劉蘭 劉潺 加明明 萬(wàn)璐 吳小軍

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，武漢 430060)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性病原體，會(huì)引起肺炎、尿路感染、以及嚴(yán)重的血流感染[1]。常規(guī)的治療方式是采用碳青霉烯類抗生素，例如亞胺培南、美羅培南等，但是隨著抗生素的濫用和耐藥性的擴(kuò)散，耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌已經(jīng)在全球廣泛分布，部分菌株甚至具有多重耐藥性[2-4]。因此，尋求抗生素以外的細(xì)菌病治療方式是當(dāng)務(wù)之急。

噬菌體是特異性侵染細(xì)菌的病毒，且廣泛存在于自然界，是細(xì)菌的“天敵”。與抗生素相比，噬菌體具有研發(fā)快、特異性強(qiáng)、避免殺滅人體益生菌群以及對(duì)人體毒性低等優(yōu)勢(shì)，因此面對(duì)多重耐藥菌的威脅，噬菌體療法的研究和應(yīng)用已經(jīng)成為當(dāng)今的熱點(diǎn)，具有良好的發(fā)展前景[5]。

本研究以具有β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性，產(chǎn)SHV-18型ESBLs的標(biāo)準(zhǔn)菌株肺炎克雷伯菌K.pneumoniaeATCC700603[6]為宿主菌，從某醫(yī)院的污水中分離鑒定出了一株裂解性噬菌體，命名為P1，并對(duì)其裂解譜，最佳感染復(fù)數(shù)和熱穩(wěn)定性等生物學(xué)特性和基因組信息進(jìn)行了研究和分析，確定P1為一株全新發(fā)現(xiàn)的噬菌體。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

宿主菌K.pneumoniaeATCC700603，實(shí)驗(yàn)用菌株Escherichia coliMG1655，Staphylococcus aureusRN4220和Pseudomonas aeruginosaPAO1均為實(shí)驗(yàn)室存儲(chǔ)。臨床菌株K.pneumoniae2-21來(lái)源于武漢大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，從血流感染患者感染血液分離而來(lái)；裂解性噬菌體分離自武漢大學(xué)人民醫(yī)院附近的污水。所有K.pneumoniae菌株均在添加了100 μg/mL 氨芐西林的Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜震蕩培養(yǎng)，其它菌株在不添加抗生素的LB培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜震蕩培養(yǎng)。

1.2 噬菌體的分離純化和收集

該步驟全部采用雙層平板法。將過(guò)夜培養(yǎng)的K.pneumoniaeATCC700603菌液、0.22 μm濾膜過(guò)濾后的醫(yī)院污水和3×LB培養(yǎng)基等體積混合，37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。離心、0.22 μm濾膜過(guò)濾培養(yǎng)液上清后保留濾液。

制備LB固體下層平板(1.5%瓊脂)，在半固體LB培養(yǎng)基(0.7%瓊脂)中混合20 μL過(guò)夜培養(yǎng)的K.pneumoniaeATCC700603菌液和10 μL培養(yǎng)液濾液后平鋪為上層平板。37℃培養(yǎng)過(guò)夜后可看到宿主菌背景之上的透明圓形噬菌斑。

挑取單噬菌斑懸浮于SM buffer (NaCl，MgSO4，Tris-HCl pH7.5，2%glutin) 后再次與K.pneumoniaeATCC700603菌液混合制備雙層平板以進(jìn)行進(jìn)一步純化，進(jìn)行3輪“挑取噬菌斑-懸浮-鋪雙層LB平板”的循環(huán)。

收集噬菌體前，在上層平板滴加3～4 mL SM buffer，室溫下孵育2 h。輕刮下含噬菌斑的上層半固體平板，在SM buffer中搗碎。4℃，5000 r/min離心30 min后收集上清，用0.22 μm無(wú)菌濾器過(guò)濾上清，收集濾液并保存。

1.3 噬菌體裂解譜分析

分別以肺炎克雷伯菌臨床菌株K.pneumoniae2-21、大腸埃希菌E.coliMG1655、金黃色葡萄球菌S.aureusRN4220以及銅綠假單胞菌P.aeruginosaPAO1的穩(wěn)定期菌液作為宿主，與P1混合后利用雙層平板法測(cè)試P1的裂解譜，觀察是否有噬菌斑產(chǎn)生。有噬菌斑出現(xiàn)視為有裂解性，無(wú)噬菌斑視為無(wú)裂解性。

1.4 最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)測(cè)試

參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，噬菌體與宿主菌的比值(MOI) 分別為0.01、0.1、1、10和100混合后用雙層平板培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)噬菌體PFU，得到噬菌體滴度最高的MOI即為最佳感染復(fù)數(shù)。

1.5 噬菌體熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別在室溫(room temperature,RT)、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃條件下處理噬菌體并開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別在20、40和60 min取樣，用雙層平板法計(jì)算噬菌體滴度。

1.6 噬菌體形態(tài)的電鏡觀察

將封口膜平鋪于冰盒上冷卻，將20 μL噬菌體原液滴在封口膜上，將銅網(wǎng)浸入噬菌體原液中，15 min后用濾紙吸除銅網(wǎng)上多余的液體，滴加適量的2%磷鎢酸(PTA)溶液，染色10 min后用濾紙吸干，放置于濾紙上，在陰涼處自然干燥后使用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。并按照國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)第九次病毒分類報(bào)告，對(duì)噬菌體形態(tài)進(jìn)行鑒定和分類。

1.7 噬菌體基因組提取、測(cè)序和生物信息學(xué)分析

將噬菌體P1與宿主菌共培養(yǎng)以進(jìn)行噬菌體的擴(kuò)增，5000 r/min離心30 min后取上清，用0.22 μm無(wú)菌濾器過(guò)濾，保留濾液。加入DNaes I(1 μg/mL)在37℃下消化4 h，以降解宿主DNA。加入0.5 mol/L EDTA，65℃放置30 min以失活DNase I。冷卻至室溫后加入蛋白酶K(50 μg/mL)，在56℃孵育1 h以裂解噬菌體蛋白衣殼。進(jìn)行酚氯仿抽提步驟以除去蛋白，保留DNA。得到的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)是否降解，同時(shí)用宿主基因組匹配引物對(duì)得到的產(chǎn)物進(jìn)行PCR以檢測(cè)噬菌體基因組污染情況。

DNA文庫(kù)構(gòu)建使用Vazyme公司的TruePrep Index Kit V3 for Illumina進(jìn)行，具體操作參照產(chǎn)品說(shuō)明，用Qubit蛋白核酸定量?jī)x對(duì)DNA文庫(kù)樣品量進(jìn)行檢測(cè)。使用Illumina平臺(tái)X-ten進(jìn)行測(cè)序，二代測(cè)序由安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司完成。測(cè)序結(jié)果的分析分別使用FastqC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)和Trim galore (https://www.encodeproject.org/software/trim_galore/)進(jìn)行質(zhì)控和低質(zhì)量reads去除；分別使用megahit (http://www.l3-bioinfo.com/products/megahit.html)[8]和RAST (http://rast.nmpdr.org/)[9]進(jìn)行基因組組裝和注釋，基因組數(shù)據(jù)已提交至NCBI，獲取序列號(hào)MZ598515。使用NCBI在線BLAST功能進(jìn)行同源序列比對(duì)，應(yīng)用MEGA-X software(https://www.megasoftware.net/)[10]構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離鑒定

本研究以肺炎克雷伯菌ATCC700603為宿主菌，經(jīng)過(guò)雙層平板法多次純化后，從污水中分離到一株裂解性噬菌體，命名為P1，P1擁有直徑為2～5 mm的噬菌斑，有明顯的暈環(huán)(圖1)。

圖1 噬菌體P1形成的噬菌斑Fig.1 Plaque of P1

2.2 裂解譜

P1無(wú)法裂解肺炎克雷伯菌臨床菌株K.pneumoniae2-21、大腸埃希菌E.coliMG1655、金黃色葡萄球菌S.aureusRN4220以及銅綠假單胞菌P.aeruginosaPAO1，說(shuō)明P1具有強(qiáng)特異性(圖2和表1)。

表1 噬菌體P1裂解譜Tab.1 The host range of phage P1

圖2 噬菌體P1裂解譜測(cè)試Fig.2 Test of lysis range of P1

2.3 噬菌體生物學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

本研究得知噬菌體P1在MOI=10時(shí)達(dá)到最高滴度，即最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)為10(表2)。

表2 噬菌體P1的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)測(cè)定Tab.2 Determination of optimal multiplicity of infection (MOI)of P1

本研究測(cè)試了噬菌體P1在不同溫度下的穩(wěn)定性，結(jié)果表明P1耐受50℃及以下溫度，在60℃及以上溫度處理下穩(wěn)定性明顯降低，在70℃及以上處理時(shí)20 min即可看到噬菌體穩(wěn)定性驟降(圖3)。

圖3 噬菌體P1熱穩(wěn)定性Fig.3 Resistance of P1 to temperature

2.4 噬菌體形態(tài)的電鏡觀察

經(jīng)透射電鏡觀察，噬菌體P1擁有一個(gè)典型的二十面體頭部結(jié)構(gòu)以及一個(gè)不可伸縮的尾絲結(jié)構(gòu)。二十面體頭部直徑大約為55～60 nm，尾絲長(zhǎng)度約為150～155 nm。根據(jù)ICTV第九次報(bào)告，P1應(yīng)該被歸類為有尾體目，長(zhǎng)尾噬菌體科(圖4)。

圖4 噬菌體P1透射電鏡照片F(xiàn)ig.4 Transmission electron micrographs of phage P1

2.5 全基因組測(cè)序及結(jié)果分析

2.5.1 全基因組概述

二代測(cè)序結(jié)果顯示，噬菌體P1基因組含50675 bp DNA，GC含量為50.88%，預(yù)測(cè)到82個(gè)編碼序列(CDS)。經(jīng)NCBI比對(duì)，與噬菌體P1的全基因組序列最相近的是Klebsiellaphage KOX1[11]，具有97.18%的一致性和89%的覆蓋率。

2.5.2 基因功能預(yù)測(cè)

在82個(gè)分析到的CDS中，50個(gè)為功能未知的假設(shè)蛋白，32個(gè)為可預(yù)測(cè)到蛋白功能的CDS，包含了噬菌體頭部/衣殼蛋白、尾部蛋白、DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白等(表3)。

表3 噬菌體P1的ORF功能預(yù)測(cè)(不含假設(shè)蛋白)Tab.3 Prediction of ORF function of phage P1 (without hypothetical protein)

2.5.3 序列比對(duì)與的系統(tǒng)發(fā)育分析

為進(jìn)一步研究噬菌體P1的進(jìn)化關(guān)系以及了解宿主特異性與噬菌體尾絲蛋白基因序列的關(guān)系，基于噬菌體保守的末端酶大亞基(ORF 2)與尾絲蛋白蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖5A)，進(jìn)化分析結(jié)果表明噬菌體P1與克雷伯菌噬菌體KOX1、PKP126、LF20、P528等具有更近的親緣性。而尾絲蛋白序列同源性最高的為克雷伯菌噬菌體LF20、PKP126、KLPN1、KOX1(圖5B)。

圖5 噬菌體P1進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic analyses of phage P1 and homologous phages.

3 討論

從1980年以來(lái)，人類很少發(fā)現(xiàn)新的抗生素種類，世衛(wèi)組織在2017年確認(rèn)并宣布當(dāng)今世界抗生素瀕臨枯竭，細(xì)菌耐藥將成為人類健康最大的威脅之一。在全世界范圍內(nèi)，“ESKAPE”病原體，即致病性大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和糞腸球菌是院內(nèi)耐藥細(xì)菌感染的代表。在此背景下，噬菌體治療理論與應(yīng)用研究的輝煌時(shí)代應(yīng)運(yùn)而生[5]，噬菌體是細(xì)菌的“天敵”，除了研發(fā)新的抗菌藥物以外，尋找自然界中對(duì)應(yīng)的噬菌體攻克耐藥細(xì)菌從而與耐藥菌的進(jìn)化“賽跑”同樣為一種好的思路。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于“ESKAPE”病原體的噬菌體分離鑒定、功能及基因組學(xué)研究等已取得了不菲的成果[7,12-16]。

肺炎克雷伯菌作為腸桿菌科的一員，是醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的常見(jiàn)病原體，可引起多種感染，特別是多重耐藥肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯類超強(qiáng)毒力克雷伯菌(CR-hvKP)的出現(xiàn)給肺炎克雷伯菌感染的治療帶來(lái)了更嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[17]，此外，肺炎克雷伯菌莢膜血清型的多樣化(至少79種)也大大增加了治療的復(fù)雜性，進(jìn)一步限制了抗生素治療的選擇性，因此，尋找肺炎克雷伯耐藥菌株感染的替代治療方法勢(shì)在必行。已有研究報(bào)道，應(yīng)用一株新型噬菌體(PKP2)聯(lián)合慶大霉素可有效治療肺炎克雷伯菌感染的小鼠，聯(lián)合治療組小鼠不僅全部存活，而且肺部的病理改變和炎癥因子均恢復(fù)到正常水平，療效優(yōu)于慶大霉素單藥治療[18]。

本研究分離到的肺炎克雷伯菌裂解噬菌體P1在最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)為10時(shí)的一步生長(zhǎng)曲線顯示出較短的潛伏期和較大的裂解量，表明其具有較強(qiáng)的裂解性質(zhì)。且在40℃和50℃時(shí)存活率保持在較高水平，這與之前許多研究報(bào)道的噬菌體最適溫度相似[14]?；蚪MBLAST結(jié)果表明，除與Klebsiellaphage KOX1具有較高的相似性外(97.18%的一致性和89%的覆蓋率)，P1基因組與NCBI發(fā)表的其他噬菌體基因組相似性較低，這也提示可以將這些噬菌體的研究與噬菌體P1結(jié)合起來(lái)，分析它們?cè)诨蚪M中的共性和差異，這樣不僅可以更深入地了解噬菌體P1，更重要的是挖掘出目前未知的信息。

尾絲蛋白作為噬菌體特異性識(shí)別宿主的物質(zhì)基礎(chǔ)，決定了噬菌體的宿主范圍，在這次研究中，挑選的部分臨床菌株均無(wú)法被噬菌體P1特異性吸附裂解，這可能和噬菌體往往具有嚴(yán)格的宿主特異性有關(guān)，且噬菌體P1尾絲蛋白同源序列比對(duì)結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明了其具有很強(qiáng)的宿主特異性。而其對(duì)肺炎克雷伯菌ATCC700603(分離自院內(nèi)感染患者尿液，莢膜血清型為K6，具有編碼ESBLs基因bla-SHV-18的質(zhì)粒)的裂解特異性填補(bǔ)了針對(duì)K6血清型肺炎克雷伯菌感染的噬菌體文庫(kù)的空白，也為后續(xù)的噬菌體-抗生素聯(lián)合治療提供了理論依據(jù)，在未來(lái)，P1有望成為K6血清型肺炎克雷伯菌感染的治療劑。值得注意的是，基因測(cè)序分析表明，該噬菌體未見(jiàn)已知毒素基因，這也為今后噬菌體應(yīng)用于臨床治療提供了安全保障。

4 結(jié)論

本研究從醫(yī)院的污水中成功分離出一株新型肺炎克雷伯菌裂解性噬菌體，經(jīng)電鏡觀察，屬于典型的有尾噬菌體，命名為“P1”，并進(jìn)一步研究了裂解譜、最佳感染復(fù)數(shù)、全基因組及基因功能的特性，為肺炎克雷伯菌的噬菌體治療提供理論基礎(chǔ)和噬菌體儲(chǔ)備。除此之外，噬菌體P1的噬菌斑所形成的暈環(huán)大、圓，暈環(huán)內(nèi)的宿主特性值得進(jìn)一步研究。加快對(duì)新型噬菌體的分離鑒定和基因組測(cè)序研究，明確噬菌體與宿主菌之間的相互作用機(jī)制對(duì)未來(lái)抗生素替代療法的發(fā)展意義重大。