張 靜 孫升云 葛茂功 朱詩平 馮偉峰

腎間質纖維化(Renal Interstitial Fibrosis，RIF)指在各種致病因子如炎癥、損傷、藥物等的作用下，細胞外基質(Extracellular Matrix，ECM)大量堆積，RIF是導致腎小球硬化和小管間質纖維化的關鍵因素[1]，它是各種原因導致腎臟疾病進展到慢性腎臟病的共同途徑和主要病理基礎。研究發(fā)現，轉化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)/Smads信號轉導通路是致纖維化的關鍵路徑[2]。慢腎康寧是在臨床上用來治療慢性腎衰的經驗方,取得了較好的臨床療效。本實驗應用腺嘌呤誘導的以腎間質纖維化為主要病理表現的慢性腎臟病大鼠模型觀察慢腎康寧對實驗動物腎臟病理形態(tài)學、Smad2、P-smad2及SARA蛋白表達的影響，探討慢腎康寧保護腎臟功能的作用機制，為臨床應用提供分子生物學理論依據。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物選用健康、雄性Wistar大鼠60只(體質量160～200 g，清潔級，由南方醫(yī)科大學動物中心提供，動物合格證號scxk粵2006-004)。

1.1.2 主要試劑Smad2、P-smad2抗體由Cell Signaling Technology公司提供，SARA抗體由Epitomic公司提供。

1.1.3 實驗用藥慢腎康寧使用顆粒劑由黃芪30 g，黨參15 g，麥冬12 g，淫羊藿20 g，生地黃12 g，丹參10 g，大黃9 g，山萸肉 9 g，茯苓15 g，海螵蛸15 g組成。該藥由三九醫(yī)藥有限公司生產，購于暨南大學附屬第一醫(yī)院。上藥按比例稱取后，每日沖服。氯沙坦鉀片(科素亞，100 mg /片)由杭州默沙東制藥有限公司提供(批號：H20000371)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型和分組動物隨機分為正常組，模型組(給予同等量生理鹽水經口灌服)，氯沙坦組，慢腎康寧高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只。根據大鼠的用藥量(mg/kg)= 臨床常用量(mg/kg)×老鼠等效面積系數(6.25)。以此公式結果為中劑量，按15 g/(kg·d)給藥。低劑量為中劑量的一半[7.5 g/(kg·d)]，高劑量為中劑量的2倍[30 g/(kg·d)]。氯沙坦給予10 mg/(kg·d)經口灌服。共給藥21 d。

1.2.2 標本收集治療21 d結束后稱量各組大鼠體質量，當天用代謝籠收集大鼠24 h尿液，記錄24 h尿量。第22天于采用戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采集血液，同時迅速取雙側腎臟組織，取左側腎臟以4%多聚甲醛固定進行病理學觀察；另留取部分置于-80 ℃冰箱保存，進行蛋白的提取、測定。

1.3 實驗方法

1.3.1 生化指標的測定檢測血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)， 24 h尿微量蛋白(24 h MTP)取樣送暨南大學附屬第一醫(yī)院檢驗科測定。

1.3.2 病理學染色腎組織經4%多聚甲醛固定、脫水，石蠟包埋制成切片，進行HE染色及Masson染色。

1.3.3 Smad2 P-smad2及SARA蛋白分析取-80 ℃保存的腎組織100～150 mg,經RIPA蛋白裂解液成勻漿，4 ℃，12 000 g離心2 min，取上清液。采用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，每泳道上取變性的蛋白各10 μl/孔，蛋白質經10%或8%SDS-PAGE垂直凝膠進行電泳。恒壓下將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h或4 ℃過夜，一抗4 ℃過夜，二抗37 ℃ 孵育2 h。每步驟后均經TBST漂洗，10 min×3次。最后加ECL發(fā)光試劑，雜交信號在Imagetool圖像分析系統(tǒng)中進行吸光度分析。

2 結果

2.1 腎臟組織HE染色情況HE染色在正常組大鼠腎臟皮質、髓質皆正常，組織結構無明顯病理變化。模型組大鼠腎臟組織內見大量腎小管上皮細胞凋亡、壞死，部分腎小管擴張；腎間質與腎小管界限不清，腎間質內有大量纖維組織增生、肉芽形成，并有大量炎癥細胞浸潤；腎間質、腎小管內有大量褐色結晶物沉積；病變腎小球有不同程度的硬化、萎縮，甚至壞死，部分腎小球呈代償性擴張。慢腎康寧各劑量組腎組織內也可見炎癥細胞浸潤、間質纖維化，腎小管萎縮、壞死、擴張，腎小管及間質內有褐色結晶物沉積等改變，但程度輕于模型組。見圖1。

圖1 慢腎康寧對RIF大鼠腎組織病理學變化的影響 (HE染色，×200)

2.2 腎臟組織Masson染色情況正常組腎組織皮質、髓質皆正常，腎小球、腎小管無結構改變，腎間質結構無異常改變，個別間質含有少量的膠原纖維。模型組：腎間質面積明顯增大，小管萎縮或擴張情況明顯，腎小球及腎間質有明顯的膠原纖維聚集，棕黃色結晶顆粒占據整個腎小管，腎小球中亦有較多沉積。與模型組相比，慢腎康寧各劑量組間質纖維化均有不同程度的減輕，腎小管萎縮或擴張情況不同程度好轉，腎間質的面積明顯縮小，棕黃色顆粒在腎小球、腎小管沉積明顯減少；慢腎康寧高劑量組間質纖維化改變與氯沙坦組接近。見圖2。

圖2 慢腎康寧對RIF大鼠腎組織病理學變化的影響 (Masson染色，×200)

2.3 慢腎康寧對RIF大鼠血Scr BUN 24 h MTP及eGFR影響模型組Scr、BUN和24 h MTP都明顯高于正常組(P<0.05)；慢腎康寧高劑量組、中劑量組、低劑量組及氯沙坦組Scr、BUN和24 h MTP都明顯低于模型組(P<0.05)；其中，慢腎康寧高劑量組與氯沙坦組Scr、BUN和24 h MTP差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明慢腎康寧和氯沙坦在降低Scr、BUN和24 h MTP的療效相當。 見表1。

表1 慢腎康寧對RIF大鼠血Scr BUN 24 h MTP eGFR的影響 (只，

2.4 慢腎康寧對RIF大鼠腎臟組織Smad2 P-smad2及SARA蛋白相對表達量影響模型組大鼠腎臟Smad2、P-smad2蛋白表達水平均升高，與正常組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；慢腎康寧高劑量組、中劑量組和氯沙坦組Smad2蛋白表達較模型組降低(P<0.01)；低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義。慢腎康寧高劑量組、中劑量組、低劑量組和氯沙坦組P-smad2蛋白表達較模型組顯著降低(P<0.01)。模型組SARA蛋白表達較正常腎組織顯著升高(P<0.01)；慢腎康寧高劑量組、中劑量組和氯沙坦組SARA蛋白表達較模型組增加(P<0.01)；低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義。見表2，圖3～圖5。

表2 慢腎康寧對RIF大鼠腎臟組織Smad2 P-smad2及SARA蛋白表達影響

圖3 慢腎康寧對RIF大鼠腎臟組織Smad2蛋白表達的影響

圖4 慢腎康寧對RIF大鼠腎臟組織P-smad2蛋白表達的影響

圖5 慢腎康寧對RIF大鼠腎臟組織SARA蛋白表達的影響

3 討論

研究證實，慢性腎病患者人數在世界范圍內已達 6.975 億，中國患病人數占18.97%，達到了1.323 億人[3]，但是對于大多數已經進入終末期腎病的慢性腎病患者，透析和腎移植是惟一選擇，據統(tǒng)計，6%的患者在等待移植中即已死亡,能接受腎移植的患者只有25%[4]。腎間質纖維化是各種慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease，CKD)進展到終末期腎臟病(End Stage Renal Disease，ESRD)的共同表現和病理基礎，這一觀點已得到專家一致認可[5]。阻斷腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化(Tubular Epithelial To Mesenchymal Transition，TEMT) 可以有效延緩慢性腎臟病的腎間質纖維化進程[6]，下調TGF-β1/ Smad信號傳導通路，可以有效減少細胞外基質的積聚[7-9]。

根據慢性腎臟病的臨床表現及發(fā)病特點，可歸屬于中醫(yī)水腫、癃閉、關格等范疇。病機特點為本虛標實，正不勝邪，本虛以脾腎兩虛為主，標實以濕濁、痰濁、水毒為主。慢腎康寧中以黃芪、淫羊藿、山萸肉益氣補腎，腎氣、腎陽充盛則氣化固攝功能可復，津液代謝正常；丹參、生地黃益腎、活血涼血祛瘀，改善血液循環(huán)；麥冬歸肺經，助黃芪以益肺祛痰濕以益元陽；山藥益氣養(yǎng)陰，平補三焦，大黃通腑降濁，既防黨參、黃芪、淫羊藿等補藥壅滯，又佐眾滋補藥之溫。全方攻補兼施，標本同治，共奏益氣補腎，活血養(yǎng)血，通腑瀉濁之功效[10]。前期的動物實驗表明慢腎康寧可以改善CKD大鼠的一般形態(tài)，降低尿蛋白，減少Scr、BUN、24 h MTP，減輕大鼠腎臟組織病理損傷，保護腎功能，延緩腎損害進程，其具體作用機制尚待進一步研究[11]。

Smad2作為TGF-β1在細胞內特有的作用底物介導了信號由細胞膜進入細胞核，Smad2/3蛋白的磷酸化代表了TGF-β/Smad信號傳導通路的激活[12]，抑制P-Smad2/3的表達可減緩RIF進程[13]。SARA與Smad2和Smad3的磷酸化有關[14]，在Smad2/Smad3和TGF-β受體之間起到橋梁作用，靶向SARA可以調控TGF-β的靶效應，從而具有潛在的治療價值[15]。已有研究證實[16]，SARA通過調節(jié)腎小管上皮細胞Smad2和Smad3的激活來調節(jié)高糖誘導的EMT和ECM排泄，以此推論SARA可能在EMT前狀態(tài)下成為潛在的新型靶標，以改善在慢性腎臟疾病中發(fā)現的腎纖維化。

本實驗選用陽性對照藥物氯沙坦，能減少蛋白尿，阻斷腎間質纖維化的發(fā)生和發(fā)展，改善慢性腎臟病的預后，是目前臨床上運用明確有效的降壓保腎藥物[17，18]。前期的研究顯示[19]：氯沙坦具有使Smad7 mRNA的表達增加，干預了TGF-β1/Smads信號通路的傳遞，延緩了腎間質纖維化的進展。

本實驗觀察到，在正常腎組織，Smad2和P-smad2蛋白呈低水平表達，在模型組中的表達均增加，提示Smad2蛋白參與了腎臟纖維化的過程；各治療組的Smad2和P-smad2蛋白的表達低于模型組，提示藥物治療能降低Smad2和P-smad2蛋白的表達。SARA蛋白在正常腎組織高水平表達，在腎間質纖維化模型大鼠腎組織中的表達均減少，各治療組的SARA蛋白的表達高于模型組。由此可以推測，慢腎康寧可能是通過降低Smad2和P-smad2蛋白及升高SARA蛋白的表達，抑制TGF-β/Smad信號傳導通路，減少ECM的進行性積聚，從而延緩腎纖維化進程。