吳光旭 吳紅林 李吉順 李天磊2, 吳松,* 潘衛(wèi)東

(1 貴州醫(yī)科大學(xué)，藥學(xué)院/省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025；2 貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550014；3 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所 天然產(chǎn)物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

黃酮類天然產(chǎn)物廣泛分布于植物界中，該類天然產(chǎn)物具有廣泛的生物活性，如抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等，不同類型的黃酮類化合物被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健品、化妝品等領(lǐng)域。近年來(lái)，黃酮類化合物的抗菌活性日益受到重視[1]，黃酮類化合物主要通過(guò)抑制細(xì)菌DNA合成[2]、改變膜電位和細(xì)胞膜功能[3]及抑制細(xì)菌能量代謝[4-5]等多種作用機(jī)制發(fā)揮抗菌作用。前期研究顯示不同植物來(lái)源的黃酮提取物具有較為廣泛的抗菌活性[6]，尤其是3-羥基黃酮類天然產(chǎn)物活性較為突出，其主要的抗菌活性-構(gòu)效關(guān)系總結(jié)如圖1。目前，針對(duì)槲皮素(quercetin)、高良姜素(galangin)、蘆丁(rutin)、山柰酚(kaemperol)及其結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)物等的抗菌活性研究較多(圖1)[7-10]，但是對(duì)楊梅素(myricetin)及其糖苷衍生物抗菌活性研究較少。

圖1 具有抗菌活性的代表黃酮苷類衍生物及其構(gòu)效關(guān)系總結(jié)[7-10]Fig.1 Summary of representative flavonoid glycoside derivatives and structure-activity relationship[7-10]

當(dāng)前，細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性日益增強(qiáng)，正成為對(duì)公共健康的嚴(yán)重威脅。在臨床細(xì)菌感染疾病中，幾乎70%的病原菌表現(xiàn)出對(duì)一種或多種抗菌藥不同程度的耐受[11-12]。在當(dāng)前細(xì)菌對(duì)臨床藥物耐受全面加劇和新型抗生素研發(fā)進(jìn)展緩慢的雙重夾擊下，從天然產(chǎn)物中尋找和發(fā)現(xiàn)抗菌先導(dǎo)化合物是當(dāng)下發(fā)現(xiàn)新型抗菌藥物最具前景的途徑之一[13-15]。為了發(fā)現(xiàn)具有抗菌活性的黃酮醇類化合物，本研究以天然產(chǎn)物楊梅苷作為原料，通過(guò)不同的保護(hù)策略、烷基化、酯化反應(yīng)和糖苷化反應(yīng)制備合成了14個(gè)楊梅素衍生物，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行了金黃色葡萄球菌、腸球菌和表皮葡萄球菌抑菌活性測(cè)試，并對(duì)其抗菌活性構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了初步探索。

1 材料

1.1 主要儀器

磁力攪拌器 (IKA RCT Basic)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA SB-1300)，超導(dǎo)核磁共振波譜儀(Bruker AV-500)，高效液相-單級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters ACQUITY QDa)，高效液相色譜儀(Shimadzu LC-6AD)，低溫反應(yīng)儀器(EYELA PSL-1810)，酶標(biāo)儀(Multiskan FC) 。

1.2 主要試劑

N,N-二甲基甲酰胺，甲醇，四氫呋喃，異丙醇，鹽酸-二氧六環(huán)溶液，碳酸銫，4-二甲氨基吡啶，二環(huán)己基碳二亞胺，鈀碳，溴芐，對(duì)甲苯磺酸-一水合物，全乙?；肴樘?，楊梅苷。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 楊梅素類衍生物合成

前期文獻(xiàn)報(bào)道，3-羥基黃酮醇類半乳糖苷類衍生物顯示較好的抗菌活性，其中山奈酚糖苷類化合物(1，圖1)，經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)優(yōu)化，在苷元3-羥基黃酮醇B環(huán)上引入羥基，同時(shí)用半乳糖修飾得到了對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗菌活性更好的先導(dǎo)化合物(2，圖1)[2]。基于前期研究結(jié)果，為了進(jìn)一步探索3-羥基黃酮醇類抗菌活性-構(gòu)效關(guān)系，設(shè)計(jì)合成了3-羥基黃酮醇B環(huán)三羥基取代半乳糖苷衍生物。由于多取代黃酮醇類化合物的制備方法受到取代羥基的影響較大，為了快速高效獲取一定量的化合物用于活性篩選，采用了以天然楊梅苷作為原料進(jìn)行選擇性糖基化修飾策略。首先，利用天然楊梅苷(B環(huán)具有3個(gè)羥基取代)(4，圖2)作為原料，通過(guò)楊梅苷3-位糖基殘基可以對(duì)3-位形成天然的保護(hù)優(yōu)勢(shì)，經(jīng)過(guò)芐基保護(hù)和直接酸解的方法脫除糖基殘基得到了3-位羥基游離的黃酮醇中間體5。然后，中間體5與α-溴代-2,3,4,6-四乙酰半乳糖苷糖苷反應(yīng)制備得到全乙酰化β-半乳糖苷，緊接著在堿性條件下脫除乙?；玫街虚g體6。在酸性條件下，中間體6通過(guò)選擇性丙酮叉基保護(hù)半乳糖3′′,4′-二羥基，該中間體7可以直接通過(guò)?；磻?yīng)對(duì)半乳糖2′,6′′-二羥基進(jìn)行修飾，制備糖基選擇性修飾的化合物。最后，針對(duì)半乳糖2′′,6′′-二羥基修飾官能團(tuán)的耐受性，通過(guò)不同的脫芐基保護(hù)策略和羥基脫保護(hù)制備相應(yīng)的目標(biāo)產(chǎn)物9和10，具體合成路線及反應(yīng)條件如圖2所示。同時(shí)，中間體5的3-位游離羥基通過(guò)與不同的?；噭┓磻?yīng)，可以高效制備3-羥基?；a(chǎn)物11，其制備方法和結(jié)構(gòu)表征參考已報(bào)道方法[16]。

圖2 楊梅素糖苷類衍生物的合成路線Fig.2 Synthetic route of myricetin glycoside derivatives

通過(guò)以上方法，共計(jì)合成新型楊梅素糖苷化合物8個(gè)：9a-1～9a-5和10a-1～10a-3，其中在半乳糖2′′,6′′-位進(jìn)行了不同取代的苯丙酰基和肉桂?；揎?；另外還有6個(gè)3-位羥基不同酰化修飾的楊梅素衍生物11a-1～11a-6。目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式如表1所示。

表1 合成的楊梅素糖苷類衍生物Tab.1 Synthetic myricetin glycoside derivatives

中間體5：5,7-雙(芐氧基)-3-羥基-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-4H-苯并吡喃酮

在反應(yīng)瓶中加入楊梅苷37.1 g(80 mmol)，Cs2CO3156.5 g(480 mmol)及DMF(200 mL)，0.5 h內(nèi)滴加溴芐58.0 mL(480 mmol)。氬氣保護(hù)下，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。用EtOAc(300 mL)稀釋反應(yīng)液后過(guò)濾，EtOAc(2×50 mL)洗滌、濾液用飽和氯化鈉洗(3×100 mL)、無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾、減壓旋干得到紅棕色黏稠物。將上述紅棕色黏稠物溶解在i-PrOH(300 mL)中，加入HCl(3 mL)，加熱回流反應(yīng)15 min后，有沉淀析出。繼續(xù)攪拌至原料反應(yīng)完畢(LC-MS監(jiān)測(cè))，過(guò)濾、EtOH(2×50 mL)洗滌，以EtOAc重結(jié)晶、干燥即得中間體5 46.7 g，淡黃色固體，收率為76%。m.p.172℃～174℃，ESI-MSm/z: 769.36 [M+H]+，C50H40O8，WM=768.27；1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ 9.34 (s,1H),7.92-7.16 (m,27H),6.98 (s,1H),6.72 (s,1H),5.27 (s,4H),5.20 (s,4H),5.04 (s,2H)。

中間體6：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

在反應(yīng)瓶中加入15.4 g中間體5(20 mmol)，加入200 mL干燥DMF，攪拌溶解后，加入9.8 g(30 mmol)Cs2CO3，0℃下攪拌反應(yīng)10 min后，加入12.3 g(30 mmol)新制備的α-溴代-2,3,4,6-四乙?；肴樘擒眨?℃下繼續(xù)攪拌過(guò)夜，次日LC-MS監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完全，將反應(yīng)液倒入500 mL冰水中，加入500 mLEtOAc萃取，然后以EtOAc(2×200 mL)再次萃取、合并有機(jī)相，水洗(3×500 mL)后，飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾、減壓旋干得淡黃色黏稠物，加入200 mL THF溶解上述黏稠物，加入200 mL 10%NaOH溶液，常溫下繼續(xù)反應(yīng)。LC-MS監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液倒入分液漏斗中，用EtOAc(3×50 mL)萃取、合并有機(jī)相，以飽和食鹽水(5×100 mL)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾、減壓旋干得到淡黃色黏稠物，以二氯甲烷復(fù)溶后，100～200目硅膠拌樣，柱層析分離純化(PE: EA=1:1)得中間體6 13.0 g，收率為70%。m.p.188～189℃,ESI-MSm/z: 931.27[M+H]+,C56H50O13,MW=930.33;1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ 7.70(s,2H),7.61 (d,J=7.5 Hz,2H),7.54 (d,J=7.3Hz,4H),7.51 (d,J=7.3 Hz,2H),7.37(m,17H),6.92 (d,J=2.1 Hz,1H),6.75 (d,J=2.1 Hz,1H),5.49 (d,J=7.8 Hz,1H),5.35(s,1H),5.26～4.98 (m,6H),5.18 (d,J=11.8 Hz,2H),5.05 (q,J=11.2 Hz,2H),4.89 (s,1H),4.64 (s,1H),4.54(s,1H),3.71 (s,1H),3.67 (t,J=8.6 Hz,1H),3.57 (dd,J=14.0,8.9 Hz,1H),3.45 (m,3H)。

中間體7：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-(3′,4′-O-異丙基)半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

將11.4 g(12 mmol)中間體6、800 mgp-TsOH.H2O、14 g無(wú)水CaSO4及200 mL丙酮加入反應(yīng)瓶中，攪拌24 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完畢后，過(guò)濾除去CaSO4，濾液中加入少量Et3N終止反應(yīng)，加入200～300目硅膠拌樣，柱層析分離純化(PE: EA=2:1)得中間體7 9.6 g，收率為83%。m.p.196℃～197℃，ESI-MSm/z: 971.46[M+H]+,C59H54O13,MW=970.36;1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ 7.70 (s,2H),7.61 (d,J=7.5 Hz,2H),7.51(d,J=7.3 Hz,6H),7.35(m,17H),6.92 (d,J=2.1 Hz,1H),6.76 (d,J=2.1 Hz,1H),5.64 (d,J=4.5 Hz,1H),5.52 (d,J=8.2 Hz,1H),5.25～5.22 (m,6H),5.14 (d,J=11.7 Hz,2H),5.05 (q,J=11.2 Hz,2H),4.78 (t,J=5.5 Hz,1H),4.14 (dd,J=5.5,1.7 Hz,1H),4.10 (m,1H),3.84 (m,1H),3.63 (t,J=11.2,5.6 Hz,1H),3.57 (m,1H),3.50 (t,J=7.6 Hz,1H),1.20 (d,6H) 。

中間體8a-1：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-[2′,6′′-2-O-(3-氟肉桂酰基)-3′′,4′-O-異丙基半乳糖基]-4H-苯并吡喃酮

將729 mg(0.75 mmol)化合物7、500 mg(3 mmol)間氟肉桂酸、1.2 g DCC(6 mmol)、360 mg(3 mmol)DMAP及20 mLCH2Cl2加入反應(yīng)瓶中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，LC-MS監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液放置在-40℃低溫浴槽中，過(guò)濾除去固體后，加入0.5 mol/L的檸檬酸溶液(3×20 mL)洗滌，有固體析出，過(guò)濾除去，用0.5 mol/L的NaHCO3(3×20 mL)洗滌，水洗至中性后，放置-40℃低溫浴槽中，有固體析出，過(guò)濾除去，向?yàn)V液中加入100～200目硅膠拌樣，柱層析分離純化(CH2Cl2:MeOH=200:1)得粗產(chǎn)品，濃縮后用二氯甲烷溶解，用100～200目硅膠拌樣，柱層析分離純化(PE:EA=3:1)得533 mg中間體8a-1，收率為56%。m.p.137℃～138℃，ESI-MSm/z: 1267.84[M+H]+,C77H64F2O15,MW=1266.45;1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 7.76～7.64 (m,3H),7.60 (d,J=16.1 Hz,1H),7.61～7.42 (m,5H),7.35～7.02 (m,31H),6.76 (d,J=16.0 Hz,1H),6.63 (d,J=7.9 Hz,2H),6.49 (d,J=16.0 Hz,1H),6.64～6.52 (m,3H),5.85 (d,J=8.4 Hz,1H),5.11～4.98(m,11H),4.59～4.50 (m,1H),4.50 (s,1H),4.36 (d,J=9.0 Hz,1H),4.29 (d,J=6.8 Hz,2H),1.24 (s,6H)。

用此類方法可獲得中間體8a-2～8a-8。

化合物8a-2：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-[2′′,6′-2-O-(4-甲基肉桂酰基)-3′,4′-O-異丙基半乳糖基]-4H-苯并吡喃酮

收率為55%,m.p.170℃～171℃，ESI-MSm/z:1259.85 [M+H]+,C79H70O15,MW=1258.47;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6) δ 7.74 (d,J=15.9 Hz,1H),7.40～7.20 (m,36H),7.09 (d,J=7.8 Hz,2H),6.67 (d,J=5.9 Hz,2H),6.61 (d,J=16.0 Hz,1H),6.31 (d,J=16.0 Hz,1H),5.85 (d,J=8.4 Hz,1H),5.11～4.89 (m,11H),4.49～4.34 (m,2H),4.31～4.20 (m,3H),2.31 (s,3H),2.21 (s,3H),1.23 (s,6H)。

化合物8a-3：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-[2′′,6′-2-O-(4-羥基基肉桂酰基)-3′′,4′′-O-異丙基半乳糖基]-4H-苯并吡喃酮

收率為64%,m.p.131℃～132℃，ESI-MSm/z:1443.35 [M+H]+,C91H78O17,MW=1442.52;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6) δ 7.74 (d,J=15.8 Hz,1H),7.45～7.08 (m,42H),7.01 (d,J=8.7 Hz,2H),6.95 (d,J=8.5 Hz,2H),6.69 (s,1H),6.63 (s,1H),6.51 (d,J=15.9 Hz,1H),6.24 (d,J=15.9 Hz,1H),5.85 (d,J=8.3 Hz,1H),5.11～4.86 (m,15H),4.52～4.34 (m,2H),4.34 (s,1H),4.27 (d,J=11.5 Hz,2H),1.23 (s,6H)。

化合物8a-4：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(3,4,5-三甲氧基肉桂?；?-3′,4′-O-異丙基半乳糖基]-4H-苯并吡喃酮

收率為56%,m.p.100℃～101℃，ESI-MSm/z:1411.71 [M+H]+,C83H78O21,MW=1410.51;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6) δ 7.66 (d,J=15.8 Hz,1H),7.43～7.11 (m,28H),7.03 (s,2H),6.82 (s,2H),6.69(d,J=15.9 Hz,1H),6.64 (s,1H),6.62 (s,1H),6.47 (d,J=15.9 Hz,1H),5.87 (d,J=8.3 Hz,1H),5.13～4.89 (m,11H),4.62～4.49 (m,1H),4.51～4.46 (m,1H),4.37 (s,1H),4.28 (d,J=11.4 Hz,2H),3.78 (s,6H),3.70 (s,6H),3.68 (s,3H),3.65 (d,J=8.3 Hz,3H),1.23 (s,6H)。

化合物8a-5：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(3,4,5-三羥基苯甲?；?-3′,4′-O-異丙基半乳糖基]-4H-苯并吡喃酮

收率為31%,m.p.78℃～80℃，ESI-MSm/z:1815.67 [M+H]+,C115H98O21,MW=1814.66;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6) δ 7.60 (s,2H),7.33～7.12 (m,57H),7.11 (s,2H),6.61 (s,1H),6.48 (s,1H),5.96 (d,J=8.6 Hz,1H),5.32 (t,J=8.0 Hz,1H),5.08～4.86 (m,17H),4.77～4.68 (m,5H),4.67～4.62 (m,1H),4.60 (s,1H),4.49 (d,J=8.5 Hz,2H),4.40 (s,1H),1.28 (s,6H)。

化合物8a-6：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(4-三氟甲基肉桂酰基)-3′,4′-O-異丙基半乳糖基]-4H-苯并吡喃酮

收率為57%,m.p.101℃～102℃，ESI-MSm/z:1367.33 [M+H]+,C79H64F6O15,MW=1366.41;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6) δ 7.65～7.42 (m,8H),7.41～7.11(m,25H),6.94 (d,J=8.7 Hz,2H),6.86 (d,J=8.7 Hz,2H),6.65 (d,J=6.8 Hz,2H),6.51 (d,J=15.9 Hz,1H),6.24 (d,J=15.9 Hz,1H),5.85 (d,J=8.5 Hz,1H),5.11～4.89 (m,11H),4.54～4.48 (m,2H),4.29～4,18 (m,3H),1.23 (s,6H)。

化合物8a-7：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-[2′′,6′-2-O-(4-氯肉桂?；?-3′′,4′′-O-異丙基半乳糖基]-4H-苯并吡喃酮

收率為46%,m.p.101℃～102℃，ESI-MSm/z:1301.29 [M+H]+,C77H64Cl2O15,MW=1300.24;1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ 7.46～7.24 (m,37H),6.69 (d,J=16.1 Hz,1H),6.65 (m,2H),6.42 (d,J=15.9 Hz,1H),5.85 (d,J=8.4 Hz,1H),5.11～4.86 (m,11H),4.59～4.55(m,1H),4.52 (s,1H),4.36 (s,1H),4.29 (d,J=10.5 Hz,2H),1.23 (s,6H)。

化合物8a-8：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-[2′′,6′-2-O-(4-溴肉桂?；?-3′′,4′′-O-異丙基半乳糖基]-4H-苯并吡喃酮

收率為57%，m.p.98℃～99℃，ESI-MSm/z:1387.85 [M+H]+,C77H64Br2O15,MW=1386.26;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6) δ 7.46～7.19 (m,37H),6.69 (d,J=16.1 Hz,1H),6.65～6.58 (m,2H),6.42 (d,J=15.9 Hz,1H),5.85 (d,J=8.4 Hz,1H),5.11～4.88 (m,11H),4.59～4.54 (m,1H),4.52 (s,1H),4.36 (s,1H),4.29 (d,J=10.5 Hz,2H),1.23 (s,6H)。

目標(biāo)化合物9a-1：2-(3,4,5-三羥基苯基)-5,7-二羥基-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(3?-(3-氟苯并?；?)]半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

將380 mg (0.3 mmol) 化合物8a-1、4 mL THF、2 mL CH3OH加入反應(yīng)瓶中，加入200 μL 4 mol/L鹽酸-二氧六環(huán)溶液，室溫?cái)嚢?，TLC檢測(cè)反應(yīng)至完全，加入幾滴三乙胺終止反應(yīng)后，過(guò)濾，濾液加入200～300目硅膠拌樣，柱層析分離純化(CH2Cl2：CH3OH=100:1)得186 mg固體產(chǎn)物，收率為51%；取123 mg(0.1 mmol)所得化合物、20 mg 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的鈀碳、5 mL THF及2.5 mL CH3OH投入反應(yīng)瓶中，室溫下常壓催化氫化過(guò)夜，LC-MS監(jiān)測(cè)反應(yīng)至完全，采用0.25 μm有機(jī)膜過(guò)濾除去Pd-C，少量甲醇洗滌后，回收溶劑采用半制備高效液相(甲醇：水=75%:25%)純化得65 mg目標(biāo)化合物9a-1，收率為73%。m.p.70～72℃,ESI-MSm/z: 781.19[M+H]+,C39H34F2O15,MW=780.19;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ 7.25 (s,2H),7.09 (ddJ=14.6,7.3 Hz,2H),6.96 (dd,J=7.7 Hz,2H),6.81～6.70 (m,4H),6.22 (s,1H),6.06(s,1H),5.42 (d,J=8.2 Hz,1H),5.30 (t,J=9.0 Hz,1H),4.25～4.22 (m,1H),4.08 (dd,J=11.5,4.2 Hz,1H),3.82(d,J=3.4 Hz,1H),3.75 (ddd,J=11.5,9.2,3.9 Hz,2H),2.92 (t,J=16.9 Hz,3H),2.78 (dt,J=15.3,7.6 Hz,1H),2.73～2.67 (m,1H),2.61 (td,J=7.5,3.1 Hz,2H),2.37 (t,J=7.8 Hz,2H);13C NMR (126 MHz,CD3OD) δ 179.4,174.8,174.4,166.2,165.6,163.7,163.4,158.7,158.5,146.8,145.3,145.1,138.5,135.8,131.6,131.5,131.4,125.8,125.6,122.3,116.7,116.5,116.3,114.4,114.2,110.4,106.2,102.3,100.2,95.0,75.0,74.4,73.2,71.0,64.9,37.0,36.9,32.0,31.8。

用此類方法可獲得目標(biāo)化合物9a-2～9a-5。

化合物9a-2：2-(3,4,5-三羥基苯基)-5,7-二羥基-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(3?-(4-甲基苯并?；?)]半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

收率為71%,m.p.70℃～72℃,ESI-MSm/z: 773.46[M+H]+,C41H40O15,MW=772.24;1H NMR (400 MHz,CD3OD) δ 7.26 (s,2H),7.05 (d,J=7.6 Hz,2H),6.95 (d,J=7.6 Hz,2H),6.88～6.86 (m,4H),6.25 (d,J=1.7 Hz,1H),6.13 (s,1H),5.43 (d,J=8.0 Hz,1H),5.31 (dd,J=9.6,8.3 Hz,1H),4.21 (dd,J=11.5,7.9 Hz,1H),4.10(dd,J=11.5,4.3 Hz,1H),3.81 (d,J=3.4 Hz,1H),3.75(dd,J=9.8,3.4 Hz,1H),3.66 (dd,J=7.9,4.3 Hz,1H),2.90 (dd,J=12.8,7.1 Hz,2H),2.75～2.73 (m,2H),2.61(t,2H),2.38 (t,2H),2.24 (s,3H),2.11 (s,3H)；13C NMR (126 MHz,CD3OD) δ 177.8,173.8,173.5,166.5,158.2,158.1,157.9,151.0,150.8,150.7,150.5,150.4,150.3,148.2,140.2,136.8,136.6,136.4,136.3,132.6,132.2,130.7,130.6,125.7,125.6,124.5,124.4,124.3,124.2,117.0,111.0,75.2,74.9,73.6,70.7,37.9,37.2,31.3,31.2,21.4,21.3。

化合物9a-3：2-(3,4,5-三羥基苯基)-5,7-二羥基-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(3?-(4-羥基苯并?；?)]半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

收率為78%,m.p.84℃～85℃,ESI-MSm/z: 777.20[M+H]+,C39H36O17,MW=776.20;1H NMR (400 MHz,CD3OD) δ 7.27 (s,2H),7.02 (d,J=8.4 Hz,2H),6.84 (d,J=8.5 Hz,2H),6.61 (dd,J=8.5,6.6 Hz,4H),6.29 (d,J=2.1 Hz,1H),6.15 (d,J=2.1 Hz,1H),5.44 (d,J=8.1 Hz,1H),5.32 (dd,J=9.8,8.0 Hz,1H),4.22 (dd,J=11.5,7.9 Hz,1H),4.08 (dd,J=11.5,4.4 Hz,1H),3.82～3.78 (m,1H),3.75 (dd,J=9.8,3.4 Hz,2H),3.68～3.66 (m,1H),2.86(t,3H),2.71～2.69 (m,2H),2.57 (td,J=7.5,2.6 Hz,2H),2.36 (s,2H);13C NMR (126 MHz,CD3OD) δ 177.6,174.1,173.9,167.1,164.2,159.3,158.7,151.3,150.9,148.7,140.7,139.7,139.3,137.1,137.0,136.9,136.8,130.7,130.7,129.9,125.1,125.0,124.8,124.6,122.7,111.5,106.5,103.2,100.9,95.7,75.6,75.4,74.1,71.2,65.5,32.1,32.0,22.2,22.1。

化合物9a-4：2-(3,4,5-三羥基苯基)-5,7-二羥基-3-β-D-[2′,6′-2-O-(3?-(3,4,5-三甲氧基苯并?；?)]半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

收率為78%,m.p.72℃～73℃,ESI-MSm/z: 925.64[M+H]+,C45H48O21,MW=924.27;1H NMR (400 MHz,CD3OD) δ 7.23 (s,2H),6.49 (s,2H),6.30 (s,2H),6.18 (d,J=1.8 Hz,4H),6.10 (d,J=1.7 Hz,1H),5.49 (d,J=8.1 Hz,1H),5.34 (m,1H),4.29～4.26 (m,1H),4.10 (dd,J=11.5,3.9 Hz,1H),3.85 (d,J=3.5 Hz,1H),3.79～3.76 (m,2H),3.74 (s,6H),3.72 (s,3H),3.69 (s,6H),3.54 (s,3H),2.94～2.92 (m,2H),2.78～2.76 (m,2H),2.56～2.53 (m,2H),2.39～2.36 (m,2H);13C NMR (126 MHz,CD3OD)δ 177.8,173.5,173.4,166.5,163.5,158.7,158.1,154.6,150.8,150.6,150.4,148.2,140.2,138.0,137.9,137.7,136.5,136.3,136.1,132.2,130.0,124.5,124.4,124.2,124.1,122.1,110.9,106.8,106.0,102.9,100.3,95.1,75.2,74.8,73.6,70.7,65.2,61.3,61.2,37.5,37.0,32.3,31.2,21.4,21.1。

化合物9a-5：2-(3,4,5-三羥基苯基)-5,7-二羥基-3-β-D-[2′,6′-2-O-(3,,4,5-三羥基苯甲?；?)]半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

收率為77%,m.p.78℃～79℃,ESI-MSm/z: 785.51[M+H]+,C35H28O21,MW=784.11;1H NMR (400 MHz,CD3OD) δ 7.25 (s,2H),7.15 (s,2H),6.95 (s,2H),6.29(d,J=2.1 Hz,4H),5.78 (d,J=8.0 Hz,1H),5.47 (dd,J=9.8,8.1 Hz,1H),4.42 (dd,J=11.1,6.8 Hz,1H),4.33(dd,J=11.1,6.3 Hz,1H),4.01 (d,J=3.1 Hz,1H),3.95 (t,J=6.6 Hz,1H),3.90 (dd,J=11.1,6.8 Hz,1H);13C NMR(126 MHz,CD3OD) δ 177.2,166.9,164.0,159.1,158.6,150.7,148.8,148.7,148.6,142.4,142.2,140.7,137.6 137.4,137.3,137.2,137.1,136.9,136.7,135.8,125.1,124.9,124.7,122.9,122.7,121.9,112.1,102.4,100.8,95.5,75.7,75.4,74.4,70.8,63.9。

目標(biāo)化合物10a-1：2-(3,4,5-三羥基苯基)-5,7-二羥基-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(3?-(3-氟肉桂?；?)]半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

將410 mg (0.3 mmol)化合物8a-6、4 mL四氫呋喃、2 mL甲醇加入反應(yīng)瓶中，加入200 μL 4 mol/L鹽酸-二氧六環(huán)溶液，室溫?cái)嚢?，TLC檢測(cè)反應(yīng)至完全，加入幾滴三乙胺終止反應(yīng)后，過(guò)濾，濾液加入200～300目硅膠拌樣，柱層析分離純化(CH2Cl2:CH3OH=100:1)得131 mg固體產(chǎn)物，收率為33%；取63 mg (0.05 mmol)所得化合物及5 mL二氯甲烷投入反應(yīng)瓶中，-78℃下用注射器滴加2 mL 1 mol/L BBr3的二氯甲烷溶液，反應(yīng)液中有固體析出，LC-MS監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，加入3 mL甲醇終止反應(yīng)，將反應(yīng)液倒入冰水中，過(guò)濾得淡黃色固體，采用半制備高效液相純化(甲醇:水=75%:25%)得17 mg化合物10a-1，收率為46%。m.p.146℃～147℃,ESI-MSm/z: 877.57[M+H]+,C41H30F6O15,MW=876.15;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ 7.80～7.68 (m,3H),7.68～7.46 (m,4H),7.58～7.46(m,2H),7.47 (d,J=16.0 Hz,1H),7.22 (s,2H),6.77(d,J=16.1 Hz,1H),6.39 (d,J=16.0 Hz,1H),6.15 (s,1H),6.04 (s,1H),5.48～5.36 (m,2H),4.53 (dd,J=11.4,8.5 Hz,1H),4.24～4.20 (m,1H),3.94 (s,1H),3.88～3.80(m,2H);13C NMR (126 MHz,CD3OD) δ 177.8,166.6,166.5,165.9,163.1,158.2,157.7,149.9,147.8,143.2,139.8,139.1,138.8,136.1,135.9,135.7,135.4,133.4,131.8,129.6,129.2,129.1,126.3,126.0,124.1,124.0,123.8,123.6,122.5,121.6,110.5,105.5,99.9,94.6,75.1,73.4,70.5,65.9,64.9,31.2,31.1。用此類方法可獲得目標(biāo)化合物10a-2～10a-3。

化合物10a-2：2-(3,4,5-三羥基苯基)-5,7-二羥基-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(3?-(3-氯肉桂?；?)]半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

收率為49%,m.p.177℃～178℃,ESI-MSm/z:831.09 [M+Na]+,C39H30Cl2O15,MW=808.10;1H NMR(400 MHz,CD3OD) δ 7.73 (d,J=16.0 Hz,1H),7.59 (d,J=8.5 Hz,2H),7.39～7.26 (m,7H),7.22 (s,2H),6.64(d,J=16.0 Hz,1H),6.26 (d,J=16.0 Hz,1H),6.16 (d,J=1.9 Hz,1H),6.05 (d,J=1.9 Hz,1H),5.52 (d,J=8.0 Hz,1H),5.44～5.42 (m,1H),4.50 (dd,J=11.5,8.4 Hz,1H),4.23 (dd,J=11.6,4.0 Hz,1H),3.94 (d,J=3.2 Hz,1H),3.86～3.82 (m,2H);13C NMR (126 MHz,CD3OD)δ 178.7,166.9,166.7,165.9 163.1,158.1,157.7,149.9,149.8,147.8,143.8,143.7,139.8,136.1,135.9,135.7,135.3,134.1,133.9,130.3,130.2,129.7,129.6,124.2,124.1,123.9,123.7,121.6,120.4,119.6 110.5,105.5,99.9,94.6,75.1,74.9,73.4,70.5,64.8。

化合物10a-3：2-(3,4,5-三羥基苯基)-5,7-二羥基-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(3?-(3-溴肉桂酰基))]半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

收率為72%,m.p.172℃～173℃,ESI-MSm/z:919.99 [M+Na]+,C39H30Br2O15,MW=896.00;1H NMR(400 MHz,CD3OD) δ 7.73 (d,J=16.0 Hz,1H),7.60 (d,J=8.5 Hz,2H),7.39～7.26 (m,7H),7.22 (s,2H),6.64(d,J=16.0 Hz,1H),6.28 (d,J=16.0 Hz,1H),6.16 (d,J=1.9 Hz,1H),6.05 (d,J=1.9 Hz,1H),5.52 (d,J=8.0 Hz,1H),5.44～5.40 (m,1H),4.50 (dd,J=11.5,8.4 Hz,1H),4.23 (dd,J=11.6,4.0 Hz,1H),3.94 (d,J=3.1 Hz,1H),3.86～3.76 (m,2H);13C NMR (126 MHz,CD3OD)δ 177.7,166.8,166.4,164.2,161.5,156.6,149.9,149.8,145.1,143.9,143.4,136.7,135.8,135.5,135.2,134.1,133.8,133.6,133.2,131.8,131.7,130.3,130.2,129.6,129.4,124.1,120.4,118.5,117.7,108.5,104.3,100.9,98.4,93.2,73.5,72.9,71.7,69.4,63.1。

2.2 抗菌活性測(cè)試

采用微量肉湯稀釋法測(cè)定14個(gè)化合物最小抑菌濃度(MIC)，詳細(xì)參考美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作規(guī)程[17]。用MH肉湯配置化合物2倍工作濃度的母液，母液中化合物的濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/mL。吸取100 μL的化合物母液加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中的第1至第12孔內(nèi)，然后各孔加入100 μL含有受試菌液的MH肉湯，每孔總液量為200 μL。孔內(nèi)藥物終濃度依次分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.06 μg/mL，菌液終濃度均為105CFU/mL。實(shí)驗(yàn)對(duì)照藥物為左氧氟沙星，陽(yáng)性對(duì)照組：孔內(nèi)含有左氧氟沙星與菌液。菌對(duì)照組：孔內(nèi)僅接種菌液，不含藥物。細(xì)菌培養(yǎng)在37℃孵育18～20 h后觀測(cè)結(jié)果，肉眼觀察或酶標(biāo)儀測(cè)定A600值，以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為其最低抑菌濃度(MIC)。實(shí)驗(yàn)中所用菌株為耐萬(wàn)古霉素腸球菌ATCC51299、萬(wàn)古霉素敏感腸球菌ATCC29212、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC43330、甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌ATCC29213、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、甲氧西林敏感性表皮葡萄球菌。

3 結(jié)果與討論

3.1 化合物合成

在楊梅苷的芐基保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)K2CO3作為堿時(shí)，楊梅苷5-羥基無(wú)法發(fā)生芐基化反應(yīng)?？赡茉蚴?位羥基與4位羰基形成分子內(nèi)氫鍵造成5位羥基難以被芐基化。通過(guò)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選用Cs2CO3時(shí)，楊梅苷能夠以較好的產(chǎn)率實(shí)現(xiàn)完全芐基化。在脫除楊梅苷3位鼠李糖時(shí)，通過(guò)優(yōu)化在不同的醇溶液的反應(yīng)條件發(fā)現(xiàn)，與常用的甲醇、乙醇相比，采用異丙醇作為溶劑時(shí)，反應(yīng)更高效，反應(yīng)時(shí)間短，產(chǎn)率高。

由于糖供體α-溴代-2,3,4,6-四乙?；肴樘擒辗磻?yīng)活性高，但是不穩(wěn)定容易降解，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們采用現(xiàn)制現(xiàn)用的方法來(lái)降低糖基給體對(duì)糖苷化反應(yīng)的影響。另外，由于糖基化的產(chǎn)物與3-羥基五芐基楊梅苷原料難于在TLC分離開(kāi)來(lái)，為了更加高效準(zhǔn)確地判斷糖苷化反應(yīng)終點(diǎn)，本反應(yīng)采用LC-MS 跟蹤反應(yīng)。另外，由于糖苷化反應(yīng)過(guò)程中，未反應(yīng)完全的3-羥基五芐基楊梅素難于與糖苷化產(chǎn)物分離開(kāi)來(lái)，我們將糖苷化反應(yīng)產(chǎn)物直接堿性條件下脫乙?；?，暴露出糖環(huán)的羥基后再分離純化，更加易于剔除糖苷化反應(yīng)未反應(yīng)完全的原料，同時(shí)減少了分離步驟，便于操作，易于純化。

3.2 化合物抗菌活性

根據(jù)CLSI指導(dǎo)原則的微量稀釋法，對(duì)新合成的14個(gè)化合物進(jìn)行了抗菌活性測(cè)試，測(cè)試結(jié)果如表2所示。通過(guò)對(duì)抗菌活性MIC數(shù)據(jù)可以看出，14個(gè)化合物對(duì)于糞腸球菌的MIC大于128 μg/mL，無(wú)論是敏感還是耐藥菌株都無(wú)抗菌活性?；衔?a-1～9a-4和10a-1～10a-3對(duì)金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌顯示出較好的抗菌活性，MIC值范圍為32～1 μg/mL。其中半乳糖苷類楊梅素衍生物9a-1對(duì)耐甲氧西林葡萄球菌ATCC43300的最小抑菌濃度達(dá)到1 μg/mL。當(dāng)用苯甲酸?；揎棸肴樘?,4-位羥基時(shí)，化合物9a-5的抗菌活性完全消失。新型糖苷類楊梅素衍生物對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌的抗菌活性要稍強(qiáng)于敏感菌株，該現(xiàn)象在10a-1～10a-3中較為明顯，但是10a-1～10a-3抗菌活性整體都弱于衍生物9a-1～9a-4。另外，3位羥基?；苌镏校瑑H有11a-1顯示出一定的抗菌活性，其他化合物抗菌活性無(wú)顯著改善?；衔?1a-1～11a-6對(duì)這金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抗菌活性弱于上述糖苷類衍生物，進(jìn)一步提示半乳糖苷元修飾3位羥基的重要性。通過(guò)以上研究結(jié)果證明，3位羥基是個(gè)重要活性修飾位點(diǎn)，可能對(duì)衍生物的抗菌活性起著重要作用。

表2 衍生物9a-1～9a-5、10a-1～10a-3、11a-1～11a-6和對(duì)照藥物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC值Tab.2 The MIC values of derivatives 9a-1～9a-5,10a-1～10a-3,11a-1～11a-6 and control drug against bacterial strains

4 結(jié)論

本研究以楊梅苷作為原料設(shè)計(jì)了新的合成路線，并對(duì)合成中的關(guān)鍵反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，構(gòu)建了一條高效快捷的楊梅素衍生物的制備方法。以天然楊梅素作為母核，合成了14個(gè)楊梅素類衍生物，利用核磁和ESI-MS對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。通過(guò)微量肉湯稀釋法，對(duì)化合物進(jìn)行了抗菌活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)8個(gè)抗菌活性顯著提高的活性化合物。化合物9a-1～9a-4的對(duì)革蘭陽(yáng)性菌抗菌菌活性較好，其中9a-1半乳糖苷類楊梅素衍生物對(duì)耐甲氧西林葡萄球菌ATCC43300的最小抑菌濃度達(dá)到1 μg/mL?；衔锏某醪交钚匝芯拷Y(jié)果顯示，黃酮醇3位羥基半乳糖修飾可以顯著提高楊梅素的抗菌活性，為進(jìn)一步開(kāi)展具有抗菌作用的楊梅素衍生物的研究提供了新的線索。