消膠囊入血原型成分治療 T2DM相關(guān)的 141 個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入 Metascape（http://metascape. org），用于基因本體富集（GO）和京都基因和基因組路徑分析（KEGG）。以基因組中的所有基因作為富集背景，對(duì)所有項(xiàng)目進(jìn)行篩選（< 0.01）[10]，通過 Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行可視化分析。

1.2.5 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù) KEGG 通路富集結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)檢索，篩選出與 T2DM 相關(guān)的信號(hào)通路，找出通路中的黃地安消膠囊治療 T2DM 的相關(guān)靶點(diǎn)，結(jié)合黃地安消膠囊相關(guān)信息，構(gòu)建黃地安消膠囊“組方藥材-原型成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng) 將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）接種在六孔培養(yǎng)板上，加入 25 mmol/L葡萄糖的溶液。正常組加入 5 mmol/L 葡萄糖和20 mmol/L 甘露醇，模型組加入 25 mmol/L 葡萄糖和 5 ng/ml TNF-α 后，孵育 48 h。另取模型組孵育 24 h 后給藥，加入 20% 的含藥血清，培養(yǎng)24 h[11-13]。收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 RT-qPCR 分析 使用 Trizol 試劑從 HUVECs 提取總 RNA，RT-qPCR檢測(cè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、血管內(nèi)皮生長因子 A（VEGFA）、酪氨酸激酶（SRC）、表皮生長因子受體（EGFR）mRNA 水平。采用 2?ΔΔCT對(duì)各目的基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行量化和歸一化。

1.2.8 Western blot 分析 每組各取相同質(zhì)量的 HUVEC 細(xì)胞樣本，用 RIPA 裂解緩沖液裂解 HUVECs 總蛋白，在12 000 r/min 下離心 10 min，獲得上清液，用 ECL 發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè) AKT1、VEGFA、SRC、EGFR 蛋白表達(dá)。各條帶灰度值利用 Image J 圖像分析軟件進(jìn)行分析，以 β-actin 進(jìn)行校正。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，以隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的單因素方差分析（ANOVA）分析多組間差異，當(dāng)< 0.05 時(shí)，其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃地安消膠囊血中移行成分分析

課題組前期應(yīng)用 UPLC-Q-TOF-MSE技術(shù)從黃地安消膠囊中得到 100 個(gè)化學(xué)成分[14]。此次在含藥血清樣品中檢測(cè)到 53 個(gè)成分，對(duì)比分析后發(fā)現(xiàn) 28 個(gè)原型成分，主要為黃酮類、生物堿類及皂苷類（表 1）。

表 1 黃地安消膠囊 28 個(gè)入血原型成分UPLC-Q-TOF-MSE分析

續(xù)表 1

序號(hào)No.保留時(shí)間Rt (min)鑒別化合物Identified compounds正離子模式Positive ion (m/z) 負(fù)離子模式Negative ion (m/z)分子式Formula實(shí)際分子質(zhì)量Mv (Da)碎片離子MS/MS (m/z)來源Source 分子質(zhì)量Molecularmass誤差ppm 分子質(zhì)量Molecularmass誤差ppm 1912.66大豆異黃酮Daidzein*255.0648-1.5 253.0495-4.6C15H10O4254.0567255, 237, 137, 119,253, 135, 117GG5 2012.88黃藤素Palmatine*352.15654.5 --C21H22NO4+352.1565352, 336, 308, 292,264HL7 2112.953'-甲氧基大豆黃素3'-Methoxydaidzein285.07611.3 283.0612-0.1C16H12O5284.0699285, 271, 255, 137,283, 268, 253GG8 2213.02小檗堿Berberine*336.12668.9 --C20H18NO4+336.1266336, 320, 306, 292,278HL8 2313.25槲皮素Quercetin*-- 301.03663.9C15H10O7302.0438301,151SQ1 2414.14高良姜素Galangin271.0597-1.5 269.04510.3C15H10O5270.0524271, 163, 153, 119,269, 161PPY1 2514.27人參皂苷Rb1Ginsenoside Rb1*1109.61120.8 1153.5996-1.3C54H92O231108.60141109, 947, 785, 623,1153, 1107, 945,783, 621, 553, 459SQ4 2614.27人參皂苷Rk1Ginsenoside Rk1767.4934-0.8 --C42H70O12766.4861767, 605, 443, 425,407, 343, 325SQ5 2716.15三七皂苷KNotoginsenoside K-- 991.54890.6C48H82O18946.5501991, 783, 621, 603,537SQ6 2816.15羽扇烯酮Lupenone425.3766-2.8 --C30H48O424.3693425, 409+GG10

注：*：與對(duì)照品比對(duì)得到鑒定的成分；-：未檢測(cè)到；SDH：生地黃；HL：黃連；GG：葛根；PPY：枇杷葉；MD：麥冬；SQ：三七。

Notes:*: Indicates the components confirmed by comparison with the reference standards; -: Indicates no detection; SDH: Rehmanniae radix; HL: Coptis rhizoma; GG: Pueraria lobate radix; PPY: Eriobotryae folium; MD: Ophiopogonis radix; SQ: Notoginseng radix et rhizoma.

2.2 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

28 個(gè)原型成分在 Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫中檢索到 1422 個(gè)靶點(diǎn)，去除重復(fù)項(xiàng)后得到 495 個(gè)靶點(diǎn)。在 GeneCards 數(shù)據(jù)庫和 DrugBack數(shù)據(jù)庫中檢索獲得 T2DM 相關(guān)靶點(diǎn)782 個(gè)。將以上靶點(diǎn)通過作韋恩圖取交集，得到 141 個(gè)交集靶點(diǎn)（圖 1A）。將 28 個(gè)原型成分和 141 個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入到 cytocsape3.7.2 軟件中，構(gòu)建了一個(gè)包含 181 個(gè)節(jié)點(diǎn)、527 條邊的“成分-靶點(diǎn)”交互網(wǎng)絡(luò)（圖 1B）對(duì)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行拓?fù)浞治觯?8 個(gè)成分按度值、平均中心介數(shù)和平均中心度數(shù)降序排列。其中排名前 3 的是厚樸花素、高良姜素和槲皮素。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將上述 141 個(gè)交集靶點(diǎn)上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫，用于 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析（圖 1C）。該網(wǎng)絡(luò)包括 141 個(gè)節(jié)點(diǎn)和 1533 條相互作用關(guān)系。通過 Degree、BC、CC 為篩選條件，排名前 10 位的靶點(diǎn)排列如圖 1D，相關(guān)信息見表 2。

2.4 GO 富集分析和 KEGG 通路富集分析

在 Metascape 數(shù)據(jù)庫中輸入 141 個(gè)交集基因，其中 5050 個(gè)為富集生物過程（BPs），802 個(gè)為富含分子功能（MFs），431 個(gè)為富含細(xì)胞成分（CCs）。前 20 個(gè)條目如圖 2A，涉及多種生物學(xué)過程，例如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫系統(tǒng)、基因表達(dá)等生物學(xué)過程。為了進(jìn)一步探索獲得的與 T2DM 相關(guān)的目標(biāo)，我們展示了前 10 個(gè)靶點(diǎn)和前 20 個(gè) GO 術(shù)語之間的關(guān)系（圖 2B）。例如，TNF、AKT1、SRC 和 EGFR 參與了細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)（GO：1901699），VEGFA、AKT1、SRC 和 MAPK3 參與了蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)節(jié)（GO：0001934）。KEGG 結(jié)果顯示關(guān)鍵基因主要富集在糖尿病并發(fā)癥中的 AGE-RAGE 信號(hào)通路和 AMPK 信號(hào)通路（圖 2C）。如圖 2D 所示，AKT1 參與 AMPK 信號(hào)通路（HSA04152），TNF、VEGFA、AKT1 和 EGFR 參與了 AGE-RAGE 合并糖尿病并發(fā)癥的信號(hào)通路（HSA04933）。

圖 1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選藥物疾病相關(guān)靶點(diǎn)（A：藥物-疾病靶點(diǎn)交集；B：“原型成分-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)；C：黃地安消膠囊和T2DM 之間的交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)；D：黃地安消膠囊治療T2DM 的前10 個(gè)核心靶點(diǎn)）

Figure 1 Screening of drug disease-related targets based on network pharmacology (A: Intersection of predicted targets of HDAXC and T2DM; B: “Prototype component-target” interaction network; C: Common target PPI network between HDAXC and T2DM; D: The top of 10 core target of HDAXC treatment of T2DM in PPI network)

表 2 黃地安消膠囊治療 T2DM 核心靶點(diǎn)的信息

2.5 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

黃地安消膠囊 6 味藥材、28 個(gè)入血原型成分和與排名前 10 的交集靶點(diǎn)構(gòu)建黃地安消膠囊“組方藥材-原型成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)（圖 3），可見，黃地安消膠囊治療 T2DM 的過程涉及多個(gè)活性成分、靶點(diǎn)和通路。

2.6 AKT1、VEGFA、SRC、EGFR在 HUVECs 中的表達(dá)

在 TNF-α 聯(lián)合高糖誘導(dǎo)的 HUVECs 中，檢測(cè)了 AKT1、VEGFA、SRC、EGFR 的表達(dá)。如圖 4和圖 5 所示，與對(duì)照組相比，模型組 AKT1、VEGFA、SRC 和 EGFR 的表達(dá)水平顯著升高，而 HDAXC 組的 AKT1、VEGFA、SRC 和 EGFR 的表達(dá)水平明顯低于模型組。

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，借助 UPLC-Q-TOF-MSE技術(shù)及相應(yīng)的數(shù)據(jù)軟件，對(duì)28個(gè)黃地安消膠囊入血原型成分建立“成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)入血成分中的木蘭花堿、高良姜素、槲皮素等化合物靶向T2DM 關(guān)鍵基因。PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 VEGFA、AKT1、SRC、EGFR 可能為黃地安消膠囊治療 T2DM 的關(guān)鍵基因。

RT-qPCR 和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在 TNF-α 和高糖誘導(dǎo)的 HUVECs 中AKT1、VEGFA、SRC、EGFR mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高，黃地安消膠囊可干預(yù) AKT1、VEGFA、SRC、EGFR 的表達(dá)。Viigimaa 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K 和 Akt 活性下降，導(dǎo)致 GLUT-4 表達(dá)和活性下降，使胰島素結(jié)合反應(yīng)和活性受損。另外，PI3K 和 Akt 活性的降低可使內(nèi)皮 NO合酶（eNOS）失活，進(jìn)而導(dǎo)致 NO 數(shù)量減少并進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，從而參與動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)展[16]。Mayurkumar 和Shrihari[17]通過建立糖尿病小鼠模型發(fā)現(xiàn)木蘭花堿可改善晶狀體醛糖還原酶引起的糖尿病及并發(fā)癥。木蘭花堿促進(jìn) Akt 磷酸化，降低 T2DM 大鼠的空腹血糖水平[18]。高良姜素通過抑制 PI3K/Akt 和 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，改善肝纖維化[19]。VEGFA 是糖尿病血管生成的關(guān)鍵物質(zhì)，誘導(dǎo)血管生成和增加血管通透性[20]。Zu 等[21]發(fā)現(xiàn)槲皮素通過 AKT1、VEGFA、EGFR 等基因調(diào)控 AGE-RAGE 糖尿病并發(fā)癥信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路，干預(yù) T2DM 的發(fā)展。槲皮素可通過抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移侵襲，降低 VEGFA 的表達(dá)，改善食管癌細(xì)胞遷移與血管生成[22]。另有研究通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)槲皮素逆轉(zhuǎn)癌前病變時(shí)，EGFR 的表達(dá)量顯著減少[23]。SRC在巨噬細(xì)胞天然免疫中發(fā)揮多種作用，巨噬細(xì)胞參與糖尿病等多種免疫反應(yīng)和炎癥性疾病[24]。同時(shí)，槲皮素可通過抗炎作用改善 T2DM 小鼠的肝臟損傷[25]。

KEGG 通路富集結(jié)果表明，黃地安消膠囊可能通過調(diào)節(jié) AGE-RAGE 合并糖尿病并發(fā)癥信號(hào)通路（HSA04933）、AMPK 信號(hào)通路（HSA04152）發(fā)揮治療作用。AGE/RAGE 信號(hào)通路通過激活 NOx-1 和降低 SOD-1 的表達(dá)來增加氧化應(yīng)激，從而促進(jìn)糖尿病介導(dǎo)的血管鈣化[26]。六味地黃丸中調(diào)控 AGE-RAGE 糖尿病并發(fā)癥信號(hào)通路治療 T2DM 及其并發(fā)癥（動(dòng)脈粥樣硬化和腎?。瑓⑴c抗炎、抗氧化應(yīng)激和減輕 β 細(xì)胞損傷[27]。在高糖處理的 HUVECs 中，甘氨酸可能通過抑制 AGE/RAGE 信號(hào)通路和隨后的氧化應(yīng)激，從而預(yù)防糖尿病大血管并發(fā)癥[28]。黃芪-葛根藥對(duì)調(diào)控 AMPK 信號(hào)通路影響胰島素抵抗、糖原合成、糖異生、胰島 β 細(xì)胞、炎癥反應(yīng)等過程對(duì)糖尿病發(fā)揮治療作用[29]。健脾消渴方可能通過 AMPK/mTOR 信號(hào)通路改善胰島功能，增加胰島素分泌，改善糖尿病的發(fā)展[30]。

A

B

C

D

Figure 2 GO and KEGG enrichment analysis (A: The top 20 GO enrichment analysis of 141 targets; B: The top 10 targets analysis of GO enrichment; C: The top 20 KEGG enrichment analysis of 141 targets; D: The top 10 targets analysis of KEGG enrichment)

圖 3 黃地安消膠囊“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)（藍(lán)色橢圓節(jié)點(diǎn)代表主要藥物成分，紅色橢圓節(jié)點(diǎn)代表核心靶點(diǎn)，綠色長方形節(jié)點(diǎn)代表涉及的信號(hào)通路）

Figure 3 HDAXC-prescription composition-prototype “components-targets-pathways” (Blue oval nodes represent major drug components, red oval nodes represent core targets and green rectangular nodes represent signalling pathways involved)

圖 4 AKT1（A）、VEGFA（B）、SRC（C）、EGFR（D）mRNA 的表達(dá)（#P < 0.01 為與對(duì)照組相比較，*P < 0.01 為與模型組相比較）

Figure 4 Change in AKT1 (A), VEGFA (B), SRC (C) and EGFR (D) mRNA expression was observed by qPCR (#< 0.01 for comparison with control group,*< 0.01 for comparison with model group)

圖 5 AKT1（A）、VEGFA（B）、SRC（C）、EGFR（D）蛋白表達(dá)以及蛋白免疫印跡圖（E）（#P < 0.01 為與對(duì)照組相比較，*P < 0.01 為與模型組相比較）

Figure 5 Change in AKT1 (A), VEGFA (B), SRC (C) and EGFR (D) protein expression was observed by Western blot (E) (#< 0.01 for comparison with control group,*< 0.01 for comparison with model group)

本研究預(yù)測(cè)了黃地安消膠囊中的 28 個(gè)活性成分、10 個(gè)潛在靶點(diǎn)和 19 個(gè)相關(guān)信號(hào)通路并對(duì) 4 個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行 RT-qPCR 和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。其中，木蘭花堿、高良姜素、槲皮素等可能通過 AGE/RAGE 合并糖尿病并發(fā)癥信號(hào)通路、AMPK 信號(hào)通路等作用于 AKT1、VEGFA、SRC、EGFR 等靶點(diǎn)，參與T2DM 及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。闡明了黃地安消膠囊治療T2DM 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和可能的作用機(jī)制，為后續(xù)藥理研究拓寬了思路。

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To study the mechanism and main material basis of Huangdi Anxiao capsules in the treatment of T2DM using UPLC-Q-TOF-MSEcombined with network pharmacology

ZHANG Wei, SHAN Li, ZHU Meng-qing, LIU Xiao-chuang, GAO Jia-rong

Author Affiliations:Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230031, China (ZHANG Wei, SHAN Li, ZHU Meng-qing, LIU Xiao-chuang, GAO Jia-rong); College of Pharmacy (ZHANG Wei), Anhui Province Key Laboratory of Chinese Medicinal Formula (GAO Jia-rong), Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China

To explore the main material basis and mechanism of action of Huangdi Anxiao capsules (HDAXC) in the treatment of type 2 diabetes mellitus (T2DM) by using serum medicinal chemistry combined with network pharmacology.UPLC-Q-TOF-MSEwas used to detect the blood components of the drug from serum samples of T2DM model rats after gavage of HDAXC, and T2DM-related targets was searched through the Swiss Target Prediction database, the GeneCards database and DrugBack database. The intersection targets of drug and disease were subjected to the GO function and KEGG pathway enrichment in the Metascape database and visualized.A total of 53 blood components were detected in the serum samples, including 28 prototype components. The28 blood-entry prototype components of HDAXC acted on 495 targets, and 141 T2DM-related targets were retrieved. The intersection of the three was used to obtain the potential target genes of HDAXC in the treatment of T2DM. According to PPI network, VEGFA, AKT1, SRC and EGFR might be the key target genes of HDAXC in the treatment of T2DM. In GO function analysis, 5050 genes were classified into biological processes (BPs), 431 into cell components (CCs) and 802 into molecular functions (MFs). 19 pathways related to key targets were obtained by KEGG enrichment analysis. Experimental verification showed that the key blood ingredient of HDAXC effectively inhibited the protein and gene expression of the key targets.Among the 28 blood components of HDAXC, magnoflorine, galangin, quercetin and et al. may act on VEGFA, AKT1, SRC and EGFR to regulate AGE-RAGE diabetes complications and AMPK signaling pathways, thereby playing therapeutic effects.

Huangdi Anxiao capsule; type 2 diabetes mellitus; UPLC-Q-TOF-MSE; network pharmacology; experimental verification

LIU Xiao-chuang, Email: zyyxcliu@ahtcm.edu.cn; GAO Jia-rong, Email: zyfygjr2006@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2022.05.005

安徽省重點(diǎn)研究與開發(fā)計(jì)劃（2022e07020024）；安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床科學(xué)研究項(xiàng)目（2020yfyzc05）

劉曉闖，Email：zyyxcliu@ahtcm.edu.cn；高家榮，Email：zyfygjr2006@163.com

2022-02-25